全 文 ：第 29卷第 10期 通 化 师 范 学 院 学 报 Vol.29 № 10
2008年 10月 JOURNALOFTONGHUATEACHERSCOLLEGE Oct.2008
基于均匀设计法优化渥丹鳞茎发生及高效快繁体系
朱星樽 ,滕孝花 ,顾地周
(通化师范学院 生物系 ,吉林 通化 134002)
摘　要:以渥丹花梗为外植体 ,应用均匀设计法对各步骤各主要因子和水平的作用进行了实验探讨.结果表明 ,最适宜鳞茎原
基诱导的培养基为:N6 +IAA0.05mg· L-1 +NAA0.01mg· L-1 +KT0.50mg· L-1 ,诱导率为 95.0%.鳞茎原基分化为完整植株的
最佳培养基为:N6 +IAA0.01mg· L-1 +NAA0.001mg· L-1 ,萌发率为 92.0%.以鳞茎原基的切片为材料进行鳞茎原基快繁的结
果表明 ,在 35d的一个培养周期内 ,增殖倍数达 40以上.
关键词:渥丹;均匀设计;快繁
中图分类号:Q94　文献标志码:A　文章编号:1008-7974(2008)10-0042-03
基金项目:吉林省科技厅项目(长白山杜鹃花属植物种质资源保护研究.项目编号:200705c05).
收稿日期:2008-07-10
作者简介:顾地周(1962-),吉林通化人 ,通化师范学院生物系讲师.
　　渥丹(LiliumconcolorSalisb.),为百合科百合属
多年生草本植物.长白山区野生珍稀濒危药用植
物 [ 1] ,鳞茎入药 ,具有养阴润肺 、清血安神等功效 ,主
治结核久咳 、虚烦惊悸 、神经衰弱等症.其花梗直立 ,
花红色或橙黄色 ,色泽艳丽 ,十分美观 ,可驯化为园
艺植物 ,用于花坛 、化境等的绿化.又是上好的蜜源
植物.另外 ,也可开发为鲜切花.还可作为百合属育
种的种质资源.渥丹在长白山区数量十分稀少 ,分布
区域十分狭窄 ,在部分地区仅呈零星分布 ,开发及利
用受到限制.因其种子不易获得 ,其常规繁殖主要靠
分蘖方式 ,繁殖系数小.以渥丹花梗为外植体 ,培养
形成鳞茎原基 ,然后分化进而发育为完整植株.不仅
繁殖系数高 ,而且可用于人工种子的制作 ,大大提高
种苗生产效率 ,并可用于遗传转化 ,直接通过鳞茎发
生途径获得抗逆性强的转基因百合植株.目前 ,国内
外关于植物鳞茎发生研究的报道较多 [ 2 -3] ,作者在
前人报道的基础上 ,研究了渥丹鳞茎发生体系 ,以期
明确高效 、稳定的鳞茎诱导及分化发育条件 ,为提高
种苗生产率和制作百合属人工种子奠定基础.
1 材料与方法
1.1 外植体材料及其处理
6月于吉林省通化市白鸡腰国家级自然保护区
采渥丹幼花梗 ,在超净工作台上用 70%酒精涮洗
30s,用 0.5%的次氯酸钠溶液浸泡 6min,无菌水冲
洗 8次.用无菌滤纸吸干表面水分 ,切除被杀菌消毒
剂损伤部分后作为外植体备用.
1.2 渥丹幼花梗直接诱导鳞茎原基培养基的筛选
以 N6为基本培养基 ,附加蔗糖 50g· L-1 ,琼脂
粉 8.5g·L-1 , pH5.9 ,温度(25±2)℃,暗培养.将经
过处理的外植体接种到附加不同浓度的 IAA、IBA、
NAA和 KT的 N6培养基上进行培养.筛选最适宜的
鳞茎原基诱导培养基.
1.3 鳞茎原基的高效增殖体系建立
以渥丹花梗诱导产生的鳞茎原基为材料 ,将整
个鳞茎原基切割成薄片 ,再转接到优化后的鳞茎原
基诱导培养基中 ,进行鳞茎原基增殖培养.统计并计
算出增殖周期和倍数.
