全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2011 年
收稿日期：2010－10－01
作者简介：林 海（1970－），男，河南驻马店人，副教授，硕士，从事植物组织培养研究，（电话）13033893398（电子信箱）yuzhao88666＠sina．com。
金线兰［Anoectochilus roxburghii（Wall．）Lindl．］，
兰科开唇兰属植物，全草入药，味甘、性平，具有清
热凉血、除湿解毒的功效，可治疗肺结核、糖尿病、
肾炎、膀胱炎、重症肌无力、遗精、风湿性及类风湿
性关节炎、小儿惊风、妇女白带以及毒蛇咬伤等症，
是民间珍稀名贵的中草药［1］。除药用外，由于株型矮
小，叶型优美，叶面黑紫色，有金黄色带有绢丝光泽
的美丽网脉， 是观赏价值极高的室内观叶珍品，具
有广阔的开发利用前景。
金线兰种子自然条件下萌发率很低，再加上过
度采集，野生资源日益枯竭［2］。在人工培养条件下诱
导愈伤组织生长并使其增殖是实现快繁和分离其
次生代谢产物获取金线兰药用成分的重要途径，但
目前罕见金线兰愈伤组织诱导的研究报道。 采用正
交试验研究了 4 种激素对诱导愈伤组织生长的影
响，为金线兰愈伤组织诱导和细胞培养体系的建立
提供依据。
1 材料与方法
1．1 材料
外植体：于花卉市场采购金线兰植株。
金线兰离体胚：于市场采购金线兰种子，清水
浸泡 24 h，剥取离体胚。
1．2 方法
1．2．1 培养基及外植体的消毒与接种 培养基：MS
基本培养基＋30．0 g/L 蔗糖＋8.0 g/L 琼脂， 附加不同
浓度的 2，4－D、NAA、6－BA、ZT，pH 值为 5．8～6．0，每
150 mL 三角瓶中加培养基 30～40 mL，灭菌 20 min，
双层牛皮纸封口，灭菌后 1～2 d 备用。 外植体消毒：
在超洁净工作台上进行操作，将金线兰芽的尖端部
金线兰愈伤组织诱导的最佳激素配比
林 海，郝慧敏
（鹤壁职业技术学院农村工程与技术系，河南 鹤壁 458030）
摘要：以金线兰根状茎、幼茎、叶片、离体胚为外植体，4 种激素 2，4－D、NAA、6－BA、ZT 采用 L9（34）正交表
处理，对愈伤组织诱导的条件进行研究。结果表明，6－BA 和 2，4－D 在诱导金线兰愈伤组织中作用极为显
著，4 种激素对愈伤组织的诱导作用大小依次为，6－BA＞2，4－D＞NAA＞ZT， 初步断定金线兰愈伤组织诱导
的最佳激素配比是 0．2 mg ／ L 2，4－D＋0．9 mg ／ L NAA＋1．0 mg ／ L 6－BA＋0．50 mg ／ L ZT； 根状茎和幼茎作为
外植体更易诱导愈伤组织形成；暗培养较光暗交替更易诱导愈伤组织生长。
关键词：金线兰；愈伤组织；诱导；条件
中图分类号：S682．31 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2011）12－2568-03
Study on the Optimum Hormone Ratio Inducing Callus of Anoectochilus roxburghii
LIN Hai，HAO Hui－min
（Rural Engineering and Technology Department，Hebi College of Vocation and Technolgy，Hebi 458030，Henan，China）
Abstract： Using the rhizome， leaf blade， steam and in vitro embryo of Anoectochilus roxburghii as explants， the inducing
conditions of callus were studied by L9 （34） orthogonal design of four kinds of plant growth regulators， 2，4－D， 6－BA， NAA
and ZT． The results showed that 6－BA and 2，4－D played extremely important roles in induction of callus． The order of the
efficiency of the four regulators was 6－BA＞2，4－D＞NAA＞ZT． The best medium for calli inducement was MS＋0．2 mg ／ L 2，4－
D＋0．9 mg ／ L NAA＋1．0 mg ／ L 6－BA ＋0．50 mg ／ L ZT． Inducing callus from rhizome and stem was easier； and callus browning
