全 文 ：·中药研究·
鹅掌草二近缘种皂苷抗肿瘤作用研究
韩林涛，方颖，李明明，杨红兵，黄芳*
(湖北中医药大学，中药资源与中药复方教育部重点实验室，湖北 武汉 430065)
* 通讯作者:黄 芳( 1973 － ) 女，副教授，研究方向:中药物质基础与作用机制研究，Tel: 15337237061，E － mail: hello_tracy@ 163． com。
基金项目:国家自然科学基金( 30870255、31000158)
关键词:鹅掌草;皂苷;抗肿瘤; MTT法;流式细胞术;丝裂原活化蛋白激酶信号通路
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1000 － 0704(2014)01 － 0065 － 02
鹅掌草(Anemone flaccida Fr． Schmidt)，植物分类学上属毛
茛科(Ｒanunculacae)银莲花属(Anemone L．)鹅掌草组(Sect．
Stolonifera (Ulbr．)Juz)多年生植物。该属植物约有 150 种左右，
世界各大洲均有分布，我国有 54 种，除海南省外，其它各省均有
分布［1 － 2］。鹅掌草为鹅掌草组的广布种，该组植物鹤峰银莲花
(A． hofengensis)、安徽银莲花(A． anhuiensis)为鹅掌草的近缘
种，分布于长江中下游地区［1］。银莲花属植物的生物活性主要
为抗肿瘤与抗炎，三萜皂苷是抗肿瘤与抗炎的活性部位［3］。本
课题组报道了鹅掌草皂苷的抗肿瘤作用［4］，而其上述二近缘种
所含单体皂苷抗肿瘤作用未见报道，本文报道了鹤峰银莲花(A．
hofengensis)、安徽银莲花(A． anhuiensis)所含单体皂苷对多种肿
瘤增殖的影响及诱导肿瘤细胞凋亡作用。
1 材料与方法
1． 1 试验药物
单体皂苷，中药资源与中药复方教育部重点实验室制，安徽
银莲花原植物采于安徽省九华山地区，鹤峰银莲花采集于湖北
省鹤峰县，由中国科学院武汉植物园袁晓博士鉴定。取各原植
物根茎 1． 0kg，经溶剂提取，D101 大孔树脂柱、硅胶柱、反相色谱
柱反复分离，从安徽银莲花得单体皂苷 3 种，经结构鉴定为已知
化合物 anhuienosides C、Ｒaddeanoside Ｒ7、Ｒaddeanin G;从鹤峰银
莲花得单体皂苷 5 种，经结构鉴定为已知化合物 Eleutheroside K、
Ｒaddeanoside Ｒ8、Ｒaddeanoside 14、flaccidoside III、cussonoside
B［5］。精密称取各单体皂苷适量，先用 DMSO 溶解，再用 PBS 稀
释至所需浓度，备用。
1． 2 试剂
二甲基亚砜 DMSO、胰蛋白酶、氯霉素、青霉素、EDTA (Am-
resco公司);ＲPM I 1640 (GIBCO公司);MTT、P I、LPS(Sigma公
司) ;胎牛血清、新生牛血清(三利生物制品厂)。
1． 3 细胞株
人宫颈癌 HeLa细胞株、人肝癌 HepG2 细胞株、人肝癌 Bel －
7402 细胞株均由武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提
供。
1． 4 仪器
SHELLＲB CO2 恒温细胞培养箱(Sheldon 公司);CK2 － TＲC
－3 倒置显微镜(Olympus 公司);SUNＲISE 酶标仪(TECAN 公
司);FACSCalibur流式细胞仪(BD公司)。
1． 5 方法
1． 5． 1 半数抑制浓度(IC50)的测定 以 MTT 法测定单体皂苷
HeLa细胞株加脂多糖(LPS)诱导 COX － 2 高表达模型、人肝癌
HepG2 细胞株、人肝癌 Bel － 7402 细胞株 4 种肿瘤细胞的抑制作
用。取对数期细胞制成细胞悬液，稀释至浓度为 5 × 104mL －1，接
种于 96 孔培养板内(HeLa 细胞株加脂多糖诱导模型则加入
LPS，终浓度 10μg·mL －1)，每孔 200μL，培养条件 37℃及 5%
CO2，24h后加入不同浓度待测样品，单体皂苷(40、20． 0、10． 0、5．
0、2． 50μmol·L －1)继续培养 24h。然后，加入 20μLMTT 溶液
(Sigma － Aldrich，Inc．，5mg·mL －1)培养 4 h。小心地移去培养
基加入 150μL DMSO。于室温下轻轻振摇 10min，以酶标仪 (Bio
