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(2007-07-16收稿)
＊通讯作者:娄建石 ,男 ,教授 ,博士生导师。
绵萆薢对去卵巢大鼠股骨生物力学
及骨形态计量学的影响
邢国胜 1 ,娄建石 2＊ ,于顺禄1 ,王志彬 1 ,师宜健 1
(1.天津医院药理室 ,天津 300211;2.天津医科大学药理教研室 ,天津 300070)
摘要 目的:探讨绵萆薢水煎液对雌性大鼠去卵巢后股骨生物力学及骨计量学指标的影响。方法:雌性未孕
大鼠随机分为假手术组 、去卵巢组 、绵萆薢高(4g/kg· d)、中(2 g/kg· d)、低(1 g/kg· d)剂量组 , 每组均为 5只。
连续给药 12周后 ,三点弯曲法测量股骨生物力学指标 , 并分别进行 HE染色 、VonKossa染色及四环素荧光标记观
察 , 以骨计量学方法分别测定骨小梁体积百分比 TBV(%)、骨小梁类骨质表面 TOS(%)、类骨质宽度 MOSW(μm)、
四环素单标表面 MdS(%)、四环素双标表面 DMds(%)、双 /单标表面比 DMds/MdS(%)、骨形成表面百分比 TFS
(%)、骨吸收表面百分比 TRS(%)、骨矿化沉积率 MAR(μm/d)、骨矿化延迟时间 MLT(d)。结果:大鼠去卵巢 3个
月后股骨的最大载荷 、挠度 、最大应变分别为 125.78±15.48(N)、1.87 ±0.22(mm)和 9.34±1.10(%),均明显低
于假手术组(P<0.05, P<0.01);各剂量绵萆薢可以不同程度地减少其最大载荷 、最大应力的降低。去卵巢 3个月
后大鼠股骨骨体积较假手术组明显降低(P<0.01),四环素单标表面 、双标表面 、双单标比及类骨质表面 、类骨质宽
度 、破骨表面 、矿化率均明显增加(P<0.01);绵萆薢中 、高剂量组的骨体积均明显高于模型组(P<0.05), 四环素
单标表面 、双标表面 、双 /单标比 、骨吸收表面 、类骨质表面 、类骨质宽度 、矿化沉积率均明显低于模型组(P<0.05),
骨矿化延迟时间稍短于模型组(P>0.05)。结论:绵萆薢在一定程度上可以增加去卵巢大鼠股骨的骨小梁体积 ,降
低骨转换率 , 改善部分生物力学指标。
关键词 绵萆薢;生物力学;骨形态计量学
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2008)02-0272-05
EffectsofDioscoreaseptemlobaontheBiomechanicalandBoneHistomorphometric
ParametersofFemurintheOvariectomizedRats
XINGGuo-sheng1 , LOUJian-shi2 , YUShun-lu1 , WANGZhi-bin1 , SHIYi-jian1
(1.TheResearchInstituteofOrthopedics, TianjinHospital, Tianjin300211, China;2.DepartmentofPharmacology, TianjinMedical
University, Tianjin300070, China)
Abstract Objective:ToinvestigatetheeffectsofthedecoctionofRhizomaDioscoreaeseptemlobae(RD)onthebiomechanical
andbonehistomorphometricparametersoffemurintheovariectomizedrats.Methods:25 femaleWistarratswithoutpregnancyandde-
liverweredividedinto5groupsrandomly:sham(sham-operation), ovariectomy(OVX), OVX+highdosageRD(4g/kg· d), OVX+
middledosageRD(2g/kg· d)andOVX+lowdosageRD(1 g/kg· d), n=5 ineverygroup.Afterintragastricadministration12-
weekperiodcontinuously, thebiomechanicalandthebonehistomorphometricparametersofthefemuroftheratsineverygroupwere
determined, respectively, includingpercentageoftrabecularbonevolume(TBV%), percentageoftrabecularosteoid(TOS%), meam
osteoidwidth(MOSW), percentageofmineralizingsurface(MdS%), percentageofdoublemineralizingsurface(DMds%), percentage
ofDMds/MdS(%), percentageoftravecularformationsurface(TFS%), percentageoftrabecularresorptionsurface(TRS%), mineral
appositionrate(MAR), mineralizinglagtime(MLT).Results:Themaximumloading, deflection, themaximumstrainofthefemurin
theOVXgroupwas125.78±15.48(N), 1.87±0.22(mm), 9.34±1.10(%), itwassignificantlylowerthanthatintheshamgroup
·272· JournalofChineseMedicinalMaterials 第 31卷第 2期 2008年 2月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.02.037
(P<0.05, P<0.01), respectively.Themaximumloadingandmaximumstresswasincreasedindifferentextentintheeverydose
groupofOVX+RD, respectively.TBV% offemurwassignificantilylowerintheOVXgroupthanthatintheshamgroup(P<0.01).
