全 文 ：书第 44卷 第 7期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol．44 No．7
2016年 7月 JOUＲNAL OF NOＲTHEAST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY Jul． 2016
1)国家大学生创新创业训练计划项目(201510225064)、黑龙江
省留学归国科学基金项目(LC201410)。
第一作者简介:范诸平，女，1993 年 8 月生，东北林业大学园林
学院，本科生。E－mail:2663168876@ qq．com。
通信作者:张彦妮，东北林业大学园林学院，副教授。E－mail:
ynzhang808@ 126．com。
收稿日期:2016年 1月 30日。
责任编辑:任 俐。
重瓣长寿花组织培养再生体系的建立1)
范诸平 王立雪 杨东 曹德憧 于义 张彦妮
(东北林业大学，哈尔滨，150040)
摘 要 以重瓣长寿花的茎段和叶片为外植体，利用单因子和交叉试验设计，探究了不同激素组合对叶片和
茎段愈伤组织的诱导、分化及生根的影响，以及不同栽培基质对移栽成活率的影响。结果表明:适合愈伤组织诱导
的外植体是茎段，最佳愈伤组织诱导培养基是 MS+6－BA0．10 mg·L－1 +2，4－D1．00 mg·L－1，以茎段为外植体的愈
伤组织诱导率为 100．000%;最佳的愈伤组织分化培养基是 MS+6－BA1．00 mg·L－1，增殖系数达 19．920;最佳的生
根培养基是 1 /2MS+IBA0．50 mg·L－1，生根率为 100．000%，根长 3．87 cm;最佳的栽培基质是 V(园土)∶ V(蛭石)=
2 ∶ 1，此时移栽成活率为 95．710%。
关键词 重瓣长寿花;组织培养;愈伤组织;再生体系
分类号 S682．36;Q943．1
Establishing the Ｒegeneration System for Double-flowered Kalanchoe blossfeldiana / /Fan Zhuping，Wang Lixue，
Yang Dong，Cao Dechong，Yu Yi，Zhang Yanni(Northeast Forestry University，Harbin 150040，P． Ｒ． China)/ / Journal
of Northeast Forestry University，2016，44(7):54－58．
We established an in vitro culture system of double-flowered Kalanchoe blossfeldiana using leaves and stem segments
by single and cross-over designs，and studied the effects of leaves and stems callus induction，differentiation，rooting with
different hormone combination，and the effects of survival rate with different cultivating media． The stem segments were the
most appropriate among all kinds of explants． The optimal medium for callus induction was MS medium supplemented with
0．10 mg·L－1 6－BA，1．00 mg·L－1 2，4－D in which the stems had the highest induction rate of 100．000%． The best medi-
um for callus differentiation was MS medium supplemented with 1．00 mg·L－1 6－BA，and the multiplication coefficient