rate under dark was lower than that under light－dark alternate conditions．
Key words：Anoectochilus roxburghii； callus； inducement； conditions
第 50卷第 12期
2011年 6月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 50 No.12
Jun．，2011
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2011.12.055
第 12 期
分、幼嫩的根状茎、新生叶片用清水冲洗干净后，再
用去离子水冲洗 5 次，用体积分数为 75％的酒精浸
泡 30 s 后再用无菌水冲洗 3 次 ，0．1 g/100mL 的
HgCl2浸泡 8～10 min，再用无菌水冲洗 3 次，即完成
消毒。 接种：消毒后的材料置于无菌滤纸上吸干水
分，然后将材料切割成适量大小接种到加有不同浓
度激素的培养基中。
1．2．2 试验处理 根状茎处理：基本培养基为 MS＋
30．0 g/L蔗糖＋8.0 g/L 琼脂，激素选取 2，4－D、6－BA，
激素处理如表 1。 每种激素处理接种 12 瓶，6 瓶于
光暗交替下培养；6瓶于暗处培养。光暗交替培养放
在日光灯照明的培养架上， 每天 8∶00－18∶00 照明，
温度设置为 20 ℃恒温培养； 暗处培养的放在 20 ℃
培养箱中培养，湿度为 85％～90％。 每隔 10 d观察记
录每种处理外植体的变化，并对发生变化的外植体
进行数码拍照。
幼茎、叶片及离体胚处理：基本培养基为 MS＋
30．0 g/L 蔗糖＋8.0 g/L 琼脂， 选取 2，4－D、NAA、6－
BA、ZT 4 种激素处理，每种激素取 3 个水平，利用
L9（34）正交表，考察 4 种激素对金线兰愈伤组织诱
导的影响，激素处理见表 2。 每种处理接种 6 瓶，离
体胚每种处理接种 2 瓶， 暗处 20℃培养， 湿度为
85％～90％。 每隔 10 d观察外植体变化并记录。
2 结果与分析
2．1 对根状茎诱导愈伤组织结果进行观察并分期
照相
光暗交替下的金线兰愈伤组织生长的较疏松，
为绿色团块状， 而暗处理下金线兰愈伤组织较紧
密，白色或略带黄色。光暗交替培养，①处理在第 60
天时有新的须根出现，70 d 时须根下面生成不规则
突起，80 d 时变成类似芽状的组织，90 d 时生成花
蕾样突起； ③处理在 80 d 时才有新根出现，90 d 时
须根变长；④处理外植体表面在 20 d 时有短细毛出
现，90 d 时表皮开裂（图 1、2）；⑧处理在 90 d 时下
部生成一突起。 暗处培养的金线兰，①处理在 45 d
时有须根出现，55 d 时出现芽状体，65 d 时出现不
规则突起；④处理直到 65 d 时都没有什么变化。 其
他处理则因染菌外植体全部死亡。
金线兰根状茎诱导愈伤组织生长的基本情况，
金线兰茎在 10 d 左右切口便可观察到白色致密的
颗粒状愈伤组织，30 d 时愈伤组织生长达到最大速
度。低浓度处理的金线兰外植体在暗处培养 45 d时
出现须根，65 d 左右出现芽状体， 光暗交替培养的
条件下 60 d 出现须根，80 d 左右才出现芽状体。 因
此金线兰根状茎诱导愈伤组织生长在暗培养条件
较光暗交替条件好。
2．2 不同激素处理对金线兰叶片愈伤组织的诱导
在整个试验过程中，对叶片进行愈伤组织诱导
的培养基中，部分叶片在 30 d 时没有明显出现愈伤
组织， 大部分叶片外缘及脉线处变黑或已经死亡，
造成这种结果的原因可能是由于消毒时间过长或
消毒液浓度过高，叶片过于幼嫩造成死亡或培养基
的激素配比不适合叶片愈伤组织的诱导。
2．3 不同激素处理对金线兰离体胚愈伤组织的诱导
接种 10 d 后离体胚看不出变化，30 d 时可观察
到部分处理中离体胚膨胀伸长，但不明显。
2．4 不同激素处理对金线兰幼茎愈伤组织的诱导
接种 10 d 后金线兰幼茎切口处出现白色点状
物质，20 d 后白色点状物质逐渐扩大， 形成一层薄
薄的愈伤组织，30 d 后统计各处理诱导愈伤组织的
表 1 根状茎激素处理
处理
1
2
3
4
5
6
7
8
9
2，4-D//mg/L
0.5
1.0
1.5
2.0
0.5
0.5
0.5
1.0
2.0
6-BA//mg/L
0.0
0.0
0.0
0.0
0.5
1.0
2.0
0.5
0.5
表 2 因素与水平
水平
1
2
3
2，4-D//mg/L
0.2
0.6
1.2