TheMdS%, DMds%, DMds/MdS(%), TOS%, MOSW, TRS%, MARwassignificantlyhigherintheOVXgroupthanthatinthe
shamgroup, respectively(P<0.01).IntheRAhighandmiddledosagegroup, theTBV%offemurwassignificantlyhigherthanthat
inthemodelgroup(P<0.05), andtheMdS%, DMds%, DMds/MdS(%), TRS%, TOS%, MOSW, MARwassignificantlylower
thanthatinthemodelgroup, respectively(P<0.05), andMLTwasdecurtatedslightly(P>0.05).Conclusion:ThedecoctionofRD
candeclinetheboneturnoverandthelossofboneoffemurintheovariectomizedrats.
Keywords DioscoreaseptemlobaThunb;Biomechanics;Bonehistomorphometry
薯 蓣科植物绵 萆薢 (Dioscoreaseptemloba
Thunb)有利湿去浊 、祛风通痹的功效 ,具有抗炎 、抗
心肌缺血 、降血糖 、降血脂等多种作用 ,临床可用于
乳糜尿 、泌尿系急性感染 、慢性支气管炎 、痛风性关
节炎等的治疗 〔1〕。其药理作用研究相对于临床使
用却较少。随着中药现代化及分析化学的不断发
展 ,已有学者开始这方面的研究 ,近年来发现绵萆薢
中具有抗骨质疏松作用的类固醇糖苷 〔2〕 ,其对去卵
巢大鼠骨代谢具有一定的改善作用 〔3〕。本实验从
骨生物力学 、骨形态与骨形态计量学方面探讨绵萆
薢对去卵巢雌性大鼠骨结构及骨力学改变的干预作
用 。
1 材料
1.1 动物 Wistar大鼠 ,清洁级 ,雌性 , 3月龄 ,体
重 248±17 g,由中国人民解放军军事医学科学院卫
生学环境医学研究所动物实验中心提供 ,二级实验
室喂养 。
1.2 药物与试剂 绵萆薢 Dioscoreaseptemloba
Thunb,产于浙江 ,购于天津市中药饮片厂 ,经天津市
药检所吴贵华副主任药师鉴定。四环素(宁波市兽
药厂 ,批号:030704)。
1.3 主要仪器 病理图文分析系统(MPIAS-2000
型高清晰度彩色病理图像分析系统 ,同济大学清平
影像公司);万能试验机(WDT-10KN,长春市长城试
验机厂);骨切片机 (Jung-k型 ,德国);荧光光学显
微镜(Olympus-BHT落射荧光型 ,日本)。
2 方法
2.1 动物分组 选取适应性饲养 2周后的 3月龄
健康未孕雌性 Wistar大鼠 25只 ,按体重随机分为绵
萆薢低 、中 、高剂量组 、假手术组和模型组 ,每组各 5
只 。
2.2 去卵巢大鼠模型的制备 各组大鼠按 2.4
ml/kg(120mg/kg)剂量肌肉注射 5%氯胺酮麻醉 ,
腹位固定 ,背部脊柱两侧腹后壁切口约 2 cm,假手
术组切除少量脂肪组织后立即关腹 ,其余各组大鼠
均切除双侧卵巢 ,结扎输卵管 ,缝合伤口。术后连续
3 d肌注硫酸庆大霉素抗感染 。按组分笼饲养 ,每
笼 5只。
2.3 实验用药的制备 将绵萆薢适量浸于水中 ,
常规煎煮后浓缩 ,使之成为 500 mg/ml的贮备药液 ,