1.4 渥丹鳞茎原基分化为完整植株的培养基筛选
待鳞茎原基增殖到一定数量后 ,将鳞茎原基逐
个剥离下来转接到附加不同浓度的 IAA和 NAA的
N6为基本培养基 ,附加蔗糖 20g· L-1 ,琼脂粉 8.5g·
L-1 , pH5.9,温度(25±2)℃,光照强度 1200lx,光照
周期 12h· d-1.筛选最适宜的鳞茎原基分化为完整
植株的培养基.
1.5 结果观察
采用数码相机对外植体各阶段的形态变化进行
拍摄.同时 ,对不同阶段的培养物进行扫描电镜观察
和拍摄.
1.6 数据分析
数据分析与处理采用均匀设计(UniformDesign)
软件.回归分析均采用全回归(后退法).
2 结果与分析
2.1 N6培养基中不同植物生长调节物质的浓度交
叉配比对渥丹花梗直接诱导鳞茎原基的影响
·42·
DOI :10.13877/j.cnki.cn22-1284.2008.10.010
以 N6为基本培养基 , 附加不同浓度的 IAA、
IBA、NAA和 KT(由预试验可知浓度范围分别为
IAA0.05 ～ 0.10mg· L-1 , IBA0.03 ～ 0.07mg· L-1 ,
NAA0.01 ～ 0.05mg· L-1和 KT0.10 ～ 0.50mg·
L-1 ,低于控制范围的植物生长调节物质不能促使花
梗诱导出鳞茎原基;过高的植物生长调节物质导致
鳞片脱分化为愈伤组织而不能直接诱导出鳞茎原
基 ,确保遗传的稳定性不采取愈伤组织再生芽苗的
快繁方式.为了提高渥丹鳞茎原基诱导的速度和诱
导率 ,采用均匀设计法 [ 4] ,每个处理接种外植体数为
30 ,选用 U10 (108)均匀表 (见表 1), 同时考察了
IAA、IBA、NAA和 KT浓度交叉配比对渥丹花梗诱
导鳞茎原基的影响(在表和方程中 , X1为 IAA浓度 ,
X2为 IBA浓度 , X3为 NAA浓度 , X4为 KT浓度 , Y为
渥丹鳞茎原基的诱导率 ,结果见表 2).
表 1　U10(104)因素及水平设计
水平
Levels
因素 Factors/mg· L-1
X1 X2 X3 X4
1 0.05 0.03 0.01 0.10
2 0.06 0.04 0.02 0.20
3 0.07 0.05 0.03 0.30
4 0.08 0.06 0.04 0.40
5 0.09 0.07 0.05 0.50
6 0.10 0.03 0.05 0.10
7 0.08 0.04 0.04 0.20
8 0.07 0.05 0.03 0.30
9 0.06 0.06 0.02 0.40
10 0.05 0.07 0.01 0.50
表 2　U10(104)均匀设计实验安排及结果
处理号Treatmentcode
因素 Factors/mg· L-1
X1 X2 X3 X4 Y
1 /%
1 0.05 0.05 0.04 0.50 91.0
2 0.06 0.03 0.03 0.50 89.0
3 0.07 0.06 0.01 0.40 85.0
4 0.08 0.03 0.05 0.40 76.5
5 0.09 0.06 0.02 0.30 74.0
6 0.10 0.04 0.02 0.30 70.5
7 0.08 0.07 0.05 0.20 72.0
8 0.07 0.04 0.01 0.20 81.0
9 0.06 0.07 0.03 0.10 80.0
10 0.05 0.05 0.04 0.10 83.0
　　数据经均匀设计软件处理 ,得回归方程 Y=106
-384X1 -13.9X2 -123X3 +20.6X4 ,样本容量 N=
10 ,显著性水平 α=0.01,复相关系数 R=0.9999,
检验值 Ft=5444, 临界值 F(0.01, 4, 5)=11.39, Ft>
F(0.01, 4, 5)显著 ,说明回归方程有意义.对各方程项进
行显著性检验可知:检验值 F(2)=14.35,临界值
F(0.01, 1, 5)=16.26, F(2)≤F(0.01, 1, 5)此方程项不显著 ,
需要剔除;剔除不显著方程项 ,新建回归方程继续计
算:得回归方程 Y=105-383X1 -123X3 +21.3X4 ,
复相关系数 R=0.9996, 检验值 Ft=2250,临界值
F(0.01, 3, 6)=9.780, Ft>F(0.01, 3, 6),回归方程显著.对各
方程项进行显著性检验可知:各方程项对 Y1影响均
显著.根据回归方程求出 Y1的最优组合为:X1 =0.
