全 文 ：香附子为莎草科莎草属植物，学名 Cyperus
rotundus L.，多年生宿根草本，是一种古老的药用植物，
在中医上主要用来治疗胃腹胀痛，痛经、月经不调等症
状[1]。此外，香附子对内分泌系统具有雌激素样作用，
对离体子宫有抑制作用，有抗炎、抗菌作用，抑制肠管
收缩、利胆、保肝、缓解支气管平滑肌痉挛和抗肿瘤作
用等[1]。内生菌主要指在其生活史的某一阶段存在于
健康植物的组织中、不形成明显侵染的一类微生物[2]。
研究发现，许多内生真菌能够产生对多种病原菌有抗
性的物质，且抗菌活性普遍较高[3-4]。由于内生菌能够
产生各种各样具有抗菌活性的次级代谢产物，使得它
们在医药、农业、工业领域的应用越来越多的受到人们
的关注[5]。目前，研究人员对香附子的化学成分已有
了相当深入的了解，然而，有关香附子内生菌的研究还
未见有报道，笔者就有关香附子内生菌的问题做以初
步探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
香附子于 2008年 4月份采集自西北农林科技大
学，健康，无病虫害，无老死、坏死的植株。
供试菌种：枯草芽孢杆菌、苹果干腐病原菌、南瓜
枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌（均由西北农林科技大学
植保学院植物病理实验室提供）。
培养基采用PDA固体培养基；PDA液体培养基；
NA固体培养基；NA液体培养基[6]。
1.2 方法
1.2.1 内生菌的分离与鉴定
（1）分离。将采集的香附子用流水冲洗后，转到无
基金项目：西北农林科技大学科研专项基金(08080257)。
第一作者简介：王娜娜，女，1982年出生，本科，在读研究生，助教，主要从事微生物学研究。通信地址：712100陕西杨凌，西北农林科技大学生命科学
学院微生物与生物工程系，E-mail：wangna82525@yahoo.com.cn。
通讯作者：秦宝福，男，1968年出生，副教授，在读博士。
收稿日期：2009-01-09，修回日期：2009-02-16。
香附子内生菌的分离鉴定及活性检测
王娜娜，秦宝福，刘建党，史 鹏，常佳丽
（西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100）
摘 要：从药用植物香附子中分离出 4种内生菌，经初步鉴定分别归属于曲霉属（代号为 XFf06.1、
XFf06.2），固氮菌属(XFb)和链霉菌属(XFa)。对这些内生菌发酵产物提取液活性进行测定，结果表明：其
发酵产物均有稳定的抑菌活性，其中链霉菌XFa对枯草芽孢杆菌的抑菌率特别强，XFf06.1菌的发酵液提
取物对苹果腐烂病原菌的抑菌率高达96.3%。
关键词：香附子；内生菌；分离鉴定；抗菌活性
中图分类号：Q93-3 文献标识码：A
The Isolation、Identification and Activity Detection of Endogenous Fungus
from Cyperus rotundus L.
Wang Nana, Qin Baofu, Liu Jiandang, Shi Peng, Chang Jiali
(College of Life Science, Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling Shaanxi 712100)
Abstract: 4 strains of Entophytes were isolated from Cyperus rotundus L. in this study, which were respectively
belonged to Aspergillus (named XFf06.1 and XFf06.2), Azotobacter Beijerinck (XFb) and Streptomyces (XFa). The
result of detecting its antimicrobial activity showed that the production of the fermentative culture of the
screened strains presented certain stable antimicrobial activity, especially XFa appeared highly antimicrobial
activity to Bacillus subtilis and the antimicrobial activity of XFf06.1 to Valsa mali miyabe et. Reached 96.3%.