reached 19．920． The most suitable rooting medium was 1 /2MS medium containing 0．50 mg·L－1 IBA． The rooting rate was
100．000% and the root length was 3．87 cm． The best cultivation matrix volume proportion was 2 ∶ 1 of garden soil and ver-
miculite with the transplanting survival rate of 95．710%．
Keywords Double-flowered Kalanchoe blossfeldiana;Tissue culture;Callus;Ｒegeneration system
长寿花(Kalanchoe blossfeldiana)是景天科伽蓝
菜属的一种多年生草本植物，具有圆锥状聚伞花序，
小花高脚碟状，花色有橙红、桃红、黄色等［1］，自 12
月份至翌年 4月份开花，花期长达 4个月，观赏价值
极高，是一种重要的室内盆栽花卉。近年来，国内外
学者主要进行了长寿花抑菌特性［2］、杂交亲和
性［3］、基因表达与调控［4－7］、无土栽培［8－11］等方面的
研究。长寿花一般采用扦插的方法进行繁殖［12］，速
度较慢且增殖系数小，一块叶片或一个茎段仅能发
育成一个植株，且繁殖方法易受季节影响，远不能满
足生产上的需求［13］。而利用组织培养的繁殖方法
不仅不受天气、季节的影响［14］，且繁殖速度快、增殖
系数高，可以为进一步的科学研究和工厂化生产奠
定基础。长寿花的很多器官、组织都可以作为外植
体进行愈伤组织的诱导、不定芽分化和植株再生，目
前的研究主要集中于叶片［12，14－18］、叶柄［19］、花
序［20］、茎段［20］、茎尖［21］等。品种及外植体类型对离
体器官的再生成苗有很大影响，不同基因型的植株
有不同的最适宜的培养基［22］。
重瓣长寿花是长寿花近年来推出的栽培新品
种［20］。该品种与其原种长寿花相比，由于花朵的
重瓣性，花色更加艳丽、观赏价值更高，因而其市
场价格高出同规格的长寿花近一倍。重瓣长寿花
自然花期长，是一种重要的年宵花卉，又因其名字
寓意健康长寿，因而具有广阔的市场发展前景［18］。
目前，国内有关长寿花离体培养的报道较多，而对
于重瓣长寿花的组织培养报道仅有两例，分别以
花序［20］和叶片［23］为外植体，建立了重瓣长寿花的
组培再生体系，尚未见以茎段为外植体诱导愈伤
组织的报道。
文中通过不同的培养基和栽培基质筛选比较，
分别以重瓣长寿花的叶片和茎段作为外植体，从愈
伤组织诱导及分化、不定芽生根到炼苗移栽，总结了
一套增殖系数高达 19．920的完整的组培繁殖方法，
可以满足大批量现代化温室生产的需求，并能在质
量上达到更高标准，同时为重瓣长寿花进一步的遗
传改良奠定基础。
DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.2016.07.012
1 材料与方法
试验材料重瓣长寿花购自哈尔滨市花卉市场，
于 2015 年 3 月 6 日选取生长健壮、无病虫害的叶
片、茎段为外植体。将剪好的外植体盛装于小烧杯
中，先用洗衣粉水冲洗 10 min，再用流水冲洗 10
min。在超净工作台中，先用 75%的酒精浸泡 30 s，
无菌水冲洗 1遍，再用 1．00%的 NaClO浸泡 15 min，
无菌水冲洗 3～5次，用无菌滤纸吸干材料表面的水
分，将外植体剪成约 1 cm2 的叶片和 1．50 cm左右的
茎段［24］。
愈伤组织的诱导:通过查阅文献，选取了 4种培
养基(表 1中 1～ 4 号)作为预试验培养基。具体方
法为将切割好的叶片和茎段外植体接种到由 6－BA
和 NAA 组合的愈伤组织诱导培养基上，置于温度
