全 文 ：天 津 中 医 药
Tianjin Journal of Traditional Chinese Medicine
2015年 3月第 32卷第 3期
Mar． 2015,Vol．32 No．3
蕨麻正丁醇部位下调缺氧内皮细胞HIF-1α
及ET-1表达*
杨 硕 1,2，张 岭 2，龚海英 2，张永亮 3，李灵芝 2，3，高宏生 3
（1.天津医科大学，天津 300070；2.武警后勤学院药物化学教研室，天津 300309；3.天津市职业与环境
危害防制重点实验室，天津 300309）
摘要：[目的]探讨蕨麻正丁醇部位对内皮细胞缺氧损伤的保护机制。[方法]采用人脐静脉内皮细胞（EA.hy926）建
立缺氧损伤实验模型，实验设常氧对照组、缺氧模型组、高（3.00 g/L）、中（1.50 g/L）、低浓度（0.75 g/L）蕨麻正丁醇部位
组，复方丹参（3.0 g/L）组。胎盘兰染色法测定各组细胞存活率；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测各组缺氧诱
导因子-1α（HIF-1α）mRNA和内皮素-1（ET-1）mRNA表达，免疫细胞化学染色及 Western Blot方法检测 HIF-1α蛋
白表达。放免法测定培养基中 ET-1的活性。[结果]与对照组比较，缺氧模型组细胞存活率显著降低，HIF-1α和 ET-1
mRNA及蛋白表达增加（P<0.01）；蕨麻正丁醇部位各剂量组与缺氧模型组比较，细胞存活率显著升高，高、中、低剂量
蕨麻正丁醇部位组、复方丹参组细胞 HIF-1α和 ET-1 mRNA及蛋白水平显著降低（P<0.01）。[结论]在缺氧状态下，蕨
麻正丁醇部位可能通过 HIF-1α途径调控靶基因的表达，从而发挥保护作用。
关键词：蕨麻；内皮细胞；缺氧；缺氧诱导因子-1α；内皮素-1
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1672-1519（2015）03-0168-0
*基金项目：国家自然科学基金项目（81073152）；天津市重点基
金项目（12JCZDJC34700）；中国博士后基金项目（20100470106）。
作者简介：杨 硕（1986-），男，2011级硕士研究生，主要从
事抗缺氧药物研究。
通讯作者：李灵芝，E-mail：13682196000@163.com；张永亮，
E-mail:zhang78127@tom.com。
·中药研究·
血管内皮细胞既是感应细胞，又是效应细胞，它
能感知血液中的炎性信号、激素水平、压力变化等
信息，并能通过分泌血管活性物质作出应对。内皮
细胞的损伤及功能紊乱与高血压、冠心病、慢性肾
功能衰竭等多种疾病密切相关。因此，如何保护和
修复内皮细胞功能对改善血管疾病具有积极意义。
藏药蕨麻具有显著的抗缺氧 [1]、抗氧化[1-2]及抗
疲劳作用[3]。课题组前期研究证实蕨麻正丁醇部位
是其抗缺氧主要活性部位，可通过抗氧化、抑制钙
超载、抗凋亡等途径，对心肌细胞缺氧损伤[4-5]、神经
细胞缺氧损伤[6-7]、小鼠急性心肌缺血损伤[8-9]等发挥
保护作用，研究还显示蕨麻正丁醇部位内皮细胞缺
氧损伤也具有显著的保护作用 [10-11]，但对其抗内皮
细胞缺氧的机制尚未进行深入研究。本实验进一步采
用 EA.hy926内皮细胞缺氧模型，研究了蕨麻正丁醇
部位对缺氧内皮细胞缺氧诱导因子-1（HIF-1）α亚型
及其靶基因内皮素-1（ET-1）mRNA及蛋白表达的影
响，探讨其对内皮细胞缺氧损伤的保护机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 药品与试剂 蕨麻用 75%乙醇提取浓缩得
浸膏，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，
正丁醇萃取液减压浓缩并冷冻干燥后得正丁醇部
位（每克相当于蕨麻生药 59 g）。阳性对照药取复方
丹参滴丸按照《中国药典》（2005版）方法制备。高糖
DMEM培养基（Gibco），无糖 DMEM培养基（Sigma）,
青霉素、链霉素（Amresco），胰蛋白酶(Difco)，噻唑兰
（北京鼎国生物技术开发中心）。ET-1试剂盒（北京
普尔伟业生物科技有限公司），ET-1引物由上海生
工生物技术有限公司合成，浓缩型 HIF-1α多克隆抗
体（Santa Cruz）；HIF-1α及 β-actin引物由Invitrogen
公司合成。
1.1.2 实验设备 二氧化碳（CO2）培养箱（forma3111，
