全 文 ：中国农学通报 第22卷 第 5期 2006年 5月
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植物基因工程已在作物育种、种质资源保存等领
域显示了巨大的作用。植物组织培养作为基础研究手
段之一,是植物高频、稳定、快速体细胞再生芽体系的
建立和细胞转化的有效途径。长寿花 (Kalanchoe
blossfeldiana),又叫矮生伽蓝菜、寿星花、假川莲,是景
天科伽蓝菜属多年生肉质植物,原产马达加斯加[1],花
色有深红、橙红、粉红、白色等,花期为冬、春两季。长
寿花植株小巧玲珑,株型紧凑,叶片翠绿,花朵密集,
是观叶和观花的优良花卉,可采用水培盆栽、微型盆
栽、大型盆栽、花坛布置等室内外栽培,加上其耐干
旱、易栽培、装饰效果好,已成为一种很有发展潜力
的“ 新品种花卉”,市场前景看好[2]。通过粉红长寿花叶
片再生试验,以期为长寿花无性变异体筛选及建立适
合遗传转化的再生体系,为进一步应用遗传转化法改
良长寿花品种提供实践基础。
1材料与方法
1.1材料来源
供试材料为河南农业职业学院园林花卉教研室
提供的粉红色长寿花品种,2005年 7月剪取中上部
枝条带回室内,以叶片为外植体作为研究对象。
1.2方法
从枝条上剪下完全展开的叶片(带叶柄),用洗洁
精液洗涤 2~3min,流水冲洗 30min后滤纸吸干水分
置于超净工作台上,用75%的酒精灭菌10秒,倒去酒
精,再用 0.1%升汞分别灭菌 2、4、6、8、10min,最后用
无菌水冲洗 5~6遍,无菌滤纸吸干水分,切成 0.5cm2
大小的小块(小叶不切,留叶柄),接种到再生培养基
上。再生培养基选用MS、1/2MS、B5为基本培养基,添
加不同浓度生长素和分裂素(见表 1)及其它附加物
(蔗糖浓度为 3%,琼脂浓度为 0.65%),PH5.5~6.0,
121~123℃湿热高压灭菌15~20min。每组叶片分正反
两面分别接种 30瓶,每瓶接种一个叶片小块,重复 3
次。接种叶片一半进行暗培养,另一半在培养架上以
日光灯为光源进行光照培养,光照时间 12h,光照强
度2000lx。培养温度均为 (25±2)℃。叶片接种后35d
统计叶片再生率,并对结果进行单因子方差分析。当
第一作者简介:冯林剑,1967年生,讲师,主要从事植物组织培养与植物学研究。通信地址:451450河南中牟河南农业职业学院植物科学系,E-mail:hn-
nxflj@126.com,Tel:0371-67290626。
收稿日期:2006-01-07,修回日期:2006-01-17。
不同培养条件下长寿花叶片再生体系的构建
冯林剑,贾东坡,张信栓
(河南农业职业学院植物科学系,河南中牟 451450)
摘 要:以长寿花粉红色品种离体叶片为外植体,探讨了基本培养基、暗培养以及不同植物生长调节剂
组合对不定芽再生的影响。结果表明,基本培养基以MS最为合适,以1/2MS+BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L
可以使粉红色品种的叶片不定芽的再生率高达 5.2,暗培养15天可以将叶片的不定芽再生率提高到
5.47。生根培养用1/2MS+IBA0.1mg/L最好。
关键词:白花长寿花;组织培养;快速繁殖
中图分类号:S681;Q949 文献标识码:A
ResearchofDiferentCultureConditionsonPlantletRegenerationfrom
LeavesofKalanchoeblossfeldiana
FengLinjian,JiaDongpo,ZhangXinshuan
(HenanVocationalColegeofAgriculture,zhongmuhenan451450)
Abstract:TheidealregenerationsystemofKalanchoeblossfeldianawithpinkflowerbyleafexplantswas
establishedinthisstudy,andtheefectsofbasicmedium,darkperiodsandplantgrowthregulators
externalonshootregenerationfrom leavesofKalanchoeblossfeldianawereinvestigated.Theresults
showedthatthehighesttratiousonregenerationrateof5.20wasobtainedonthemedium MS
supplementedwith2.0mg/LBAand0.5mg/LNAA.Twoweeksofdarktreatmentcouldincreasethe
shootregenerationrateto5.47.MSsupplementedwith0.1mg/lIBAforrooting.