NAA//mg/L
0.1
0.3
0.9
6-BA//mg/L
0.0
0.5
1.0
ZT//mg/L
0.25
0.50
1.00
因素
图 1 光暗交替下 70 d 的①、③和④处理
图 2 光暗交替下 100 d 的①、③和④处理
林 海等：金线兰愈伤组织诱导的最佳激素配比 2569
湖 北 农 业 科 学 2011 年
数目。
通过 6－BA、2，4－D、NAA、ZT 4 种激素 3 个水
平 9 个浓度组合的正交试验发现各种组合对金线
兰愈伤组织诱导的影响差异很大，通过对试验结果
进行极差分析 ［3］， 4 种激素对愈伤组织的诱导作用
大小依次为 6－BA＞2，4－D＞NAA＞ZT。 金线兰愈伤组
织最佳激素配比可初步断定为 0．2 mg ／ L 2，4－D＋0．9
mg ／ L NAA＋1．0 mg ／ L 6－BA＋0．50 mg ／ L ZT，且该结
果和试验中处理组③诱导率最大基本吻合 （表 3）。
但因试验各处理的重复中愈伤组织诱导率差异较
大，故而试验的可行性较差，最佳激素配比仍需进
一步试验验证，由表可以看出 6－BA、2，4－D 为金线
兰愈伤组织诱导的主要因素，是否 6－BA、2，4－D 两
者的组合更适合诱导金线兰愈伤组织尚需进一步
试验。
2．5 外植体大小对愈伤组织诱导的影响
以金线兰幼茎为外植体， 当茎直径小于 0．5 cm
时，从接种第七天开始，茎两端切口处渐渐变黄，随
着时间的延长，色泽逐渐加深，20 d 时变成深褐色，
且部分外植体切口分泌出淡黄色液体，30 d 时部分
幼茎渐渐发黑死掉。 当外植体茎直径大于 0．5 cm
时， 接种 10 d 开始在切口处愈伤组织以点状出现，
15 d 时已能看到薄薄的一层白色结晶状物质，30 d
时，形成白色较致密的愈伤组织。吕玉虎等［4］研究认
为外植体在培养基上的不同放置方式对百合鳞片
愈伤组织诱导也有影响，其诱导出芽能力从强到弱
依次为：鳞片内侧向上＞鳞片竖直插入＞鳞片内侧向
下平放。 金线兰外植体的放置方式是否影响到愈伤
组织的生长还需进一步研究。 在试验中，金线兰茎
水平放置和垂直放置（一切口接触培养基）两者的
愈伤组织生长情况有明显的差别，垂直放置生成愈
伤组织的量多且愈伤组织较致密、生长旺盛，水平
放置愈伤组织生成量少、疏松且生长较慢。
3 讨论
1） 在试验过程中外植体或愈伤组织发生褐化
现象，其原因是多酚化合物在多酚氧化酶的作用下
氧化为活性酸化物和环形多聚体氧化蛋白质时形
成深色化合物，这些物质很快又被氧化和形成复杂
的醌类物质，从而导致外植体组织或细胞逐渐变成
褐色或黑色，最后死亡［5，6］。据报道，加入抗氧化剂或
吸附剂对抑制褐化有明显的效果，在试验中通常采
用 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和活性炭抑制褐变［7，8］。表
3 可看出金线兰愈伤组织褐化率比较高， 这是因为
培养基中没有加入抑制剂。
2）根据细胞全能性理论，植物任何器官都可以
用作外植体，但不同组织器官培养成功的难易程度
是不同的，同一种植物不同的组织和器官再生能力
也有很大差异［9］。试验中取根状茎、幼茎、叶片、离体
胚为外植体，结果表明，只有根状茎和幼茎易产生
愈伤组织，愈伤组织布满切口或外侧、质地紧密、时
间相对短，且诱导率较高。 离体胚愈伤组织形成不
明显。叶片在消毒时被杀死，无愈伤组织生成。根状
茎、幼茎和离体胚诱导愈伤组织能力不同证明不同
器官和组织的再生能力不同。
参考文献：
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志，2003，28（3）：193－195．
ZT
1
2
3
3
1
2
2
3
1
140.3
142.9
119.1
23.8
表 3 各激素组合下金线兰愈伤组织诱导率
处理组
1
2
3
4
5
6
7
8
9
x1
x2
x3
R
2，4-D
1
1
1
2
2
2
3
3
3
161.5
152.5
88.3
73.2
NAA
1
2
3
1
2
3
1
2
3
141.2
113.5
147.6
34.1
6-BA
1
2
3
2
3
1
3
1
2
109.3
89.4
203.6
114.2
愈伤组织诱导率//%
50.0
35.0
76.5
33.3
69.2
50.0
57.9
9.3
21.1
褐化率//%
45.45
25.00
23.08
25.00
22.22
18.18
33.33
16.67
50.00
注：不加激素的对照愈伤组织诱导率和褐化率分别为 5.60%和
42.86%。
（责任编辑 田宇曦）
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