按给药剂量稀释成供试药液 ,低温保存备用 。
2.4 给药剂量及方法 绵萆薢低 、中 、高剂量组每
天给药剂量分别为 1、2、4 g/kg。给药各组大鼠每月
称体重 1次 ,随体重调整给药量 。各组大鼠于术后
第 3 d开始灌胃给药或蒸馏水 ,每日 1次 ,连续给药
12周 ,自由摄食 、饮水 。各组大鼠于处死前 7 d和 1
d,按 25mg/kg剂量分别肌肉注射盐酸四环素 。
2.5 股骨生物力学测定 取大鼠股骨置于万能试
验机行三点弯曲试验。加载点位于股骨中段测量
处 ,两施力点间距为 20 cm,加载速度为 2 mm/min,
记录载荷 -变形曲线 、最大载荷 、最大应力 、最大应变
和挠度等值。
2.6 骨组织形态学观察 取固定于 10%福尔马林
中的大鼠股骨 ,经 10%硝酸脱钙后 ,常规脱水 、包埋
进行 HE染色 ,光学显微镜下观察骨形态学改变 。
2.7 骨组织形态计量学观察 大鼠股骨经 80%、
90%、95%梯度酒精及无水丙酮脱水 ,二甲苯两次透
明后 ,浸于体积比为 7∶3的甲基丙烯酸甲酯∶丁酯中
16h, 40℃固化后取出 ,打磨平面 ,每个标本块进行 5
μm厚的不脱钙骨连续切片 。每个标本任选其中三
张分别进行 HE染色 、vonKossa染色和四环素标记
荧光显微镜观察。其中 , HE染色用于形态学观察 ,
vonKossa染色和四环素标记观察用于骨组织形态
计量学指标的测定 。测定时每张切片于 100倍镜下
选骺板下骨小梁 ,分别于内 、中 、外三个视野取图 ,每
个视野各测 5个部位。
2.8 统计学分析 全部计量资料用 x±s表示。
数据统计采用 SPSS10.0统计软件包进行数据处
理 ,组间比较采用单因素方差分析 ,各组间比较方差
性时采用 LSD检验 。
3 结果
3.1 绵萆薢对去卵巢大鼠股骨生物力学的影响
模型组大鼠去卵巢 3个月后最大载荷 、挠度 、最大应
变均明显低于假手术组(P<0.05);3个剂量的绵萆
·273·JournalofChineseMedicinalMaterials 第 31卷第 2期 2008年 2月
薢可以不同程度提高去卵巢大鼠股骨最大载荷 、最
大应力 ,与假手术组比较无显著性差异(P>0.05)。
见表 1。
3.2 绵萆薢对去卵巢大鼠股骨组织形态学改变的
影响 经 HE染色观察发现 ,大鼠去卵巢 3个月后
股骨小梁变细 ,有扭曲和断裂 ,骨小梁短而分散 ,连
续性较差 ,密度 、面积减少 ,出现大片无骨小梁骨髓
区(图 1A);与假手术组大鼠(图 2A)比较 ,中 、高剂
量的绵萆薢组大鼠股骨的骨小梁明显增加 ,虽局部
仍呈网状 ,但可见一些不连续的骨小梁 ,部分区域骨
小梁间隙略大(图 3A)。vonKossa染色观察发现 ,
大鼠去卵巢后不仅股骨小梁间连接性差 ,而且出现
大量骨小梁盲端 ,骨小梁表面类骨质增多(图 1B);
而绵萆薢组大鼠(图 3B)与假手术组(图 2B)比较 ,
骨小梁表面类骨质较多 ,连续性也稍差 。荧光显微
镜下观察发现 ,与假手术组大鼠(图 2C)比较 ,大鼠
去卵巢 3个月后股骨骨小梁出现明显的四环素标记
线 ,双标四环素线出现较多(图 1C);绵萆薢各组大
鼠股骨骨小梁间可见四环素单 、双标记线(图 3C)。
3.3 绵萆薢对去卵巢大鼠股骨骨计量学参数的影
响 雌性大鼠去卵巢后 3个月股骨小梁骨体积较假
手术组明显降低(P<0.01),四环素单标表面 、双标
表 1 各组大鼠股骨生物力学比较( x±s, n=5)
