全 文 ：书2014 年 2 月第 16 卷第 1 期
February 2014，Vol. 16，No. 1
湖北中医药大学学报
Journal of Hubei University of Chinese Medicine
基金项目:国家自然科学基金(30870255、31000158);湖北省自然科学基金(2013CFA040)。
作者简介:韩林涛(1976 －)，男，湖北中医药大学副研究员，研究方向:中药物质基础与作用机制研究。
通讯作者:黄芳(1973 －)，女，湖北中医药大学副教授，研究方向:中药物质基础与作用机制研究，E-mail:15337237061@ 163． com。
【论 著】
鹅掌草皂苷抗肿瘤作用研究
韩林涛，李明明，方颖，杨红兵，黄芳
(湖北中医药大学中药资源与中药复方教育部重点实验室，湖北 武汉 430065)
摘要:目的 研究鹅掌草单体皂苷的抗肿瘤活性。方法 用MTT法检测鹅掌草单体皂苷 I4a、fII对人宫颈癌 HeLa
细胞、HeLa细胞株加脂多糖( LPS) 诱导模型、人肝癌 HepG2 细胞、人肝癌 Bel － 7402 细胞生长抑制作用; 用流式细胞术
( FCM) 检测鹅掌草单体皂苷对肿瘤细胞凋亡的影响; 用 Werstern blot 蛋白印迹法检测鹅掌草单体皂苷对肿瘤细胞
MAPK信号蛋白的影响。结果 鹅掌草皂苷对肝癌细胞 Bel － 7402、宫颈癌细胞 HeLa等均有一定的抑制生长的作用，
并有一定的剂量依赖关系，浓度在 5． 0μmol /L时有促进细胞凋亡的作用，对不同细胞株的结果相似。结论 鹅掌草皂
苷具有抑制肿瘤细胞生长作用，诱导肿瘤细胞死亡的主要途径是凋亡，且可以通过影响 MAPK 信号通路，抑制磷酸化
P － p38、P － EＲK蛋白的表达，发挥抗肿瘤作用。
关键词:鹅掌草; 皂苷; 抗肿瘤; MTT法; 流式细胞术;丝裂原活化蛋白激酶信号通路
中图分类号:Ｒ282． 71 文献标识码:A doi: 10. 3969 / j. issn. 1008 － 987x. 2014. 01. 01
Study on Anti － tumor Effect of Saponins from Anemone Flaccida
HAN Lintao，LI Mingming，FANG Yin，YANG Hongbin，HUANG Fang
(Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Ｒesource and Compound Prescription Ministry of Education，
Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065)
Abstracts:Objective To discuss anti － tumor effect of saponins (glycoside St － I4a，flaccidosideII)from the medical plants of Anemo-
ne flaccida． Methods Use solventomethod to extract and separate Anemone flaccida to get glycoside St － I4a and flaccidosideII ，and use
MTT to investigate the inhibition effect of saponins on cell growth，and then get IC50;use FCM to compare the effects of saponins on cell ap-
optosis;use Western blot to determine the effect of saponins on MAPK signal pathway protein expression of tumor cells． Ｒesults The sapo-
nins from Anemone flaccida have some kind of inhibition effect on cell growth，and they are dose － dependent;they are helpful to promote
cell apoptosis and have different results of cell lines． P － EＲK and P － p38 protein expression significantly decreased after the cells are treated
with glycoside St － I4a and flaccidosideII for 24h． Conclusions The saponins has significant effect on anti － tumor;the main way to induce
the death of tumor cells is apoptosis;they can both inhibit the P － EＲK and P － p38 signal pathway of the tested tumoer cells．
Key words:Anemone flaccida;saponins;antitumor;MTT;FCM;MAPK signal pathway