05, X2 =0, X3 =0.01, X4 =0.50,在此组合基础上求
得最优解:y=95.0,此解为方程的解析解 ,需按公式
Y=y±uα· s计算出优化值区间估计为 Y1 =95.0
(±0.945),即 94.055% ～ 95.945%.以最优组合做
验证试验 ,将渥丹花梗接种到附加 IAA0.05mg·
L-1 、NAA0.01mg·L-1和 KT0.50mg·L-1的 N6培养
基中 ,培养 25d花梗基部开始出现球状突起 ,继续培
养至 40d,球状突起转变为近鱼雷状的球形鳞茎原
基 ,同时部分鳞茎原基伴有根产生(图版Ⅰ , a).鳞茎
原基诱导率达 95.0%以上.在估计区间范围内 , 且
比所有实验 Y值都大.可见 ,渥丹花梗直接发生鳞茎
原基的最佳诱导培养基为:N6 +IAA0.05mg·L-1 +
NAA0.01mg·L-1 +KT0.50mg· L-1.
2.2 鳞茎原基的高效增殖体系建立
以渥丹花梗产生的鳞茎原基为材料 ,将整个鳞
茎原基在超净工作台上切割成薄片 ,再转接到优化
后的鳞茎原基诱导培养基中 ,进行鳞茎原基增殖培
养.培养 15d后渥丹鳞茎原基切片表面球状突起 ,继
续培养至 25d球状突起转化为鳞茎原基 ,培养至
35d后可产生大量的鱼雷状鳞茎原基(图版 Ⅰ , b).
35d为 1个增殖周期 ,每瓶增殖倍数平均都达 40倍
以上.随着增殖次数的增加可适当降低生长素浓度 ,
以免激素积累导致鳞茎原基形态发生变化.
2.3 N6培养基中不同生长素的不同浓度交叉配比
对渥丹鳞茎原基分化为完整植株的影响
待鳞茎原基增殖到一定数量后 ,将鳞茎原基逐
个剥离下来转接到附加不同浓度的 IAA和 NAA(由
预试验可知浓度范围分别为 IAA0.005 ～ 0.01mg·
L-1 , NAA0.001 ～ 0.005mg· L-1 ,低于控制范围的植
物生长调节物质降低了渥丹鳞茎原基的分化和生长
速度;过高的植物生长调节物质导致鳞茎原基再次
产生子球 ,延缓了鳞茎原基的发育速度及完整植株
的再生进程)的 N6培养基中进行鳞茎原基分化为完
整植株的培养.为了提高渥丹鳞茎原基成功发育为
完整植株的速度 ,采用均匀设计法 ,每个处理接种鳞
茎原基数为 30,选用 U10(108)均匀表(见表 3),同时
　 表 3　U10(102)因素及水平设计
水 平
Levels
因素　Factors/mg· L-1
X1 X2
1 0.005 0.001
2 0.006 0.002
3 0.007 0.003
4 0.008 0.004
5 0.009 0.005
6 0.010 0.005
7 0.007 0.004
8 0.008 0.003
9 0.009 0.002
10 0.010 0.001
·43·
考察了 IAA和 NAA浓度交叉配比对渥丹鳞茎原基
分化率的影响(在表和方程中 , X1为 IAA浓度 , X2为
NAA浓度 , Y为渥丹鳞茎原基的分化率 ,结果见表
4).
