全 文 ：710 中 国 临 床 药 理 学 杂 志
第 32 卷 第 8 期 2016 年 4 月(总第 214 期)
类叶升麻苷对 D －半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠
免疫功能及对神经元的保护机制研究
Effect of acteoside on the immunological function of sub － acute aging mice induced
by D － galactose and its protective mechanism of neuron
收稿日期:2015 － 12 － 28
修回日期:2016 － 02 － 07
基金项目:河南省基础研究基金资助项目
(122300410075)
作者简介:王国勇(1968 － )，男，副主任药师，
主要从事临床药学研究
通信作者:董铁立，主任医师
MP:13783692658
E － mail:wangguoyong1401@ 126. com
王国勇1a，董铁立1b
(1． 郑州大学 第二附属医院，a． 医学装备管
理科;b． 麻醉科，郑州 450014)
WANG Guo － yong 1a，
DONG Tie － li1b
(1． a． Medical Equipment Management
Section;b． Department of Anesthesiology，
The Second Affiliated Hospital of
Zhengzhou University， Zhengzhou
450014，China)
摘要:目的 研究类叶升麻苷(AS)对 D －半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠免疫功
能及对神经元的保护机制。方法 100 只小鼠随机分为对照组 20 例及实验组
80例，分别以 150 mg·kg －1·d －10. 9%NaCl及 D －半乳糖处理。将实验组分为
模型组、低、中、高剂量类叶升麻苷组，各 20 只，分别给予 60 mg·kg －1·d －1
0. 9%NaCl及 30，60，120 mg·kg －1·d －1类叶升麻苷处理。观察各组小鼠用药
20 d后胸腺、脾 T淋巴细胞亚群及血清、脑组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶
(SOD)表达水平。结果 模型组胸腺 T 细胞 CD3 +、CD3 + CD45ＲA +、CD3 +
CD28 +、CD3 + CD25 + 表达下降，CD3 + PD － 1 + 表达上升;脾 T 细胞 CD3 +
CD45ＲA +、CD3 + CD25 +呈下降趋势，CD3 + CD25 + Foxp3 +表达上升。中、高剂量
类叶升麻苷能够有效恢复胸腺、脾 T 细胞表达水平，改善免疫功能。模型组血
清、脑组织超氧化物歧化酶活性显著下降，丙二醛含量显著上升，中、高剂量类叶
升麻苷能够显著抑制超氧化物歧化酶与丙二醛表达水平变化，保护神经元功能。
结论 中、高剂量类叶升麻苷可通过调节免疫功能、恢复氧自由基代谢平衡，起
到保护神经元的作用。
关键词:类叶升麻苷;D －半乳糖;亚急性衰老;免疫功能;神经元;保护机制
DOI:10. 13699 / j. cnki. 1001 － 6821. 2016. 08. 012
中图分类号:Ｒ28 文献标志码:A
文章编号:1001 － 6821(2016)08 － 0710 － 04
Abstract:Objective To investigate the effect acteoside(AS)on the
immunological function of sub － acute aging mice induced by D － galactose
and its protective mechanism of neuron. Methods A total of 100 mice
were randomly divided into control group (n = 20) and test group
(n = 80)，respectively given 150 mg·kg －1·d －1 0. 9%NaCl and D － Gal
treatment. The test group divided into model group，low，medium，high
dose of AS group，20 in each group，were given 60 mg·kg －1· d －1
0. 9%NaCl and 30，60，120 mg · kg －1 · d －1 AS treatment. The
thymus，spleen T lymphocyte subsets and serum，brain tissue malondial-
dehyde (MDA)，superoxide dismutase (SOD)levels were observed after
20 d treatment. Ｒesults The expression of thymic T cells CD3 +，CD3 +
CD45ＲA +，CD3 + CD28 +，CD3 + CD25 + decreased in model group，and
the expression of CD3 + PD － 1 + increased;expression of spleen T cells
CD3 + CD45ＲA +，CD3 + CD25 + decreased，CD3 + CD25 + Foxp3 + expre-
ssion increased. Medium and high dose of AS can effectively restore the
thymus，spleen cell T expression level，improve the immune function.
The activity of SOD in serum and brain tissue of model group decreased
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significantly，and the content of MDA increased significantly. Medium and high dose of AS could significantly inhibit
the changes of SOD and MDA to protect the neuronal function. Conclusion Medium and high dose AS can regulate
the immune function and restore the balance of oxygen free radicals，playing a role of neurons protection.