25 ℃，光照强度 3 000 lx，光照时间 16 h·d－1的条件
下进行培养。每处理 50 个外植体，重复 3 次，15 d
后统计愈伤组织诱导率并记录生长状况。根据预试
验结果，以愈伤组织诱导率高且植株生长健壮的激
素组合为参考质量浓度，又设置了一些激素质量浓
度组合(表 1)，进一步探究最适合叶片和茎段愈伤
组织诱导的激素质量浓度组合。
不定芽的分化:挑选生长健壮、质地疏松的愈伤
组织接种到 8种分化培养基(表 2)上，每处理 50 个
外植体，重复 3次，30 d后统计愈伤组织的分化率并
记录生长状况。
不定芽生根:待愈伤组织再分化形成的不定芽
长到 2 cm左右时，转入由 1 /2MS 和 NAA、IBA 组成
的 8种生根培养基中，30 d后观察生根情况并记录。
炼苗及移栽:待根生长至 2 ～ 3 cm 时，将封口膜
半打开状态放置 1 d，再完全去掉封口膜放置 1 d，在
自来水下小心冲去组培苗根部的培养基，移栽至由
V(园土)∶ V(蛭石)= 2 ∶ 1、V(园土)∶ V(珍珠岩)=
2 ∶ 1、V(园土)∶ V(蛭石)∶ V(珍珠岩)= 2 ∶ 1 ∶ 1 栽
培基质中，在温室中栽培，及时浇水，去除杂草，30 d
后统计移栽成活率。
利用 Microsoft excel软件统计分析愈伤组织诱导
率、增殖系数、生根率、生根系数和移栽成活率，利用
SPSS 19．0统计分析软件进行方差分析，利用邓肯氏
多重比较(Duncan’s multiple－range test)检验其显著
性，P＞0．05为变化不显著，P＜0．05为变化显著。
愈伤组织诱导率=
形成愈伤组织的外植体数
接种的外植体总数
×100%;
增殖系数=
外植体增殖的不定芽总数
接种的外植体总数
×100%;
生根率=
生根幼苗数
接种幼苗数
×100%;
生根系数=
生根总数
生根幼苗数
×100%;
移栽成活率=
移栽成活的组培苗数
移栽的组培苗总数
×100%。
2 结果与分析
2．1 不同质量浓度 6－BA、NAA、2，4－D组合对愈伤
组织诱导的影响
在 6－BA与 NAA共同作用下，10 d 左右叶片和
茎段外植体均产生少量较为紧实的深绿色的愈伤组
织(图 1A)，茎段外植体产生的愈伤组织量明显大
于叶片。以叶片为外植体，愈伤组织诱导率最高的激
素组合为 3 号培养基，愈伤组织诱导率为 96．670%，
叶片在接种一周后边缘处膨大，15 d 时产生深绿色
的愈伤组织，但较为紧实。以茎段为外植体，愈伤组
织诱导率最高的激素组合为 7 号培养基，愈伤组织
诱导率为 100．000%，比以叶片为外植体的愈伤组织
诱导率高 3．330%(表 1)。茎段下部在接种一周后
开始膨大并产生少量愈伤组织，继而不断膨大，自茎
段基部产生大量愈伤组织，绿色颗粒状且较为蓬松。
表 1 不同激素组合对重瓣长寿花外植体愈伤组织诱导的影响
序号
6－BA质量浓
度 /mg·L－1
NAA质量浓
度 /mg·L－1
2，4－D质量浓
度 /mg·L－1
叶片
外植体数量 愈伤诱导率 /%
茎段
外植体数量 愈伤诱导率 /%
1 2．00 0．10 0 50 (85．330±0．006)cd 50 (92．600±0．005)e
2 1．50 0．10 0 50 (89．330±0．006)bc 50 (95．330±0．006)d
3 1．00 0．10 0 50 (96．670±0．006)a 50 (98．000±0．011)bcd
4 0．10 0．10 0 50 (52．000±0．032)ef 50 (65．330±0．008)f
5 1．00 0．20 0 50 (48．000±0．021)f 50 (60．670±0．006)g
6 1．00 0．05 0 50 (56．000±0．042)e 50 (59．330±0．007)g
7 1．00 0．01 0 50 (95．330±0．006)ab 50 (100．000±0)a
8 0．20 0 2．00 50 (97．330±0．006)a 50 (96．000±0．011)cd