Key words: Cyperus rotundus L., Endogenous fungus, antibacterial activity, screening and identification
中国农学通报 2009,25(08):46-49
Chinese Agricultural Science Bulletin
菌台上，用剪刀将叶片剪成约3 cm×3 cm小片，茎和根
剪成约 3 cm长的小段，进行表面消毒（75%酒精浸泡
8 min，0.1%的升汞溶液浸泡8 min，再用75%酒精浸泡
8 min，用无菌水漂洗3次）。参照张立新等人的方法[7-8]，
分别采用组织块法和研磨法对内生菌进行分离。待长
出菌落后进行划线纯化，直至得到单一菌落，斜面4℃
保存备用。
（2）鉴定。将菌株于平板中活化，进一步划线纯
化，观察菌落形态特征。利用插片法和革兰氏染色法
通过镜检记录细胞形态特征等，参照文献[9-12]对菌株逐
一进行鉴定。
1.2.2 活性检测
（1）内生菌发酵及代谢物粗提。
内生细菌：挑取少量内生细菌接入NA液体培养基
中(250 ml的三角瓶中放入 100 ml的液体培养基)，pH
7.0，28℃，130 r/min下摇瓶培养24 h，然后进行发酵物
粗提。提取过程如下：菌体中活性物质的提取：将发酵
产物经双层纱布过滤，分发酵液和菌丝体，菌丝体置于
小烧杯中，加入适量的丙酮溶液，在超声波细胞破碎机
中将菌丝破碎（工作时间：3 s；间隔：3 s；次数：90；功率：
400 kW；ф：6 mm）。破碎后滤纸过滤，取清液，自然挥
发浓缩至一半左右，得菌体活性物质，备用；对发酵液
进行预处理：先用1 mol/L的HCl将发酵液pH调至3.0
（引起胶状体状态的破坏和胶体颗粒的沉淀），再加入
无水硫酸钠使之饱和，令蛋白质以沉淀形式析出。预
处理过的发酵液以 1300 r/min离心 30 min，上清液用
CHCl3按体积比1:1萃取得CHCl3层，共萃取3次，萃取
液自然挥发浓缩至一半左右得发酵液活性物质，备用。
内生真菌和放线菌：将内生真菌和放线菌打成
0.7 cm的菌饼，挑取2~3个接入PDA液体培养基中，自
然pH，28℃，130 r/min的恒温摇床上培养6天，然后进
行发酵物粗提。粗提过程同上述内生细菌。分别得到
菌体活性物质和发酵液活性物质。
（2）代谢物抑菌活性测定[13-15]。采用滤纸片法和生
长速率法测定内生菌发酵所得的菌体和发酵液对供试
菌的抑制作用，2~4天后观察结果。并测量菌落直径
（采用十字交叉法），计算相对抑菌率。
相对抑菌率(%)=
×100
2 结果与分析
2.1 分离及鉴定结果
从上述材料中共分得 4株内生菌，包括 2株真菌
（XFf06.1，XFf06.2），1株细菌（XFb），1株放线菌（XFa），
经鉴定分别为曲霉属(Aspergillus)；曲霉属(Aspergillus)；
固氮菌属(Azotobacter Beijerinck)；XFa归属于链霉菌属
(Streptomyces)。分离所得的 4株内生菌在根状茎和根
中都有存在，但在叶子中却没有分离到。
2.2 抑菌活性检测
2.2.1 对细菌的抑菌活性的检测 结果如图1。
图1 XFa和XFb提取物对枯草芽孢杆菌的抑制效果

I： XFa XFb CK1
II： XFa XFb CK2
由图 1知：链霉菌XFa和固氮菌XFb菌对枯草芽
孢杆菌均有抑制作用，尤其是链霉菌XFa的抑制作用
更强。通过测定抑菌圈直径可知（见表 1）：链霉菌
XFa和固氮菌XFb菌发酵液提取物比菌体的丙酮提取
物活性要高，说明两株菌的活性物质主要存在于其代
谢物中。
王娜娜等：香附子内生菌的分离鉴定及活性检测 ·· 47
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
2.2.2 对真菌的抑菌活性检测 对内生真菌XFf06.1发
酵液和菌体分别进行有机溶剂提取，分别对提取物进
行抑菌活性测定，检测其对 3种供试病原真菌的抑菌
活性，检测结果见图2。
菌种发酵液
XFb
XFa
I
CK1
I
CK1
I1
3.6
1.8
5.1
1.8
I2
3.2
2.0
4.8
2.0
I3
-
1.6
5.3
1.6
平均值
3.4
1.8
5.1
1.8
抑菌效果
有
很好
菌丝体
Ⅱ
CK2
Ⅱ
CK2
Ⅱ1
3.4
1.5
4.2
1.5
Ⅱ2
3.2
1.6
4.1
1.6
Ⅱ3
3.5
1.2
4.3
1.2
平均值
3.4
1.4
4.2
1.4
抑菌效果
有
较好
注：菌种发酵液的三氯甲烷提取物为“I”，菌丝体的丙酮提取物为“II”，I对照组(三氯甲烷)为“CK1”，II对照组（丙酮）为“CK2”。发酵液提取物为
“I”，提取溶剂三氯甲烷，对照组（三氯甲烷），用“CK1”表示；菌丝体的提取物为“Ⅱ”，提取溶剂用丙酮，对照组（丙酮），用“CK2”表示。
表1 XFa和XFb提取物对细菌抑制的透明圈直径及抑菌效果 （cm）
XFf06.1对南瓜枯萎病原菌的抑菌圈
XFf06.1对苹果干腐病原菌的抑菌圈
XFf06.1对苹果腐烂病原菌的抑菌圈
由图 2知，内生真菌XFf06.1对 3种供试的南瓜枯
萎病原菌、苹果干腐病原菌和苹果腐烂病原菌均有一