Key words:acetoside;D － galactose;subacute aging;immune function;neuron;protection mechanism
阿尔兹海默病(AD)是一种中枢神经系统变性疾
病，表现为记忆功能减退、认知功能障碍等，严重者可
出现人格改变、语言障碍，社交与生活能力受到严重
影响。以 D －半乳糖(D － Gal)灌胃能够有效建立亚
急性衰老动物模型，为衰老及脑老化的作用机制及治
疗药物的研究提供便利［1］。本研究探讨类叶升麻苷
(AS)对 D －半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠免疫功能
及对神经元的保护机制。
材料与方法
1 材料
动物 SPF级昆明种小鼠 100 只，雌雄各半，体重
18 ～ 22(20. 5 ± 2. 9)g，新疆实验动物研究中心提供。
动物许可证号:SCXK(新)2003 － 0002。
药品与试剂 类叶升麻苷，纯度:92. 2%，由院内
自制。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂
盒，均购自南京建成生物工程研究所。藻红蛋白
(PE)标记的抗小鼠 CD3 单克隆抗体、异硫氰酸荧光
素(FITC)标记的抗小鼠 CD45ＲA 和 CD25 单克隆抗
体，均购自美国 BioLegend 公司。CD4 + CD25 + Tr测定
试剂盒，购自美国 eBioscience公司。
仪器 ELx800 酶标仪，美国 Biotek 公司产品;
FC500 全自动流式细胞分析仪，美国 Beckman Coulter
公司产品;Multiskan Go 全波长酶标仪，美国 Thermo
公司产品。
2 方法
2. 1 动物分组及模型制备［2］
100 只小鼠适应性饲养 7 d 后，按照随机数字表
法将其分为对照组(n = 20)及实验组(n = 80)，并将
实验组分为模型组、低、中、高剂量类叶升麻苷组，各
20 只。对照组颈背部皮下注射 0. 9% NaCl 溶液 150
mg·kg －1·d －1，其余各组颈背部注射 D －半乳糖 150
mg·kg －1·d －1，持续 90 d。自第 71 天起，低、中、高剂
量类叶升麻苷组分别给予 30，60，120 mg·kg －1·d －1类
叶升 麻 苷 灌 胃 处 理，对 照 组、模 型 组 给 予 60
mg·kg －1·d －10. 9%NaCl灌胃。
2. 2 检测指标
免疫功能检测［3］ 按参考文献［3］的方法，用流
式细胞仪对各组小鼠胸腺 T细胞重要模型分子(包括
CD3 +、CD3 + CD45ＲA +、CD3 + CD28 +、CD3 + CD25 +、
CD3 + PD －1 +、CD3 + CD196 +)和脾初始、活化及调节
性 T 细胞相关分子(包括 CD3 + CD45ＲA +、CD3 +
CD25 +、CD3 + CD25 + Foxp3 +)进行检测。
MDA含量及 SOD 活性检测［4］ 取实验小鼠血
清及组织匀浆上清 30 ～ 50 μL，按照试剂盒操作说明
检测血清 SOD活性及MDA含量。取实验小鼠脑组织
标本，以 1∶ 9 比例加入 0. 9%氯化钠溶液，制成 10%匀
浆，以 3000 r·min －1离心 10 min 后，按照试剂盒操作
说明检测脑组织匀浆上清液 SOD活性及 MDA含量。
3 统计学处理
数据用 SPSS 18. 0 软件进行统计分析。计量资料
用 珋x ± s表示，用 t检验比较。
结 果
1 各组小鼠胸腺 T细胞重要模型分子检测结果
模型组胸腺 T细胞 CD3 +、CD3 + CD45ＲA +、CD3 +
CD28 +、CD3 + CD25 +显著低于对照组，CD3 + PD － 1 +
显著高于对照组(P ＜ 0. 05)。随着类叶升麻苷剂量的
增加，胸腺 T 细胞 CD3 +、CD3 + CD45ＲA +、CD3 +
CD28 +、CD3 + CD25 + 表达水平逐渐升高，CD3 +
PD －1 +表达水平逐渐降低，中、高剂量类叶升麻苷组
与对照组比较，差异无统计学意义(P ＞ 0. 05)。各组
CD3 + CD196 + 表达水平比较，差异无统计学意义
(P ＞ 0. 05)，见表 1。
2 各组小鼠脾初始、活化及调节性 T 细胞相关分子
表达检测结果
模型组脾 T细胞 CD3 + CD45ＲA +、CD3 + CD25 +显
著低于对照组，CD3 + CD25 + Foxp3 +显著高于对照组
(P ＜ 0. 05)。随着类叶升麻苷剂量的增加，脾 T 细胞
CD3 + CD45ＲA +、CD3 + CD25 + 表达水平逐渐升高，
CD3 + CD25 + Foxp3 +表达水平逐渐下降，中、高剂量类
叶升麻苷组小鼠上述因子表达水平与对照组比较，差
异无统计学意义(P ＞ 0. 05)，见表 2。
3 各组小鼠血清 SOD活性及MDA含量检测结果
模型组血清 SOD 活性显著低于对照组，MDA 含
量显著高于对照组(P ＜ 0. 05)。随着类叶升麻苷剂量
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第 32 卷 第 8 期 2016 年 4 月(总第 214 期)
