全 文 ：第 24卷　第 1期　　　　　
2009年 3月　　　　　　　
　　　西　南　科　技　大　学　学　报　　　
JournalofSouthwestUniversityofScienceandTechnology
　　　　Vol.24 No.1
　　　　　Mar.2009
　收稿日期:2008-11-01
　基金项目:国家自然科学基金资助项目(29876017)。
　作者简介:赵俊(1985-),男 ,在读硕士研究生。研究方向:药用植物生物技术及天然产物 , E-mail:zhaojun312003@yahoo.com.cn。
土人参愈伤组织诱导及植株快繁体系建立
赵　俊　马　林　刘　翔　吴虹丽
(西南科技大学生命科学与工程学院　四川绵阳　621010)
摘要:以 MS为基本培养基 ,附加不同浓度的 NAA、6-BA, 研究不同激素水平对茎段 、叶片 、果实愈伤组织诱导的影
响。结果表明叶片 、茎段的愈伤组织诱导效果最好 ,出愈率可达 100%。愈伤组织在适宜培养基上能快速增殖。带
腋芽茎段在培养过程中可产生丛生芽 , 经继代培养可大量增殖。小苗在无激素 MS培养基中容易生根 , 健壮小苗经
驯化后移栽 , 成活率可达 90%。建立了土人参的快繁体系。愈伤组织诱导培养基:MS+NAA1.0 mg· L-1 +6-BA
1.0 ～ 2.0 mg· L-1;增殖培养基:MS+6-BA0.5mg· L-1 +NAA0.5 mg· L-1;丛生芽继代增殖培养基:MS+6 -
BA1.0 mg· L-1 +IAA0.1 mg· L-1。
关键词:土人参　愈伤组织　诱导　丛生芽　快速繁殖
中图分类号:Q813.1+2　　文献标识码:A　　文章编号:1671-8755(2009)01-0103-05
InductionofCalusesandEstablishmentofPlantletRapidPropagation
inTalinumpaniculatum
ZHAOJun, MALin, LIUXiang, WUHong-li
(SchoolofLifeScienceandEngineering, SouthwestUniversityofScienceandTechnology,
Mianyang621010 , Sichuan, China)
Abstract:Thestemsegment, leafandfruitofTalinumpaniculatumwereusedasexplantstoinducethe
calusesbymeansofincubatingthemonMSmediumsupplementedwithdiferentconcentrationofNAA
and6-BA.TheresultssuggestthatthebestinductionrateofthestemsegmentisfoundinMS+NAA
1.0mg·L-1 +6-BA1.0 mg·L-1 mediuminwhichthecalusesformationisfoundinitialyafterinoc-
ulating5dandmorelooseandfriablecalusisfoundafter15d.Thecalusinductionrateofstemsegment
couldreach100% aftercultured15d.TheoptimalmediumofcalusinductionforleafisMS+NAA1.
0 mg· L-1 +6-BA2.0 mg· L-1.Thecalusformationisfoundinitialyafter10 daysandthemore
caluseswouldbeinducedafter20d.TheoptimalproliferationmediumofcalusesisMS+6-BA0.5
mg· L-1 +NAA0.5 mg· L-1.Thefasciculatebudscouldbeinducedandproliferatedfromthestem
segmentwithlatentbudinproliferationmediumwithMS+6-BA1.0 mg· L-1 +IAA0.1 mg·L-1.
InMSmediumwithouthormone, therootingratewasbest.Thevigorousplantletsgrowwelaftertrans-
plantedandthesurvivalratewasupto90%.