9 0．10 0 1．50 50 (95．330±0．006)ab 50 (98．670±0．013)bc
10 0．10 0 1．00 50 (94．000±0．019)ab 50 (100．000±0)a
11 0．02 0 1．00 50 (80．670±0．006)d 50 (90．670±0．012)e
12 0．10 0．10 1．00 50 (90．000±0．018)bc 50 (92．000±0．011)e
13 1．00 0．10 0．10 50 (94．000±0．011)ab 50 (96．670±0．006)cd
注:表中部分数据为平均值±标准差;同列不同小写字母代表 0．05水平上存在显著差异。
55第 7期 范诸平，等:重瓣长寿花组织培养再生体系的建立
A．深绿色致密状愈伤组织;B．黄绿色蓬松状愈伤组织;C．茎段诱导形成的愈伤组织分化形成的不定芽;D．叶片诱导形成的愈伤组织形成的不定
芽;E．生根培养;F．生成的大量绒毛状须根;G．以 V(园土)∶ V(蛭石)= 2 ∶ 1为栽培基质移栽形成的小苗;H．以 V(园土)∶ V(珍珠岩)= 2 ∶ 1为
栽培基质移栽形成的小苗;I．以 V(园土)∶ V(蛭石)∶ V(珍珠岩)= 2 ∶ 1 ∶ 1为栽培基质移栽形成的小苗。
图 1 重瓣长寿花叶片茎段愈伤组织诱导、不定芽分化及植株移栽
在 2，4－D与 6－BA的共同作用下，7 d左右外植
体即可产生大量黄绿色颗粒状的愈伤组织，透明蓬
松，与胚性愈伤组织的形态特征基本相符［25］(图
1B)。以叶片为外植体，愈伤组织诱导率最高的激素
组合为 8 号培养基，愈伤组织诱导率高达 97．330%
(表 1)，叶片在接种一周后边缘膨大，15 d 时产生黄
绿色透明疏松颗粒状的愈伤组织。以茎段为外植
体，愈伤组织诱导率最高的激素组合为 10 号培养
基，愈伤组织诱导率高达 100．000%，茎段在接种 10
d后下部膨大，20 d 左右时产生大量浅绿色的愈伤
组织，愈伤组织质地疏松，呈颗粒状，具备胚性愈伤
组织的基本特征。
当 3 种激素共同作用时，愈伤组织形态与所占
比例高的激素的诱导形态相一致，诱导率较两种激
素组合时均有所下降。
由表 1可以看出，3 号、7 号、8 号、10 号为诱导
率较高的 4种培养基，但是 3 号、7 号以 6－BA、NAA
为激素的培养基所诱导的愈伤组织量少且颜色深
绿，不具备胚性愈伤组织的基本特征，8 号以 2，4－D
与 6－BA为激素的培养基，其叶片外植体愈伤诱导
率小于 10 号以茎段为外植体的愈伤组织诱导率。
因此，最适合愈伤组织诱导的外植体是茎段，最适宜
的诱导培养基是 10号培养基，即MS+6－BA0．10 mg·
L－1+2，4－D1．00 mg·L－1。
2．2 不同质量浓度 6－BA、NAA、2，4－D组合对愈伤
组织分化的影响
在诱导愈伤组织再分化时，本试验共设有 MS
和 6－BA、NAA一种或两种激素搭配的共 8 种组合
(表 2)。将叶片和茎段诱导产生的愈伤组织切割成
小块后接种在 8种培养基上，10 d 左右愈伤组织上
即有不定芽长出，30 d 后统计增殖率。在 6－BA 质
量浓度为 1．00 mg·L－1时增殖系数最高，达 19．920，
不定芽颜色深绿、健壮且密集(图 1C、图 1D)。当
NAA质量浓度增高和降低都会使增殖系数降低，不
定芽叶质变软或呈水渍状。因此，最适合愈伤组织
分化的培养基是 MS+6－BA1．00 mg·L－1。
2．3 不同生根培养基对不定芽生根的影响
以 1 /2MS 为基本培养基，添加不同质量浓度
NAA和 IBA，试验结果证明(表 3)，生根培养 14 d
时，基部均有不同数量的不定根生成。随着添加
NAA和 IBA质量浓度的增加，重瓣长寿花的生根系
数均是先增加后减少。在 NAA 质量浓度为 0． 20
65 东 北 林 业 大 学 学 报 第 44卷
mg·L－1时，生根率为 100．000%，生根系数达到 12．330，
根长 1．410 cm，根系生长状况良好，黑色须根多而粗
壮，茎基部密生白色绒毛状须根(图 1E、图 1F)。随