Keywords:Kalanchoeblossfeldiana,Tissueculture,Propagation
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ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.22No.52006May
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再生芽长到2mm时,剪成单芽进行生根诱导。
2结果与分析
2.1灭菌时间对无菌外植体建立的影响
灭菌时间不同,灭菌效果也不同(表 2为 30天时
统计结果)。从表2可以看出:叶片在0.1%升汞灭菌
8min的消毒条件下效果最佳,其污染率仅为 1.1%,
但90个外植体中有1个叶片被灭菌剂杀死;虽然灭
菌10min时外植体材料没有污染,却有50%叶片被灭
菌剂杀死;灭菌2min时,细菌性污染和真菌性污染同
时出现,在接种2天后就可观察到培养材料边缘出现
混浊的粘液状物,第 4天开始出现菌斑,第 7天出现
各种颜色霉层,10~15天时整个培养基基本布满霉菌,
可见主要是灭菌不彻底造成的;灭菌 4min材料也出
现云雾状细菌性污染,同时出现绿霉、青霉状真菌污
染的现象;灭菌6min细菌性和真菌性污染分别发生,
仅有部分同时在一起发生。随着灭菌时间的递增,虽
然污染率很低,但在杀死了微生物同时也对外植体造
成了不可逆转的损伤。
2.2培养基、培养方式及生长调节物质对叶片再生的
影响
长寿花叶片上的芽再生速度比较快,暗培养条件
下 15天左右可以看出叶片近轴端有少量芽体出现,
20天时芽伸长可达 1.5mm左右;光照培养条件下 20
天时才在叶片近轴端有芽体出现,芽体数量较暗培养
表 1L9(34)试验因子水平表
条件下少,25天左右芽开始伸长,伸长速度相对没有
暗培养条件下快,但再生芽长势比暗培养条件下健
壮。表3为接种35天后对叶片的再生芽体进行统计,
以再生有效芽数(芽长 0.5mm以上的芽)/接种叶片
数来统计再生率。
从表 3看出:不同培养基、培养方式及生长调节
物质对叶片再生芽诱导的效果不同,试验无论暗培养
或光培养,各处理组合的诱导再生率大小依次是:6>
9>3>8>2>5>1>4>7。在具体选择的各个因子
中,A因子不同,叶片的再生率也不同,但差异不明
显;随着 B因子水平的上升,再生率呈上升趋势,三
水平间差异明显;随着 C因子含量水平的上升,再生
表 2不同时间对无菌体系建立的影响
率呈下降趋势,各水平间有差异。这说明不同培养基、
激素及其含量水平对再生率的影响趋势是不同的。从
表 3还可以看出,各因子极差顺序为 B>C>A(光、
暗培养一致),这反映出对再生率影响顺序是 B>C>
A。再生率A因子以A2最高,B以B3最高,C以C1
最高;再生率以组合A2B3C1为最高。但B因子中B2
影响的芽苗健壮,数量为 3.53,对叶片再生诱导的最
优组合也有可能是A2B2C1。
对 L9(34)正交试验进行单因子方差分析,结果表
明,BA表现极显著,NAA表现显著,基本培养基不显
著,与直观分析基本相吻合。笔者对再生倍数最高的
组合和有可能最优的组合进行了验证,验证结果表
明:A2B3C1组合的再生率为 5.2(光培养)、5.4(暗培
养),再生芽整体健壮;A2B2C1的再生率为 3.4(光培
养)、3.7(暗培养),再生芽健壮。由于组合A2B3C1再
生芽数比A2B2C1多,芽体也健壮,故为最优组合。
2.3培养方式对叶片再生的影响
分别把叶片接种于培养基 1/2MS+BA2.0mg/L+
表 3不同培养基、培养方式及生长调节物质对叶片再生的影响
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5)。从表5可以看出:叶片的正面接触培养基,其再生
有效芽数、再生率都明显高于叶片背面接触培养基,
说明叶片正面放置方式更有利于叶片再生。
2.5激素组合对生根的影响
以1/2MS为基本培养基,分别添加不同的细胞分
裂素和生长素(表 6)进行生根诱导,在 7天时幼根伸
出,10天时培养基表面根系生长出一层白色绒状根
毛,当根系伸入培养基后,不再生长白色根毛,而变为
褐色根系延伸。25天对生根结果进行统计(表6)。由
表 6可以看出,随着 IBA浓度的升高,生根数先增多
NAA0.1mg/L(最优组合)中,于 30天时观察不同光、
暗培养方式对叶片再生的影响,结果如表 4所示。从
表4可以看出不同的黑暗和光照条件下,再生芽苗的
生理状态不一样,综合比较以先暗培养 15天再进行
光照培养为佳。
2.4叶片放置方式对叶片再生的影响
分别以90个幼叶按正面和背面接种于最适培养
基上,接种10天时,叶片正面和背面形态无明显变
化;20天后,在正面放置的叶片的近轴端有小芽体,
25天生长分化出小芽。在35天后进行统计(结果见表
表 4不同培养方式组合对叶片再生的影响
表 5叶片放置方式对叶片再生的影响
后降低,在 0.2mg/L时苗基部出现轻微愈伤,0.3mg/L
时出现较大愈伤块。两种激素配合时,生根条数没有
单 加 生 长 素 根 数 多 。 最 适 的 生 根 培 养 基 为 :
1/2MS+IBA0.1mg/L。
3讨论
暗培养有利于不定器官的再生[3],并在许多植物
的离体叶片培养中都可以促进不定芽的高效再生[4]。
笔者在探讨不同的光照条件对长寿花叶片再生影响
时发现:暗培养时,再生芽数量多但芽体纤弱;光培养
时再生芽个数少但芽体健壮;光、暗培养相结合时,再
生芽数量增加、长势也健壮,与许多研究结果一致[3,4]。
陈玉粱以普通长寿花叶片为材料进行再生体系
研究后指出:基因型不同,影响再生的因素也不同,尤
其是在外植体选择和培养基筛选上还应进一步研究。
同时他在进行叶盘放置方式对再生体系建立影响的
研究时,认为正面向上有利于再生[5]。而张瑞姿用长寿
花红色品种“ Rako”为试验材料进行同样研究时,认为
叶片背面向上有利于叶片再生[6]。笔者用粉红长寿花
品种进行研究时发现,正面向上再生率较高。Nehra等
认为造成这种差异的原因是叶背面气孔较多,组织疏
松,角质层不发达,有利于营养吸收[7]。
参考文献
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(责任编辑:秦守亮)
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