美国），酶标仪（680 BIORAD，美国），倒置相差显微
镜（Olympus CK-40，日本），显微镜（Olympus CH-2）、
PCR仪（PT-0200，美国）、核酸定量仪（德国）、凝胶
成像分析系统（GelPro 4．5，美国）、电泳仪（Bio－Rad，
美国）、电转膜仪（Bio－Rad，美国）。
1.2 方法
1.2.1 分组及内皮细胞缺氧损伤模型建立 将 EA.
hy926内皮细胞随机分为常氧对照组（C组）；缺氧
损伤模型组（M 组）；蕨麻正丁醇部位高剂量组（H
DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.03.10
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组，3 g/L）、中剂量组（I组，1.5 g/L）、低剂量组（L组，
0.75 g/L）；复方丹参组（P组，3 g/L）。正丁醇部位及
复方丹参滴丸均以少量二甲基亚砜（DMSO）（控制
培养基中 DMSO终浓度低于 0.25%）溶解后加无糖
DMEM培养基稀释至所需浓度，C组和 M组均加含
有等浓度 DMSO的无糖 DMEM培养基。除 C组外，
其他各组均于 37 ℃下在无糖 DMEM培养基中 95%
氮气（N2）+5%CO2[氧气（O2）浓度<1%]环境下培养
2 h，C 组于 5% CO2条件下 37 ℃同步培养于无糖
DMEM培养基中。每组 8个复孔，重复 2次。
1.2.2 台盼蓝染色观察细胞存活率 各实验组细
胞加入 1 mL 0.04%的台盼蓝溶液，光镜下计数拒染
细胞，按下式计算细胞存活率并进行统计学分析。
细胞存活率 =据染细胞数/细胞总数 × 100 %
1.2.3 RT-PCR法检测细胞 HIF-1α mRNA和 ET-1
mRNA水平 引物设计：根据 Genbank中大鼠 HIF-
1α、ET-1基因序列设计引物。
HIF-1α上游：5′-TCAAAGTCGGACAGCCTCA-
3′，下游：5′- CCCTGCAGTAG GTTTCTGCT -3′，扩
增产物长度为 458 bp。
ET-1 上游：5′-TTCTCTCTGCTGTTTGTGG-3′，
下游：5′-CAATGTGCTCGGTT GTG -3′，扩增产物长
度为 614 bp。
β-actin 上游：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA
-3′，下游：5′- CTTCCTTAATGT CACGCACGATTTC
-3′，扩增产物长度为 547 bp。
RT-PCR反应：用 Trizol试剂提取总RNA，取 1μL
总 RNA，按逆转录试剂盒说明合成 cDNA第 1条
链，取 5 μL逆转录产物进行 PCR。
HIF-1α反应条件：94℃预变性 2 min，94℃ 30 s、
62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循环 30次，72 ℃延伸 5 min。
ET-1反应条件：94 ℃预变性 2 min，94 ℃ 45 s、
62 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，循环 28次，72 ℃延伸 5 min。
PCR反应产物检测：用凝胶成像分析系统测出
各扩增条带的光密度值（A），以同一样品 HIF-1α或
ET-1扩增带的光密度（Af）与 β-actin 扩增带的光
密度（Ab）比值进行统计分析，得到其 RT-PCR产物
的相对含量。
1.2.4 免疫细胞化学法检测内皮细胞 HIF-1α蛋白
内皮细胞以丙酮固定，3%双氧水（H2O2）阻断内源性
过氧化物酶，血清封闭，加 1∶200稀释的 HIF-1α一
抗 4 ℃过夜，加生物素化二抗 37 ℃ 15 min，加 SP复
合物，37 ℃ 30 min，二氨基联苯胺（DAB）显色。阳性
反应为胞核或胞浆染成棕黄色。阴性对照以磷酸盐缓
冲溶液（PBS）代替一抗，其余步骤相同。
1.2.5 Western blot 方法检测内皮细胞 HIF-1α 蛋
白 提取总蛋白，考马斯亮蓝法定量蛋白质，进行
SDS-PAGE 凝胶电泳后转印至 PVDF 膜，5% BSA
室温封阻 1 h；加入一抗（1∶1 000）4℃过夜，二抗 37℃
1 h，SP 复合物室温 1 h，DAB 显色。以同一样品
HIF-1α条带的光密度与 β-actin 的光密度比值为
相对蛋白含量。
1.2.6 放免法检测 ET-1活性 实验操作按试剂盒
进行。