鹅掌草(Anemone flaccida Fr． Schmidt)，植物分类学上属毛
茛科(Ｒanunculacae)银莲花属(Anemone L．)鹅掌草组(Sect．
Stolonifera (Ulbr．)Juz)多年生植物。该属植物约有 150 种左
右，世界各大洲均有分布，我国有 54 种，除海南省外，其它各省
均有分布［1 － 2］。银莲花属植物的生物活性主要为抗肿瘤与抗
炎，三萜皂苷是抗肿瘤与抗炎的活性部位［3］。前期研究报道了
鹅掌草总皂苷的抗肿瘤作用［4］，而其单体皂苷抗肿瘤作用未见
报道，前期研究表明该类成分具有抑制环氧合酶 － 2(COX － 2)
作用，本研究观察鹅掌草单体皂苷对多种肿瘤增殖的影响及诱
导肿瘤细胞凋亡作用，并初步探讨其抗肿瘤作用与环氧合酶 － 2
上游激酶 MAPK信号通路中主要的 p38、EＲK、JNK 通路之间的
关系。
1 材料与方法
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Journal of Hubei University of Chinese Medicine
2014 年 2 月第 16 卷第 1 期
February 2014，Vol. 16，No. 1
1． 1 实验药物
鹅掌草皂苷(中药资源与中药复方教育部重点实验室制，
鹅掌草原植物采于湖北省九峰地区，由中国科学院武汉植物园
鉴定)。取鹅掌草根茎 0． 5kg，经溶剂提取，D101 大孔树脂柱、
硅胶柱、反相色谱柱反复分离，得鹅掌草单体皂苷 2 种，经结构
鉴定为已知化合物 glycoside St － I4a(I4a)及 flaccidosideII
(fII)［5］。精密称取各鹅掌草单体皂苷适量，先用 DMSO 溶解，
再用 PBS稀释至所需浓度，备用。
1． 2 试剂、细胞株与仪器
二甲基亚砜 DMSO、胰蛋白酶、氯霉素、青霉素、EDTA (Am-
resco公司);ＲPM I 1640 (GIBCO 公司);MTT、P I、LPS(Sigma
公司);胎牛血清、新生牛血清(三利生物制品厂);抗体 p － p38
(Y182)BS4766、p － EＲK(Y204)BS4621、p － JNK(1 /2 /3)
(T183)BS4763 及内参 β － Actin (Bioworld公司)。
人宫颈癌 HeLa细胞株、人肝癌 HepG2 细胞株、人肝癌 Bel
－ 7402 细胞株(均由武汉大学中国典型培养物保藏中心
(CCTCC)提供)。
SHELLＲB CO2恒温细胞培养箱(Sheldon 公司);CK2 － TＲC
－ 3 倒置显微镜(Olympus公司);SUNＲISE 酶标仪(TECAN 公
司);FACSCalibur 流式细胞仪(BD 公司);Werstern blot 仪器
(Bio － Bad公司)。
1． 3 半数抑制浓度( IC50 ) 的测定
以 MTT法测定总皂苷及单体皂苷(1 － 5)HeLa细胞株加脂
多糖(LPS)诱导 COX －2 高表达模型、人肝癌 HepG2 细胞株、人
肝癌 Bel － 7402 细胞株 4 种肿瘤细胞的抑制作用。取对数期细
胞制成细胞悬液，稀释至浓度为 5 × 104μg /mL，接种于 96 孔培
养板内(HeLa细胞株加脂多糖诱导模型则加入 LPS，终浓度 10
μg /mL)，每孔 200μL，培养条件 37℃及 5% CO2，24h 后加入不
同浓度待测样品，单体皂苷(I4a、fII，40、20． 0、10． 0、5． 0、2．
50μmol /L)继续培养 24h。然后，加入 20μLMTT 溶液 5mg /mL，
培养 4 h。小心地移去培养基加入 150μL DMSO。于室温下轻
轻振摇 10min，以酶标仪 (Bio － Ｒad)测定 490 nm 处的吸收值，
计算抑制率及半数抑制浓度(IC50)。
1． 4 凋亡率的测定
人宫颈癌 HeLa 细胞株、HeLa 细胞株加脂多糖(LPS)诱导
COX －2 高表达模型、人肝癌 HepG2 细胞株、人肝癌 Bel － 7402
细胞株 4 种肿瘤细胞以5． 0μmol /L 单体皂苷 I4a 及 fII 处理，共
孵育 24h，未用药物处理的细胞液为阴性对照组。0． 25%胰酶
消化细胞，经 PBS 清洗后，离心去上清，以 PI 溶液及 Anniex V
溶液染色，避光 4℃保存，室温避光孵育 20min，以 FACS Calibur
流式细胞仪测定，CELLQuest 3． 0． 1 软件计算凋亡细胞百分率。
1． 5 Werstren Blot 蛋白印迹
以 Werstren Blot 法检测经单体皂苷(I4a、fII，5． 0μmol /L)
处理 24h后，人宫颈癌 HeLa 细胞株、HeLa 细胞株加脂多糖
(LPS)诱导模型、人肝癌 HepG2 细胞株、人肝癌 Bel － 7402 细胞
株 4 种肿瘤细胞中 MAPK 信号通路有关磷酸化蛋白的表达。
各组细胞提取蛋白，以 Lowry 法蛋白定量。取 50μg 蛋白上样，
丙烯酰胺凝胶电泳;采用湿式转膜方式检测蛋白表达;ECL自显
影技术观察磷酸化 P － p38、P － EＲK、P － JNK 蛋白的表达，使用
β － actin作为内参。将胶片进行扫描，用结果分析使用 Quantity
One 4． 6． 2 (BIO － ＲAD)凝胶图像处理系统软件分析目标带的