－ Ｒad)测定 490 nm 处的吸收值，计算抑制率及半数抑制浓度
(IC50)。
1． 5． 2 凋亡率的测定 人宫颈癌 HeLa 细胞株、HeLa 细胞株加
脂多糖(LPS)诱导 COX － 2 高表达模型、人肝癌 HepG2 细胞株、
人肝癌 Bel － 7402 细胞株 4 种肿瘤细胞以 5． 0μmol·L －1单体皂
苷处理，共孵育 24h，未用药物处理的细胞液为阴性对照组
(Nagetive Control，NC)。0． 25%胰酶消化细胞，经 PBS 清洗后，
离心去上清，以 PI 溶液及 Anniex V 溶液染色，避光 4℃保存，室
温避光孵育 20min，以 FACS Calibur 流式细胞仪测定，CELLQuest
3． 0． 1 软件计算凋亡细胞百分率。
1． 5． 3 统计学方法 使用 SPSS11． 0 统计学软件，统计方法采
用方差分析，组间比较采用 t 检验，P ＜ 0． 05 表示差异有统计学
意义。
2 结果
2． 1 单体皂苷对体外培养肿瘤细胞形态的影响
加入皂苷的 Bel － 7402、HeLa、HeLa + LPS、HepG2 细胞均有
不同程度的受损现象。各组随总皂苷浓度增加细胞密度明显降
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湖北中医杂志 2014 年 01 月第 36 卷第 01 期
Hubei Journal of TCM JAN． 2014． Vol． 36，No． 01
低，细胞的体积逐渐变小，变形，某些细胞出现皱缩、变圆、甚至
脱落现象。
2． 2 鹅掌草单体皂苷对体外培养 4 种肿瘤细胞生长的抑制作用
安徽银莲花及鹤峰银莲花所含单体皂苷对四种细胞皆有抑
制作用，抑制作用随药物浓度增加而逐渐增强，呈剂量依赖性。
根据对肿瘤细胞的半数抑制浓度可以判断皂苷抗肿瘤能力的强
弱:IC50 ＜ 5． 0μmol·L －1作用强，10． 0μmol·L －1 ＜ IC50 ＜ 5．
0μmol·L －1作用较强，20． 0μmol·L －1 ＜ IC50 ＜ 10． 0μmol·L －1
作用较弱，可见 Cussonoside B、Eleutheroside K对所有试验的肿瘤
细胞抑制作用均较弱;Ｒaddeanoside Ｒ8 对人肝癌 HepG2 细胞株
有强的抑制作用;Ｒaddeanoside 14 对人宫颈癌 HeLa 细胞株、He-
La细胞株加脂多糖(LPS)诱导 COX － 2 高表达模型均有强的抑
制作用(见表 1)。
表 1 单体皂苷对 4 种肿瘤细胞生长的抑制作用 (珋x ± s，n = 3)
IC50(μmol·L － 1) HeLa HeLa + LPS HepG2 Bel － 7402
Anhuienosides C 7． 34 ± 1． 55 9． 33 ± 1． 46 8． 52 ± 1． 54 7． 88 ± 1． 07
Ｒaddeanoside Ｒ7 10． 27 ± 1． 39 11． 63 ± 2． 01 12． 98 ± 2． 13 9． 08 ± 1． 91
Ｒaddeanin G 8． 85 ± 1． 26 9． 74 ± 1． 81 8． 12 ± 1． 55 6． 35 ± 1． 04
Eleutheroside K 18． 54 ± 2． 25 17． 22 ± 1． 91 17． 56 ± 2． 12 16． 88 ± 1． 75
Ｒaddeanoside Ｒ8 5． 87 ± 1． 02 6． 21 ± 1． 34 3． 24 ± 0． 59 5． 10 ± 0． 87
Ｒaddeanoside 14 3． 98 ± 0． 55 4． 11 ± 0． 56 5． 64 ± 0． 68 6． 53 ± 0． 91
Flaccidoside III 6． 87 ± 1． 01 6． 57 ± 0． 97 8． 24 ± 1． 11 7． 45 ± 1． 04
Cussonoside B 19． 53 ± 2． 14 18． 64 ± 1． 89 14． 63 ± 1． 09 16． 72 ± 1． 15
2． 3 单体皂苷对体外培养肿瘤细胞凋亡的影响
在浓度为 5． 0μmol·L －1时，单体皂苷均能诱导 4 种肿瘤细
胞的凋亡。相对于其他肿瘤细胞，皂苷 Ｒaddeanoside Ｒ8 处理后