表 1 各组小鼠胸腺 T细胞重要模型分子表达比较(珋x ± s，n = 20)
Table 1 Comparison of molecular expression of T cells in the thymus in each group of mice(珋x ± s，n = 20)
Item Control Model Low dose AS Medium dose AS High dose AS
CD3 +(%) 88. 23 ± 2. 17△# 74. 37 ± 2. 16＊△ 79. 06 ± 2. 33#* 83. 51 ± 2. 17#△ 84. 08 ± 2. 66#△
CD3 + CD45ＲA +(%) 2. 95 ± 0. 49△# 2. 03 ± 0. 52＊△ 2. 39 ± 0. 38#* 2. 74 ± 0. 46#△ 2. 77 ± 0. 42#△
CD3 + CD28 +(%) 95. 39 ± 1. 26△# 91. 37 ± 1. 66＊△ 93. 36 ± 1. 82#* 94. 96 ± 1. 31#△ 94. 82 ± 1. 50#△
CD3 + CD25 +(%) 8. 82 ± 0. 53△# 7. 40 ± 0. 73＊△ 7. 93 ± 0. 46#* 8. 64 ± 0. 55#△ 8. 61 ± 0. 56#△
CD3 + PD － 1 +(%) 12. 91 ± 3. 50△# 21. 26 ± 1. 83＊△ 15. 33 ± 4. 29#* 13. 07 ± 3. 81#△ 13. 01 ± 3. 52#△
CD3 + CD196 +(%) 19. 36 ± 2. 15 21. 19 ± 1. 46 20. 08 ± 1. 44 19. 46 ± 2. 06 19. 44 ± 2. 09
AS:Acteoside;Control:150 mg· kg －1 · d －1 0. 9% NaCl;Model:60 mg· kg －1 · d －1 0. 9% NaCl;Low，medium，high dose AS:30，60，120
mg·kg －1·d －1 AS;Compared with model group，#P ＜ 0. 05;Compared with low dose AS group，△P ＜ 0. 05
表 2 各组小鼠脾初始、活化及调节性 T细胞相关分子表达比较(珋x ± s，n = 20)
Table 2 Comparison of the expression of cell related molecules in the initial，activated and regulatory T cells in each group of mice
(珋x ± s，n = 20)
Item Control Model Low dose AS Medium dose High dose AS
CD3 + CD45ＲA + 7. 39 ± 1. 05△# 4. 42 ± 1. 08＊△ 5. 48 ± 1. 17* # 7. 26 ± 1. 13#△ 7. 31 ± 1. 16#△
CD3 + CD25 + 6. 72 ± 0. 83△# 5. 19 ± 1. 36＊△ 5. 93 ± 1. 39* # 6. 50 ± 0. 85#△ 6. 61 ± 0. 92#△
CD3 + CD25 + Foxp3 + 10. 16 ± 1. 53△# 18. 39 ± 1. 45＊△ 15. 62 ± 1. 37* # 10. 03 ± 1. 26#△ 10. 14 ± 1. 38#△
Compared with control group，* P ＜ 0. 05;Compared with model group，#P ＜ 0. 05;Compared with low dose AS group，△P ＜ 0. 05
表 3 各组小鼠血清丙二醛(SOD)活性及超氧化物歧化酶(MDA)含量比较(珋x ± s，n = 20)
Table 3 Comparison of serum superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)content in each group of mice(珋x ± s，
n = 20)
Item Control Model Low dose AS Medium dose High dose AS
SOD(U·mL －1) 177. 29 ± 12. 04#△ 60. 31 ± 11. 96＊△ 96. 31 ± 9. 28* # 163. 81 ± 11. 93#△ 169. 52 ± 11. 07#△
MDA(nmol·mL －1) 5. 13 ± 1. 62#△ 5. 91 ± 1. 38＊△ 5. 70 ± 1. 03* # 5. 10 ± 1. 50#△ 5. 09 ± 1. 83#△
Compared with control group，* P ＜ 0. 05;Compared with model group，#P ＜ 0. 05;Compared with low dose AS group，△P ＜ 0. 05
表 4 各组小鼠脑组织 SOD活性及 MDA含量比较(珋x ± s，n = 20)