NAA质量浓度的变化，当 NAA 质量浓度大于或小
于 0．20 mg·L－1时，根多为绒毛状根，无粗壮根，且
铺满培养基表面不能深入培养基。在 IBA 质量浓
度为 0．50 mg·L－1时，生根率为 100．000%，生根系数
达到最高，为 14．360，根长 3．870 cm，主根黑色粗壮，
且在茎基处生成新的小植株。该种培养基与 NAA为
0．20 mg·L－1的培养基相比，生根率均为 100．000%，
但该种培养基的生根系数和根长大于前者，因此是
最适合生根的培养基。
当同时添加两种激素时，生根量少，根短而细
弱。综上，最适合生根的培养基是 7 号培养基，即
1 /2MS+IBA0．50 mg·L－1。
表 2 不同激素组合对重瓣长寿花愈伤组织分化的影响
序号
6－BA质量浓
度 /mg·L－1
NAA质量浓
度 /mg·L－1
增殖
数 /个
增殖系数
1 0．10 0 801 (16．020±0．005)d
2 0．50 0 832 (16．640±0．022)c
3 1．00 0 996 (19．920±0．011)a
4 1．00 0．01 901 (18．030±0．019)b
5 1．00 0．05 798 (15．960±0．039)d
6 1．00 0．10 655 (13．100±0．015)e
7 1．00 0．20 470 (9．400±0．021)f
8 2．00 0．10 279 (5．590±0．024)i
注:表中部分数据为平均值±标准差;同列不同小写字母代表
0．05水平上存在显著差异。
表 3 不同激素组合对重瓣长寿花不定芽生根的影响
序号
IBA质量浓
度 /mg·L－1
NAA质量浓
度 /mg·L－1
生根率 /
%
生根
系数
根长 /
cm
1 0 0．50 (100．000±0)a (7．470±0．011)f (3．580±0．011)b
2 0 0．30 (98．670±0．034)b (8．660±0．016)e (1．670±0．005)e
3 0 0．20 (100．000±0)a (12．330±0．022)b (1．410±0．005)f
4 0 0．10 (100．000±0)a (10．560±0．022)c (2．760±0．011)c
5 0 0．01 (96．330±0．016)c (5．330±0．017)g (1．380±0．005)f
6 1．00 0 (54．000±0．032)f (2．090±0．012)j (0．360±0．010)h
7 0．50 0 (100．000±0)a (14．360±0．005)a (3．870±0．011)a
8 0．20 0 (87．000±0．011)d (4．230±0．015)h (0．560±0．018)g
9 0．10 0 (100．000±0)a (8．870±0．039)d (2．130±0．016)d
10 0．20 0．20 (76．000±0．030)e (2．340±0．021)i (0．340±0．016)h
注:表中数据为平均值±标准差;同列不同小写字母代表 0．05 水
平上存在显著差异。
2．4 不同栽培基质对再生苗移栽的影响
从表 4 可以看出，组培苗在 V(园土)∶ V(蛭
石)= 2 ∶ 1的基质中成活率最高(95．710%)，且植株
生长速度最快，茎粗壮，叶片大而深绿(图 1G)。在
添加珍珠岩的栽培基质中，组培苗的移栽成活率降
低，且移栽后生长状况劣于前者，株高和叶片面积均
低于前者(图 1H、图 1I)。其中，V(园土)∶ V(珍珠
岩)= 2 ∶ 1的栽培基质成活率最低，仅为 87．140%。
因此，最适合重瓣长寿花组培苗生长的栽培基质为
V(园土)∶ V(蛭石)= 2 ∶ 1。
表 4 不同栽培基质对移栽成活率的影响
栽培基质
移栽数
量 /株
成活数
量 /株
成活率 /
%
V(园土)∶ V(蛭石)= 2 ∶ 1 70 67 (95．710±0．006)a
V(园土)∶ V(珍珠岩)= 2 ∶ 1 70 61 (87．140±0．011)c