定的抑制作用。XFf06.1对病原菌菌落直径大小测定
结果及抑菌率如表2。
同样对内生真菌XFf06.2进行活性检测，XFf06.2
对病原真菌菌落直径大小测定结果及抑菌率如表3。
图2 XFf06.1对3种供试病原真菌的抑制效果
表2 XFf06.1提取物对供试真菌抑制的抑菌圈直径及抑菌率
注：A南瓜枯萎病原菌，B苹果干腐病原菌，C苹果腐烂病原菌；菌丝提取物对照组的溶剂为丙酮；发酵液提取物对照组的溶剂为三氯甲烷。
供试菌
A
B
C
发酵液提取物抑制的菌落直径
Ⅰ1
0.7
0.9
0.8
Ⅰ2
0.7
0.9
0.9
Ⅰ3
0.8
0.9
0.8
平均值
0.75
0.9
0.85
对照组均值
3.1
4
4.1
抑菌率/
%
96.1
91.7
96.3
发酵菌丝提取物的抑菌圈直径
Ⅱ1
0.8
1.3
1.3
Ⅱ2
1
1.4
1.4
Ⅱ3
0.9
1.2
1.4
平均值
0.9
1.3
1.4
对照组均值
2.5
2.6
3.6
抑菌率/
%
89.5
80.5
81.1
·· 48
由表2，3知，2株真菌（XFf06.1；XFf06.2）均具有一
定的抑菌活性，且均表现为发酵液提取物抑菌活性较
其菌丝提取物强；其中，XFf06.1的发酵提取液对南瓜
枯萎、苹果干腐、苹果腐烂这3株真菌的拮抗作用尤其
强，XFf06.1菌的发酵液提取物对苹果腐烂病原菌的抑
菌率高达 96.3%。总之，实验结果显示香附子内生菌
抑菌活性物质主要存在于其代谢物质。
3 讨论与结论
首次从香附子中分离出4种内生菌并进行初步鉴
定，同时对所得菌株进行抑菌活性检测，结果表明发酵
产物对细菌和真菌均有一定的抑菌活性，且对部分植
物病原菌的抑菌活性还比较高。因此，有望在它们的
发酵提取液中发现新的抑菌活性物质，为香附子内生
菌资源的利用和开发奠定了基础。此外，由于植物内
生菌资源丰富，笔者仅仅采用常规培养法进行培养，且
为了保证所分菌株一定是内生菌，消毒时间要求严格，
但也可能因此使得很多内生菌被杀死，香附子中肯定
还有未分离到的内生菌，有待进一步研究，在后续实验
中要进一步摸索更为合适的消毒时间和分离方法，保
证分离种类的多样性和可靠性；其抑菌活性物质的化
学成分也有待进一步鉴定。
参考文献
[1] 阮金兰,杜俊蓉.香附子的研究进展.中华中医药杂志,2003,20(2):
50-52.
[2] 邹文欣,谭仁祥.植物内生菌研究进展.植物学报,2001,43(9):
881-892.
[3] 陈立军,孙广宇,张荣,等.油菜内生真菌的分离鉴定.石河子大学学
报:自然科学版,2004,22(增刊):66-68.
[4] 文才艺,吴元华,田秀玲.植物内生菌研究进展及存在的问题.生态
学杂志,2004,23(2):86-91.
[5] Saikkonen K. Consumption of grass Endophytes alters the
ultraviolet spectrum of vole urine. Occologia, 2008, 15(6):333-340.
[6] 程丽娟,薛泉宏.微生物实验技术.西安:世界图书出版社,2000:
383-385.
[7] 张立新.番茄内生菌的分离和拮抗生防菌的筛选.山西农业大学学
报,2005,4:30-33.
[8] Strobel GA. Acremonium sp.-a leucinostatin a Producing
Endophytic of European yew (Taxus baccata). Plant Science, 1997
(128):97-108.
[9] 魏景超.真菌鉴定手册.上海:上海科学技术出版社,1979:501-510.
[10] 戴芳澜.中国真菌总汇.北京:科学出版社,1979:100-102.
[11] R E布坎南,N E吉本斯.伯杰细菌鉴定手册(第八版).北京:科学出
版社,1984:274-280.
[12] 卢振祖.细菌分类学.武汉:武汉大学出版社,1994:41-44.
[13] 徐文涛,翟梅枝.核桃内生菌的分离及代谢产物活性研究.西北农
业学报,2008(17):82-87.
[14] 秦宝福,周乐,苗方,等.瑞香狼毒根的抑菌活性研究.西北植物学报,
2003,23(11):1997-1998.
[15] 郭小炜,冯俊涛,易晓华,等.大花金挖耳内生菌的分离及抑菌活性
筛选.西北植物学报,2007,27(2):0377-0383.
表3 XFf06.2提取物对供试真菌抑制的抑菌圈直径及抑菌率
供试菌
A
B
C
发酵液提取物抑制的菌落直径
Ⅰ1
1.5
1.5
2.2
Ⅰ2
1.7
2
2.4
Ⅰ3
1.6
1.8
2.3
平均值
1.6
1.8
2.3
对照组均值
2.5
4
4.1
抑菌率/%
65.9
46.8
46.6
发酵菌丝提取物的抑菌圈直径
Ⅱ1
2.1
2.3
2.5
Ⅱ2
2.3
2.4
2.6
Ⅱ3
2.2
2.4
2.6
平均值
2.2
2.4
2.6
对照组均值
3.1
2.6
3.6
抑菌率/%
42.1
15.3
36.4
注：A南瓜枯萎病原菌，B苹果干腐病原菌，C苹果腐烂病原菌；菌丝提取物对照组的溶剂为丙酮；发酵液提取物对照组的溶剂为三氯甲烷。
王娜娜等：香附子内生菌的分离鉴定及活性检测 ·· 49