1.2.7 统计学处理 所有数据用 SPSS 18.0软件处
理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采
用单因素方差分析，组间两两比较时，若方差采用
LSD法，若方差不齐则采用 Dunnett’s T3法，P<0.05
表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 台盼蓝染色结果 常氧对照组细胞未被台盼
蓝染色；缺氧模型组可见大片蓝染细胞，细胞连接
断开并成片状脱壁；H组坏死细胞明显减少，仅见散
在蓝染细胞，未见细胞脱壁现象；I组蓝染细胞散
在，与模型组相比，数量明显减少，但蓝染细胞数量
比 H 组稍有增高；L 组蓝染细胞数量比模型组减
少；复方丹参组可见散在蓝染细胞，数量与 I组差异
无统计学意义。见表 1。
2.2 RT-PCR 检测结果 常氧对照组细胞未见
HIF-1α表达，与常氧对照组相比，缺氧模型组细胞
HIF-1α mRNA表达水平显著升高（P<0.01）。H、I、L
组及复方丹参组细胞 HIF-1α mRNA水平与缺氧模
型组比较均显著降低（P<0.01）。见图 1。
表 1 蕨麻正丁醇部位对缺氧损伤内皮细胞存活率的
影响（x±s）
Tab.1 The effect of N-butanol extract of Potentilla anserina
L.on survival of endothelial cells exposed tohypoxia（x±s）
组别 细胞存活率（%）
常氧对照组 99.0±0.7
缺氧模型组 71.0±1.0*
复方丹参滴丸组 82.0±9.6#△▲
蕨麻正丁醇部位 H组 88.0±1.6#△▲
蕨麻正丁醇部位 I组 81.0±1.7#▲
蕨麻正丁醇部位 M组 75.0±0.9#△
剂量（g/L）
-
-
3.00
3.00
1.50
0.75
n
6
6
6
6
6
6
注：与常氧对照组比较，*P<0.01；与缺氧模型组比较，#P<0.01；
与蕨麻正丁醇部位I组比较，△P<0.01；与蕨麻正丁醇部位M组比
较，▲P<0.01。
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缺氧模型组 ET-1mRNA表达水平较常氧对照组
显著升高（P<0.01）。H、I组及复方丹参组细胞 ET-1
mRNA表达水平均较缺氧模型组降低（P<0.01），L
组无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
2.3 免疫细胞化学检测结果 对照组胞浆偶见
HIF-1α蛋白免疫反应阳性物质，为棕黄色颗粒。缺
氧模型组较对照组细胞 HIF-1α蛋白水平升高，胞
浆免疫反应阳性物质增多，胞核也出现表达。与缺
氧模型组比较，H、I及复方丹参组细胞 HIF-1α 蛋
白免疫反应阳性物质减少，且大部分在胞浆表达。
见图 3。
2.4 Western blot检测结果 常氧对照组细胞未检
测到 HIF-1α蛋白，缺氧模型组 HIF-1α水平较常
氧对照组升高（P<0.01）。与缺氧模型组比较，H、I、L
组 HIF-1α水平降低（P<0.01）。见图 4。
C为常氧对照组，M为缺氧模型组，H、I、L分别为蕨麻正丁醇部位
3、1.5、0.75g/L组，P为复方丹参滴丸3g/L组。与C组比较，
##P<0.01，与M组比较，**P<0.01。
图 1 各组内皮细胞 HIF-1α mRNA表达水平
Fig.1 The expression of HIF-1α mRNA in endothelial cells
of each group
H
IF
-1
α/
β-
ac
tin
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
C M H I L P
##
** **
**
**
ET
-1
/β
-a
ct
in
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
C M H I L P
##
** **
**
C为常氧对照组，M为缺氧模型组，H、I、L分别为蕨麻正丁醇部位
3、1.5、0.75g/L组，P为复方丹参滴丸3g/L组。与C组比较，
##P<0.01，与M组比较，**P<0.01。
图 2 各组内皮细胞 ET-1mRNA表达水平
Fig.2 The expression of ET-1 mRNA in endothelial cells of
each group