Table 4 Comparison of brain tissue’s SOD activity and MDA content in each group of mice(珋x ± s，n = 20)
Item Control Model Low dose AS Medium dose High dose AS
SOD(U·mg －1 prot) 214. 62 ± 9. 81#△ 110. 38 ± 7. 41＊△ 130. 61 ± 6. 54* # 162. 97 ± 18. 85* #△ 160. 39 ± 12. 54* #△
MDA(nmol·mg －1 prot) 4. 67 ± 0. 63#△ 6. 24 ± 1. 98＊△ 5. 42 ± 0. 59* # 5. 10 ± 0. 71* #△ 5. 15 ± 0. 53* #△
Compared with control group，* P ＜ 0. 05;Compared with model group，#P ＜ 0. 05;Compared with low dose AS group，△P ＜ 0. 05
的增加，小鼠血清 SOD活性逐渐上升，MDA 含量逐渐
下降，中、高剂量类叶升麻苷组 SOD活性及MDA含量
与对照组比较，差异无统计学意义(P ＞ 0. 05)。
见表 3。
4 各组小鼠脑组织 SOD活性及MDA含量检测结果
模型组脑组织 SOD 活性显著低于对照组，MDA
含量显著高于对照组(P ＜ 0. 05)。随着类叶升麻苷剂
量的增加，小鼠血清 SOD活性逐渐上升，MDA 含量逐
渐下降，中、高剂量类叶升麻苷组 SOD 活性显著低于
对照组，其 MDA 含量显著高于对照组(P ＜ 0. 05)，
见表 4。
讨 论
本研究结果显示，模型组小鼠血清组织及脑组织
SOD活性均显著下降、MDA 含量显著上升，表明衰老
模型成功建立，并提示 D －半乳糖诱导的亚急性衰老
对小鼠氧化应激平衡造成了明显影响。应用类叶升麻
苷后，3 组小鼠 SOD 活性均出现了不同程度的恢复，
MDA含量显著下降，且中、高剂量类叶升麻苷能够保证
小鼠血清 SOD、MDA水平趋于正常值，有效减轻神经元
损伤，起到神经元功能保护作用。但 3 组小鼠脑组织
SOD、MDA水平改善程度均不够理想，考虑与脑组织受
Chin J Clin Pharmacol 713
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氧化应激损伤较重，恢复较慢有关［5］。模型组脑组织
SOD活性低于血清组织，MDA含量高于血清组织，验证
了上述推论。同时，本研究结果显示，模型组小鼠胸腺
初始 T细胞数量下降、活化 T细胞数量下降，且抑制 T
细胞活化与增殖的相关细胞因子水平上升［6］，可导致
胸腺细胞凋亡增加、胸腺微环境改变，影响 T细胞的发
育，加速机体衰老进程。本研究中，模型组小鼠脾 T 细
胞 CD45ＲA、CD25表达与胸腺 T细胞水平变化类似，验
证了机体免疫系统功能改变在衰老中发挥的重要作
用。中、高剂量类叶升麻苷能够有效恢复胸腺、脾 T 细
胞表达水平，达到免疫调节作用，对抵抗衰老体征亦具
有积极意义。
参考文献:
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(本文编辑 王超群)
(上接第 695 页)
讨 论
褪黑素是一种内源性激素，血浆褪黑素水平的昼
夜差异性很大，白天血浆中褪黑素水平在 10
pg·mL －1左右，夜间血浆中褪黑素水平在 25 ～ 120
pg·mL －1，口服褪黑素片(1 ～ 10. 0 mg)后，血浆褪黑
素浓度是基线浓度的 25 ～ 800 倍［4 － 5］。将给药时间
设置为 8:00 ～ 20:00，可以避免血浆内源性褪黑素的
干扰［3］。测定血浆褪黑素方法有放射免疫法、酶联免
疫吸附法、气质法(GC － MS)、HPLC － MS /MS 法。本
试验开发的 HPLC － MS /MS 法选择性好、进样体积
小、测定时间短、前处理操作简单，血浆定量下限为
0. 02 ng·mL －1，能够满足褪黑素缓释片药代动力学
研究的血浆测定要求。
褪黑素缓释片在中国健康受试者体内的药代动
力学参数尚未见报道，外国受试者空腹、餐后口服
Circadin 2 mg 的药代动力学参数［3］ 分别如下:
AUC0 －24 h为(2. 53 ± 1. 20)，(2. 41 ± 1. 47)ng·mL
－1·h;
Cmax为(0. 43 ± 0. 21)，(0. 48 ± 0. 25)ng·mL
－1，tmax为
1. 5 h(空腹)。本试验中受试者空腹的 AUC0 －10 h为
(4. 69 ± 2. 21)ng·mL －1· h，Cmax为(1. 40 ± 0. 69)
ng·mL －1，tmax为(1. 28 ± 0. 85)h;餐后的 AUC0 －10 h为
(4. 09 ± 1. 59)ng·mL －1· h，Cmax为(1. 13 ± 0. 38)
ng·mL －1。本试验和文献［3］中的各参数比较均有较
大差异，推测有可能是人种、样本量、采血时间等因素
造成。
参考文献:
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(本文编辑 戴荣源)