V(园土)∶ V(蛭石)∶ V(珍珠岩)= 2 ∶ 1 ∶ 1 70 63 (90．000±0．007)b
注:表中部分数据为平均值±标准差;同列不同小写字母代表
0．05水平上存在显著差异。
3 结论与讨论
不同的外植体愈伤组织诱导难易程度不同，对
重瓣长寿花来说，茎段的愈伤组织诱导率显著高于
叶片，并在培养基质量浓度为 2，4－D1．00 mg·L－1 +
6－BA0．10 mg·L－1时达到最高，为 100．000%。这与
树莓［26］、鞍杂杨［27］、食用玫瑰［28］、铁皮石斛［29］、红
网纹草［30］等研究结果一致。在试验过程中发现，茎
段产生的愈伤组织在不定芽分化、生根及组培苗移
栽阶段的表现均优于叶片。原因可能是不同外植体
所含的内源激素种类、浓度存在差异［31］，外植体所
处的生理状态、生长发育阶段不同［32－33］。利用茎段
作为外植体，愈伤组织诱导率高达 100．000%，这种
方法优于利用叶片诱导愈伤组织的方法，且重瓣长
寿花分枝较多，茎段取材较为丰富。本试验没有进
一步研究茎尖的再生体系建立效果是否高于茎段，
需在今后的试验中进一步探索。
植物生长调节剂在组织培养的过程中有着重要
的作用［34］。本试验中发现，将 6－BA与 2，4－D组合
在一起，诱导出的愈伤组织为半透明浅绿色颗粒状。
而将 6－BA与 NAA组合在一起，诱导出的愈伤组织
为深绿色，质地较为紧实，在后期的分化以及生根、
移栽等方面均劣于前者。这与 Mucciarelli et al．［35］、
Linacero et al．［36］的研究结果吻合，说明 2，4－D对于
重瓣长寿花愈伤组织诱导具有重要作用，且适宜质
量浓度的 2，4－D有利于胚性愈伤组织的形成。
段鹏慧等［23］的研究表明，利用叶片诱导生成的
愈伤组织，在 1 /2MS+6－BA1．00 mg·L－1 +NAA0．10
mg·L－1的培养基上，增殖系数可达 12．2。本试验利
用茎段诱导生成的愈伤组织，在 MS+6－BA1．00 mg·
L－1的培养基上，增殖系数可达 19．920，显著高于以
叶片为外植体的增殖系数。原因可能是不同的外植
体对不同激素质量浓度组合的反应不同，茎段较之
叶片为中度成熟器官，而中度成熟器官在分化率上
75第 7期 范诸平，等:重瓣长寿花组织培养再生体系的建立
高于幼嫩器官［37］。另外，无论MS与 NAA的质量浓
度如何，关艳清［16］、崔广荣［21］等的试验结果也表
明，最适宜的 6－BA 质量浓度是 1．00 mg·L－1，说明
在愈伤组织分化过程中，6－BA 的质量浓度选择至
关重要，原因是 6－BA 作为一种重要的细胞分裂
素，对于细胞的分裂分化以及器官的形成有着关
键作用。
不同的栽培基质对移栽成活率有影响。试验结
果表明，在 V(园土)∶ V(蛭石)= 2 ∶ 1 的栽培基质
中，移栽苗的生长状况最佳，移栽成活率最高，高达
95．710%。而在栽培基质中添加珍珠岩后，由此而
组成的两种培养基的移栽成活率均有所下降，其中
V(园土)∶ V(珍珠岩)= 2 ∶ 1 的培养基移栽成活率
为 87．140%，下降 8．570%;由 V(园土)∶ V(蛭石)∶
V(珍珠岩)= 2 ∶ 1 ∶ 1 的栽培基质移栽成活率为
90．000%，下降 5．710%。原因可能是园土和蛭石构
成的栽培基质质地较紧实，持水力大，能够贮存更多
的水分［38］，而重瓣长寿花原产非洲马达加斯加，生
长过程中也需要较多水分，因而由园土和蛭石构成
的栽培基质更能够保证重瓣长寿花移栽初期充足的
水分供应。或者是园土与蛭石构成的基质具有适合
重瓣长寿花发育的养分供应能力和酸碱度［39－40］。
参 考 文 献
［1］ 包满珠．花卉学［M］．北京:中国农业出版社，2003:137－359．
［2］ ＲATUL S，CHAITALI M，ＲAMMOHAN B． Antimicrobial proper-
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85 东 北 林 业 大 学 学 报 第 44卷