图 3 各组内皮细胞HIF-1α蛋白水平（×200）
Fig.3 The level of HIF-1α protein in endothelial cells
of each group
常氧对照组
缺氧模型组
蕨麻正丁醇部位（3 g/L）组
C M H I L P
C M H I L P
HIF-1α
H
IF
-1
α/
β-
ac
tin
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
##
** ** **
**
C为常氧对照组，M为缺氧模型组，H、I、L分别为蕨麻正丁醇部位
3、1.5、0.75g/L组，P为复方丹参滴丸3g/L组。与C组比较，
##P<0.01；与M组比较，**P<0.01。
图 4 各组内皮细胞HIF-1α蛋白表达水平
Fig.4 The level of HIF-1α protein in endothelial cells
of each group
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2.5 放免法测定结果 与常氧对照组比较，缺氧损
伤模型组细胞 ET-1水平升高（P<0.01）；而蕨麻正
丁醇部位各剂量组、复方丹参组与缺氧模型组相比
ET-1水平均降低（P<0.01）。见图 5。
3 讨论
细胞缺氧合并培养介质缺糖是目前公认的造
成体外缺血缺氧的模型。本实验室以无糖 DMEM培
养基结合 95%N2+5%CO2的缺氧缺糖环境模拟体内
内皮细胞缺血缺氧，台盼蓝染色结果显示，缺氧 2 h
细胞大量被蓝染，细胞存活率降低 28%，表明已经
有效地造成了细胞的缺氧损伤。蕨麻正丁醇部位干
预后，可显著减少蓝染细胞数，提高缺氧状态下细
胞存活率，表明蕨麻正丁醇部位对内皮细胞缺氧损
伤具有保护作用。复方丹参滴丸是临床广泛用于治
疗心血管疾病的药物[12]，在本模型中也能够显著提
高缺氧内皮细胞的存活率。
缺氧可激活多种转录因子，从而介导缺氧相关
基因表达变化，是诸多疾病的病理生理过程。HIF-1
广泛表达于哺乳动物的各种组织细胞，是介导哺乳
动物细胞低氧反应的核转录因子，能够促进组织细
胞对低氧的适应性。HIF-1是由 α和 β亚基组成的
异二聚体，其中 HIF-1α受缺氧调控并调节 HIF-1
的活性，β 亚基则属结构型表达 [13]。常氧条件下，
HIF-1α可被脯氨酰-4-羟化酶羟基化，随即被泛
素-蛋白酶体通路迅速降解，故常氧时，人、小鼠、大
鼠体内许多组织中均可检测到HIF-1αmRNA、HIF-1 β
mRNA 和 HIF-1β蛋白，但一般检测不到 HIF-1α
蛋白[14]。在缺氧等条件下 HIF-1α和 HIF-1β均能通
过核转位由胞质进入胞核，形成稳定的异二聚体,
活化的 HIF-1在其靶基因的转录起始部位形成一
个转录起始复合物，从而启动对靶基因的转录[15]。本
研究在常氧对照组检测到了 HIF-1α mRNA，但仅
在胞浆检测到极微量 HIF-1α蛋白，与文献报道相
吻合。但缺氧模型组 HIF-1αmRNA水平升高，且在
胞浆和胞核均检测到了 HIF-1α蛋白，表明缺氧促
进了 HIF-1α 基因的表达和核转位，同时抑制了
HIF-1α蛋白的降解，导致蛋白积聚并发挥调控作
用。不同浓度的蕨麻正丁醇部位干预后，HIF-1
αmRNA表达水平较模型组明显降低，HIF-1α蛋白
表达水平也降低，提示蕨麻正丁醇部位对内皮细
胞缺氧损伤的保护作用与其对 HIF-1α表达的调控
有关。
ET－1主要由血管内皮细胞分泌，在血管内皮细
胞损伤时可大量分泌，因此 ET-1是目前测定血管内
皮细胞损伤的重要手段之一。ET-1是 HIF-1下游
基因，其表达可由HIF-1直接激活[16-17]。文献报道丹参
酮ⅡA可在肿瘤坏死因子诱导的人脐静脉内皮细胞
EVC304损伤模型中降低 ET-1水平[18]，本研究结果
显示：缺氧损伤模型组 ET-1水平显著升高，而复方
丹参组和蕨麻正丁醇部位干预组 ET-1水平则显著
下调，与 HIF-1α的变化一致，提示蕨麻正丁醇部位
可能通过 HIF-1α途径调节靶基因的表达，从而在
缺氧时对内皮细胞发挥保护作用。
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ET
-1
的
活
性
（
pg
/m
L）
200
150
100
50
0
C M H I L P
##
** ** **
**
C为常氧对照组，M为缺氧模型组，H、I、L分别为蕨麻正丁醇部位
3、1.5、0.75g/L组，P为复方丹参滴丸3g/L组。与C组比较，