表 4　U10(102)均匀设计实验安排及结果
处理号
Treatmentcode
因素　Factors/mg· L-1
X1 X2 Y/%
1 0.005 0.004 85.5
2 0.006 0.003 87.0
3 0.007 0.001 89.0
4 0.008 0.005 88.0
5 0.009 0.002 90.5
6 0.010 0.002 91.0
7 0.007 0.005 87.0
8 0.008 0.001 90.0
9 0.009 0.003 90.0
10 0.010 0.004 91.0
　　数据经均匀设计软件处理 ,得回归方程 Y=
82.3+1010X1 -448X2 ,样本容量 N=10,显著性水
平 α=0.01, 复相关系数 R=0.9933,检验值 Ft=
257.2,临界值 F(0.01, 2, 7)=9.547, Ft>F(0.01, 2, 7),回归
方程显著.对各方程项进行显著性检验可知:各方程
项对 Y4影响均显著.根据回归方程求出 Y4的最优组
合为:X1 =0.01, X2 =0.001,在此组合基础上求得最
优解:y=91.9,此解为方程解析解 ,需按公式 Y=y
±uα· s计算出优化值区间估计为 Y=91.9(±0.
886),即 91.014% ～ 92.786%.以最优组合做验证
试验 ,将渥丹鳞茎原基接种到附加 IAA0.01mg·L-1
和 NAA0.001mg·L-1的 N6培养基中 ,培养 15d鳞茎
原基基部开始出现根尖 , 25d后鳞茎原基长出 7 ～ 10
片翠绿色的嫩叶 ,继续培养至 35d鳞茎原基基部直
接长出 3 ～ 5条不定根(图版 Ⅰ , c), 45d后苗高达 5.
5cm以上 ,根长达 3.0cm以上 ,根和苗的形态 、发育
均正常 ,分化率达 92.0%以上.在估计区间范围内 ,
且比所有实验 Y值都大.可见 ,渥丹鳞茎原基分化为
完整植株的最佳培养基为:N6 +IAA0.01mg· L-1 +
NAA0.001mg·L-1.
3　讨论与结论
实验结果证明 ,培养基 N6 +IAA0.05mg·L-1 +
NAA0.01mg·L-1 +KT0.50mg· L-1对渥丹花梗诱
导鳞茎原基的效果最好 ,渥丹离体培养采取花梗再
生鳞茎方式 ,速度快 、诱导率高.诱导培养基中附加
0.50mg·L-1的 KT提高了鳞茎原基的诱导速度和
诱导率 ,从而缩短了诱导周期;鳞茎原基分化为完整
植株的培养基为 N6 +IAA0.01mg· L-1 +NAA0.
001mg· L-1 ,需同时加入两种生长素 ,可能是鳞茎
原基分化的机理不同等原因;以鳞茎原基的切片为
材料诱导产生鳞茎原基 ,方法简捷 ,经济实用 ,可操
作性强 ,增殖倍数高 ,达到了高效增殖的目的.应用
均匀设计法处理和分析数据大大缩短了培养基配方
的摸索周期.本研究初步建立了渥丹相对稳定的高
效离体快繁体系 ,达到了预期目的.为进一步完善百
合属植物鳞茎发生调控体系和阐明鳞茎发生发育机
理提供了基础.近些年来 ,欧洲等国家开发的百合园
艺栽培种进入中国市场.我们国家仅少许百合品种
得到半引种.渥丹系长白山区地产百合 ,都是上好的
抗寒园艺品种 ,但至今未得到引种和广泛用于栽培
观赏和药用.本文结果可能对长白山区百合的开发
利用和工厂化育苗有一定的参考意义.(朱星樽 、滕
孝花系通化市第一中学校生物科技活动小组成员及
指导教师)
图版Ⅰ :渥丹鳞茎诱导及分化各阶段的形态结构
a.示花梗基部诱导出鳞茎(25d);b.鳞茎增殖(35d);c.鳞茎萌发为完整植株(45d).
参考文献:
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[ 4]方开泰.均匀设计—数论方法在试验设计的应用 [ J].1980, 3(4):363-372.
(责任编辑:王宏志)
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