对人肝癌 HepG2 细胞株引起的凋亡率最大(27． 51 ± 2． 13%);
Ｒaddeanoside 14 对人宫颈癌 HeLa细胞株、HeLa细胞株加脂多糖
(LPS)诱导 COX －2 高表达模型凋亡影响较大(凋亡率 ＞ 20%)，
这和其对肿瘤细胞的抑制作用结果一致，说明鹅掌草二近缘种
所含单体皂苷类成分诱导肿瘤细胞凋亡可能是其抗肿瘤作用的
重要途径(见表 2)。
表 2 单体皂苷对 4 种肿瘤细胞凋亡的影响 (珋x ± s，n = 3)
凋亡率(%) HeLa HeLa + LPS HepG2 Bel － 7402
NC 0． 21 ± 0． 04 0． 20 ± 0． 05 0． 19 ± 0． 04 0． 19 ± 0． 05
Anhuienosides C 15． 11 ± 1． 66 16． 01 ± 1． 84 18． 27 ± 1． 64 17． 32 ± 1． 86
Ｒaddeanoside Ｒ7 8． 24 ± 0． 30 10． 25 ± 0． 50 12． 21 ± 1． 03 13． 87 ± 1． 28
Ｒaddeanin G 16． 55 ± 1． 21 16． 01 ± 1． 17 17． 97 ± 1． 40 18． 51 ± 1． 42
Eleutheroside K 2． 14 ± 0． 09 3． 87 ± 0． 11 7． 59 ± 0． 22 6． 12 ± 0． 20
Ｒaddeanoside Ｒ8 17． 44 ± 2． 01 19． 33 ± 1． 78 27． 51 ± 2． 13 16． 48 ± 1． 35
Ｒaddeanoside 14 26． 53 ± 2． 14 26． 51 ± 2． 24 18． 55 ± 1． 76 17． 84 ± 1． 23
Flaccidoside III 12． 57 ± 0． 88 13． 67 ± 1． 24 15． 22 ± 1． 01 14． 44 ± 0． 97
Cussonoside B 3． 45 ± 0． 15 3． 79 ± 0． 13 5． 47 ± 0． 21 6． 24 ± 0． 27
4 讨论
本研究中 MTT试验发现鹅掌草皂苷对体外 4 种肿瘤细胞生
长均有一定的抑制作用，以用流式细胞术检测鹅掌草皂苷 MTT
有效浓度下对细胞凋亡的影响，检测结果与 MTT结果基本一致。
近年来研究表明银莲花属植物具有一定的抗肿瘤作用，如多被
银莲花(竹节香附、两头尖)总苷能抑制癌的生成;口服总皂苷
200mg /kg，对艾氏腹水癌、肉瘤 S180、宫颈癌的抑制率分别为
49%，59%，84%以上［6］。多被银莲花素 A 30μg /mL对腹水型肝
癌(AH)细胞抑制率为 81%，在体外能显著抑制小鼠 S180 和腹
水型肝癌细胞的 DNA、ＲNA和蛋白质的合成，其抑制率随时间的
延长(12 － 48 h)而增加，它对 DNA 合成 48 h 的 LD50 为 21μg /
mL。经多被银莲花素 A作用后，腹水型肝癌细胞的 DNA合成不
能恢复，故其抑制似属 DNA 模板损伤型［7 － 8］。腹腔注射多被银
莲花素 A (10 mg /kg)连续 5 d，能提高小鼠血浆 cAMP 含量的
61%，从而防止细胞癌变及抑制其分裂作用［9］。西南银莲花总
皂苷中含有的 8 种齐墩果酸糖苷，其中有 3 种在体外可明显抑制
肺癌、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌及黑色素瘤等癌
细胞的生长［10］;体外实验活性最强的齐墩果酸 － 3 － O － β － D －
吡喃木糖基(1→3)－ α － L －吡喃鼠李糖基(1→2)［β － D －吡
喃葡萄糖基(1→4)］－ α － L －吡喃阿拉伯糖苷，腹腔注射和灌
胃给药均对小鼠肉瘤 S180 有抑制作用［10］。值得注意的是，与安
徽银莲花与鹤峰银莲花皂苷相类似的成分对人正常成纤维细胞
的 IC50 比对肿瘤细胞的高 10 － 35 倍［11］，所以上述两种银莲花
所含皂苷类成分对正常细胞可能不具毒性作用，但应做进一步
研究验证。
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(收稿日期:2013 － 10 － 17 编辑:邵企红)
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