组别 剂量(mg/kg) 最大载荷(N) 最大应力(Mpa) 挠度(mm) 最大应变(%)
假手术组 - 147.40±18.36 10.75±0.81 2.47±0.44 12.34±2.21
模型组 - 125.78±15.48■ 10.02±0.90 1.87±0.22■■ 9.34±1.10■■
绵萆薢组 1000 141.20±4.74 11.36±0.37 1.19±0.24＊＊■■ 5.96±1.21＊＊■■
绵萆薢组 2000 134.32±14.76 11.05±1.19 1.03±0.15＊＊■■ 5.17±0.76＊＊■■
绵萆薢组 4000 145.60±18.41 11.00±1.41 1.93±0.33■■ 9.65±1.65■■
注:与模型组比较:＊P<0.05, ＊＊P<0.01;与假手术组比较:■P<0.05, ■■P<0.01。下表皆同
图 1 模型组大鼠股骨骨小梁
图 2 假手术组大鼠股骨骨小梁
图 3 绵萆薢组大鼠股骨骨小梁
·274· JournalofChineseMedicinalMaterials 第 31卷第 2期 2008年 2月
表 2 各组大鼠股骨骨计量学参数的比较( x±s, n=5)
组别 剂量(mg/kg) 骨小梁体积百分比(%) 四环素单标表面(%) 四环素双标表面(%) 双 /单标表面比(%) 骨小梁类骨质表面(%)
假手术组 - 52.24±7.82 16.12±3.50 6.81±1.31 43.25±7.44 2.65±0.51
模型对照组 - 25.06±5.28■■ 22.02±4.84■■ 13.24±1.97■■ 62.39±11.04■■ 4.74±0.96■■
1000 37.48±7.74 19.50±2.37 10.72±2.06■■＊ 56.43±7.46■ 3.03±0.36＊＊
绵萆薢组 2000 43.66±7.09＊＊ 18.79±3.16＊ 9.87±2.36■＊＊ 54.44±4.69＊ 2.85±0.39＊＊
4000 45.73±6.23＊＊ 18.09±3.66＊ 9.79±2.13■＊＊ 52.56±8.45＊ 2.86±0.69＊＊
组别 剂量(mg/kg) 类骨质宽度(μm) 骨形成表面百分比(%) 骨吸收表面百分比(%) 骨矿化沉积率(μm/d) 骨矿经延迟时间(d)
假手术组 - 10.06±3.45 9.88±2.88 2.46±0.48 3.02±0.13 3.23±0.94
模型对照组 - 19.37±5.79■■ 12.62±3.76 5.94±1.78■■ 5.38±0.62■■ 3.59±0.87
1000 12.00±4.34＊＊ 15.18±3.38■ 2.73±0.78＊＊ 3.82±0.26＊ 3.06±0.67
绵萆薢组 2000 11.64±3.16＊＊ 13.88±3.68 2.60±0.82＊＊ 3.31±0.24＊ 3.63±0.96
4000 10.57±3.41＊＊ 14.67±4.36 2.55±0.71＊＊ 3.28±0.34＊ 3.22±1.04
表面 、单双比及类骨质表面 、类骨质宽度 、破骨表面 、
矿化率均明显增加(P<0.01)。绵萆薢中 、高剂量
组的骨体积均明显高于模型组(P<0.05),四环素
单标表面 、双标表面 、双 /单标比 、骨吸收表面 、类骨
质表面 、类骨质宽度 、矿化沉积率均明显低于模型组
(P<0.05),但高于假手术组(P>0.05),骨矿化延