分子量和光密度值，以半定量方法得出上述磷酸化蛋白在加药
处理后相对于未加药的阴性对照组的相对表达量。
1． 6 统计学方法
应用 SPSS11． 0 统计学软件，统计方法采用方差分析，组间
比较采用 t检验，所有数据以均数 ±标准差(珋x ± s)表示，以 P ＜
0． 05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 鹅掌草单体皂苷对体外培养 4 种肿瘤细胞生长的抑制作
用
皂苷 I4a、fII对 4 种细胞皆有抑制作用，抑制作用随药物浓
度增加而逐渐增强，呈剂量依赖性。4 种肿瘤细胞对皂苷 fII 的
敏感性均高于皂苷 I4a(P ＜ 0． 05)，说明皂苷 fII 抑制肿瘤细胞
增殖作用较强，尤其是对于未经脂多糖诱导的 HeLa 细胞(IC50
＜ 2． 0μmol /L)。见表 1。
表 1 4 种肿瘤细胞生长的抑制作用比较 (珋x ± s，n = 3)
IC50
(μmol /L)
HeLa HeLa + LPS HepG2 Bel － 7402
皂苷 fII处理组 1． 21 ±0． 04* 8． 14 ±1． 07* 8． 41 ±0． 97* 8． 92 ±1． 03*
皂苷 I4a处理组15． 22 ±2． 30 16． 73 ±2． 43 14． 67 ±1． 84 20． 10 ±2． 54
与皂苷 I4a处理组比较，* P ＜ 0． 05。
2． 2 鹅掌草单体皂苷对体外培养肿瘤细胞凋亡的影响
在浓度为 5． 0μmol /L时，单体皂苷 I4a、fII均能诱导 4 种肿
瘤细胞的凋亡，相对于其他肿瘤细胞，2 种皂苷更易引起肝癌细
胞 Bel － 7402 的凋亡，皂苷 fII的作用强于皂苷 I4a，这和其对肿
瘤细胞的抑制作用结果一致，说明鹅掌草皂苷类成分诱导肿瘤
细胞凋亡可能是其抗肿瘤作用的重要途径。见表 2。
表 2 4 种肿瘤细胞凋亡的比较 (%，珋x ± s，n = 3)
凋亡率 HeLa HeLa + LPS HepG2 Bel － 7402
阴性对照组 0． 24 ±0． 05 0． 21 ±0． 06 0． 17 ±0． 06 0． 19 ±0． 07
皂苷 fII处理组 7． 50 ±0． 25＊△14． 95 ±1． 65＊△ 9． 78 ±1． 36* 29． 57 ±2． 15＊△
皂苷 I4a处理组 1． 99 ±0． 64* 6． 81 ±0． 96* 6． 64 ±1． 40* 17． 53 ±1． 38*
与阴性对照组比较，* P ＜0． 05;与皂苷 I4a处理组比较，△P ＜0． 05。
2． 3 鹅掌草单体皂苷对体外培养肿瘤细胞 MAPK 通路蛋白的
影响
皂苷 fII、I4a作用细胞 24h后，对于 HeLa细胞、脂多糖诱导
的 HeLa细胞、HepG2 细胞及 Bel － 7402 细胞，P － p38 蛋白表达
较对照组减少，P － EＲK 蛋白较对照组减少，P － JNK 蛋白表达
则无明显差异，而且对上述蛋白通路的影响皂苷 fII 大于皂苷
I4a。见图 1。
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图 1 鹅掌草单体皂苷对 4 肿瘤细胞MAPK通路蛋白表达的影响
3 讨论
本研究发现，皂苷 fII、I4a 作用 4 种细胞 24h 后，能抑制
p38、EＲK信号通路蛋白的磷酸化，对另一条重要的丝裂原活化
蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase，MAPKs)信号通路
JNK影响较小，提示鹅掌草皂苷可以通过影响该信号通路发挥
抗肿瘤作用，在导致原癌基因表达的信号通路中，MAPKs 发挥
重要的调节作用。活化的 MAPKs可移位入细胞核，从而磷酸化
靶蛋白［6］。近期研究表明，MAPK 通路在高张盐水溶液和脂多
糖引起的 COX －2 基因表达过程中发挥重要作用［7 － 8］。MAPKs
有三种特征性亚类，分别是 EＲKs (EＲK1 /2)、JNKs (JNK 1 /2 /
3)及 p38 ［6］。其中 EＲK1 /2 在数种肿瘤细胞的 p53 依赖型凋亡
过程中发挥作用［9］，其机制为细胞核内诱导型 COX － 2 与
EＲK1 /2 形成 EＲK1 /2 － COX － 2 复合物，使得 p53 依赖型凋亡
过程变得容易;激活 JNK通路可以活化核因子 NF － kB，后者是
COX －2 的启动因子，活化后上调 COX － 2 的转录，使 COX － 2
水平升高;p38 － MAPK 作为应激活化酶，可诱导 COX － 2 蛋白
表达并提高前列腺素水平［10 － 13］，作用机制为增加 COX － 2 mＲ-
NA的稳定性［14］;直接或间接地磷酸化并激活 Sp1 /Sp3 转录因
子从而诱导 COX －2 mＲNA的转录并增加 COX －2 启动子的活
性［15 － 16］。由此可见，全面检测鹅掌草单体皂苷对肿瘤细胞中
MAPK三条主要信号通路 EＲK、JNK及 p38 的影响，对揭示其抑
制 COX －2 发挥抗肿瘤作用的分子作用机制至关重要，值得深
入研究。
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(收稿日期:2013-09-11 编辑:任婕)
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