##P<0.01；与M组比较，**P<0.01。
图 5 各组内皮细胞 ET-1活性
Fig.5 The activity of ET-1 in endothelial cells of each group
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Study of N-butanol extract of Potentilla anserina L. in down-regulating expression
levels of HIF-1α and ET-1 in hypoxia endothelial cells
YANG Shuo1, 2, ZHANG Ling2, GONG Hai-ying2, ZHANG Yong-liang 3, LI Ling-zhi2, 3 , GAO Hong-sheng3
（1. Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2. Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300309,
China; 3. Tianjin Key Laboratory for Prevention and Control of Occupational and Environmental Hazards，
Tianjin 300309, China）
Abstract: [Objective] To study the protective effect of n-butanol extract of Potentilla anserine L. on EA.hy926 endothelial cells exposed
to hypoxia. [Methods] The model of hypoxia injury was established with human umbilical vein endothelial cell line (EA.hy926). The cell
death was determined by Trypan blue staining assay. The expression levels of HIF-1α and ET-1 mRNA were detected by reverse tran-
scription-PCR assay. The Western blot and imuunocytochemistry were used for determining HIF-1α protein. The ET-1 protein was de-
tected with radioimmunoassay. [Results] Compared with control group, the survival rate of cell was significantly increased after pretreated
with 3, 1.5 and 0.75 g/L of n-butanol extract of Potentilla anserine L. Meanwhile, the mRNAs of HIF-1 and ET-1 and their protein prod-
ucts were significantly decreased. [Conclusion] Potentilla anserina L. could exert its protective effect on endothelial cells during hypoxia
injury by modulating expression of target genes through HIF-1α pathway.
Key words：Potentilla anserina L.; endothelial cell; hypoxia; hypoxia inducible factor-1; endothelin-1
extract of Potentilla anserine L. and its protective effect of EAhy926
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（本文编辑：高 杉，马晓辉）
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