迟时间较模型组稍有缩短(P>0.05)。见表 2。
4 讨论
骨重建是一系列发生在骨表面的细胞间相互作
用的结果 ,它包括骨吸收和骨形成两部分 ,在正常情
况下骨吸收和骨形成处于动态平衡中 ,骨量可维持
在正常范围内。骨重建过程多发生于小梁骨 ,这是
由于小梁骨虽然只占整个骨体积很少的一部分 ,但
与皮质骨相比 ,它可以提供更多的骨表面 ,因此去卵
巢后骨质疏松骨量的丢失也主要表现为小梁骨的丢
失 〔4〕。骨组织形态计量学简称骨计量学 ,其运用四
环素活体标记和不脱钙的骨切片方法 ,不仅可以测
算许多骨组织形态结构的静态参数 ,而且还可获得
骨组织的动态参数 ,是一种直接研究骨组织变化的
定量分析法 ,可提供很多新型的骨组织形态计量资
料 ,能反映骨的重建过程 〔5〕。
本实验通过骨形态学观察及骨计量学方法观察
到 , 3月龄雌性大鼠去卵巢 90d后由于雌激素缺乏 ,
使股骨骨量明显减少 ,骨小梁体积减少了 50%,并
伴随着骨吸收和骨形成的同时增加 ,显示典型高转
换型骨量丢失 ,这与绝经后骨质疏松症的特点相
似 〔6〕。而大鼠去卵巢的同时给予不同剂量的中药
绵萆薢 3个月后可以不同程度地降低股骨骨量的减
少 ,降低骨吸收与四环素单 、双标记表面 ,减少了平
均骨小梁间隙 ,提示大鼠去卵巢的同时使用绵萆薢
可以在一定程度上降低其骨转化率 ,并呈现出剂量
依赖性;绵萆薢虽可缩短骨矿化延迟时间 ,但影响不
大。由于在骨矿化延迟时间内骨基质需经历许多变
化 ,类骨质中胶原纤维分子中多肽链间的连接会增
加 ,胶原纤维的方向可任意性减少 ,磷脂和胶原间的
结合也可减少 ,为即将发生的骨矿化过程做准备 ,因
此绵萆薢对骨基质成熟期影响不大的原因可能很复
杂 ,还有待于进一步探讨 。
本实验结果显示绵萆薢可以提高去卵巢大鼠股
骨的最大载荷和最大应力 ,而对骨结构改变的干预
作用可能是其生物力学指标改变的原因之一 。既往
研究发现绵萆薢水煎液中含有薯蓣皂苷 、原薯蓣皂
苷纤维和原纤细薯蓣皂苷等成分 〔7〕 ,近年又分离出
多种类固醇糖苷〔2〕 ,这些成分是否是干预骨代谢的
有效成分有待于进一步研究 。目前绵萆薢增加骨密
度 、抗骨质疏松的作用 〔3〕尚缺乏更深入的基础研
究 ,本实验也仅就绵萆薢对雌性去卵巢大鼠股骨结
构改变的影响进行了初步的探讨 ,其对出现骨质疏
松后的作用 、对其它类型骨质疏松模型作用 、含其复
方的作用及其体外对骨代谢的作用正在进一步探讨
中。
从已进行的研究结果来看 ,中药对骨代谢的作
用可以是多靶点 、多效应的 ,不同功效的中药对骨代
谢可能具有不同程度的改善作用 ,如何开发 、运用这
些中药进行合理组方将是中药现代化的一个重要研
究课题。
·275·JournalofChineseMedicinalMaterials 第 31卷第 2期 2008年 2月
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(2007-06-22收稿)
桦木酸对 S180荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡及细胞周期的影响
张秀娟 1 ,马 悦1 ,凌莉莉 1 ,李秋实 1 ,季宇彬1 ,方桂珍 2
(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心 ,黑龙江哈尔滨 150076;2.东北林业大学材料工程技术
学院 ,黑龙江哈尔滨 150040)
摘要 目的:以 S180荷瘤小鼠为研究对象 ,研究桦木酸的抗肿瘤作用 , 旨在开发新的药物资源。方法:观察 S180
荷瘤小鼠瘤重抑制率 、利用 DNA结合荧光探针直接对肿瘤细胞 DNA染色后 FCM分析肿瘤细胞凋亡 、细胞周期的
影响以及 P53蛋白的表达率。结果:桦木酸各剂量能明显抑制 S180肿瘤细胞的生长 , 且桦木酸低 、中剂量组能够明
显增加 S180肿瘤细胞 G0 /G1期和降低 S期的肿瘤细胞数目 , 升高 S180肿瘤细胞 P53蛋白的表达率。结论:桦木酸可
能通过影响肿瘤细胞生长周期及 P53蛋白的表达诱导肿瘤细胞凋亡而达到抗肿瘤作用。
关键词 桦木酸;细胞凋亡;细胞周期;P53蛋白表达
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2008)02-0276-04
基金项目:黑龙江省自然科学基金项目(C200604)作者简介:张秀娟(1962-),女,教授 ,研究方向:抗肿瘤药物;E-mail:zxj1717@yahoo.com.cn。
桦木酸为五环三萜类化合物 ,广泛存在于植物
界 ,已有大量文章报道许多种属的植物中均有桦木
酸存在 〔1 ～ 4〕 ,主要来源是桦木树 。文献报道桦木酸
具有更多的人们所期待的药理活性 ,如抗炎 、抗癌 、
抗 HIV病毒等 〔5 ～ 10〕。但是有关桦木酸体内抗肿瘤
及机制的研究尚未见系统报道 ,因此针对其体内抗
肿瘤作用及机制进行探讨性实验研究 。
1 材料与方法
1.1 实验动物 昆明种小鼠 , 20±2g,雌雄各半 ,
合格证号:SCXK(黑)20020001,购于哈尔滨医科大
学动物中心 。瘤株 S180购自哈尔滨医科大学附属肿
瘤医院 。
1.2 实验仪器 SartoriusBS11OS型万分之一电
子天平(德国 BSS);超净工作台 (苏州净化设备
厂);LD4 -2A型台式低速离心机 (北京医用离心机
厂);流式细胞仪(EpicsXL.Mcl);光学显微镜(Lei-
ca);HH-S恒温水浴箱(天津市泰斯特仪器有限公
司);微量移液器(GilsonSAS公司);涡旋震荡器
(江苏海门麒麟医用仪器厂);300目筛网(弘博试剂
公司)。
1.3 试剂与药品 桦木酸(东北林业大学方桂珍
教授提供 , 纯度 73.87%);无水乙醇 、吐温 -80
(Tween-80)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)(天津市化
学试剂分厂六厂);环磷酰胺(CTX)(上海华联制药
有限公司 );PI(Sigma, P4170);PBS、TritonX-100、
Rnase(Sigma, R4875)、 0.1%多聚甲醛 PBS、兔抗
P53、FITC标记羊抗兔抗体(武汉博士德生物工程有
限公司);BSA(上海华舜生物工程有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 桦木酸对 S180荷瘤小鼠瘤重的影响〔11〕:选
用昆明种小鼠 ,体重 20 ±2g,雌雄各半 。将小鼠随
机分为 6组 ,每组 10只 。无菌条件下抽取接种 7 d
生长良好的 S180荷瘤小鼠腹水 ,用无菌生理盐水 1∶4
稀释 ,按 0.2 ml/只 ,腹腔接种 。接种 24 h后 ,分别
·276· JournalofChineseMedicinalMaterials 第 31卷第 2期 2008年 2月