Keywords:Talinumpaniculatum;Calus;Induction;Fascicularbud;RapidPropagation
土人参(Talinumpaniculatum)别名人参菜 、玉兰菜 、玉参等 ,为马齿苋科土人参属植物 ,原产于热带美
洲 , 我国南方各地均有栽培或野生 [ 1] 。土人参的根 、叶均可入药 ,具有健脾润肺 、止咳 、调经 、解毒消痈等功
效 [ 2] 。土人参中主要含有环烯醚萜 、三萜皂苷 、香豆素类 、挥发油和糖类等成分 [ 2-3] 。对土人参的组织培养
研究较少 ,张相岐等报道土人参经原生质体及游离单细胞能再生出完整植株 ,试管苗可开花结实 [ 4 -5] ,杨鹭
生等研究了土人参的茎尖离体培养及植株快速繁殖 [ 6] 。本研究采用土人参茎段 、叶片和果实作外植体 ,进
行了愈伤组织诱导培养以及腋芽诱导增殖培养 ,建立了以带腋芽茎段作外植体经丛生芽增殖的快繁方式 。
1　材料与方法
1.1　材料
野生土人参采自四川省甘孜州康定县 ,由绵阳师范学院罗明华博士鉴定 。材料移栽于花盆并按常规进
行水肥管理 。采集幼嫩茎段 、叶片以及刚成熟的果实作为外植体接种。
1.2　方法
将土人参嫩茎剪短在流水下冲洗 1h左右。将叶片和茎段分开 ,用体积分数为 70%的乙醇浸泡 30s,无
菌水冲洗 2次后加入 0.1%的 HgCl2处理 12min,无菌水冲洗 5 ～ 6次。待土人参果实刚成熟时 ,采集带花梗
的果实 ,亦做相同处理 。将茎段切成长约 1 cm左右的小段 ,叶片切成 0.5 cm×0.5 cm左右的方块 ,果实切
去花梗 ,无菌接种至培养基上。每瓶接种叶片 4块或茎段 3段 。以 MS为基本培养基 ,附加不同浓度的 6 -
BA和 NAA,加入 0.8%琼脂和 3%的蔗糖 ,调 pH值为 5.8。在 121 ℃, 1.05×105 Pa压力下灭菌 20 min。培
养温度 25 ±2 ℃,光照强度:愈伤诱导与增殖过程 1000 ～ 1500lx,幼苗增殖培养过程 2500 ～ 3000lx,光照时
间 12h/d。
接种后观察愈伤组织诱导的初始时间 ,每隔 5d统计 1次愈伤组织的出愈率 ,培养 25d后将愈伤组织转
入继代培养基中进行继代增殖培养 ,以后每隔 20 d继代 1次 。将从茎段外植体诱导产生的幼芽切下 ,转接
至芽继代增殖培养基中诱导丛生芽 ,以后每 30 d继代 1次进行增殖培养。继代培养过程中将已有 5 ～ 6片
展开叶 、高 5 ～ 8cm的健壮小苗转到生根培养基中诱导生根 ,再经过炼苗和移栽 ,建立快速繁殖体系。
2　结果与分析
2.1　不同激素组合对外植体愈伤组织诱导的影响
将叶片 、茎段和果实 3种外植体接种到 MS添加 6-BA和 NAA的 4种培养基上进行愈伤组织诱导。表
1为培养 25 d后 3种外植体的愈伤组织诱导情况。可以看出 ,不同外植体均能诱导产生愈伤组织 ,但诱导率
存在较大差异 ,茎段和叶片的诱导效果较好 ,果实较差。叶片除 1号培养基的诱导率较低外 ,其余 3种培养
基的诱导效果均很理想;茎段在 4种培养基上的诱导效果均较好 ,由于灭菌和接种处理方便 ,是最适合的外
植体材料;果实在所试两种培养基中 ,诱导效果相对较差 。
表 1　不同激素组合对外植体愈伤组织诱导的影响
Table1 Effectsofhormonecombinationsoninductionofcalusindifferentexplants
编号 激素浓度 /mg· L-1 　　　叶　　片　　　 　　　茎　　段　　　 　　　果　　实　　　
6-BA NAA 接种数 /块 诱导率 /% 茎段接种数 /个 诱导率 /% 果实接种数 /个 诱导率 /%
1 1.0 0.5 47 61.7 36 97.2 - -
2 2.0 0.5 55 94.5 65 89.2 - -
3 1.0 1.0 40 100.0 44 100.0 35 48.6
4 2.0 1.0 56 100.0 47 100.0 51 58.8
　　注:“ -” 表示未进行试验
2.2　愈伤组织诱导过程中的生长变化情况
不同培养基对外植体的诱导率不同 ,不同时间段愈伤组织的出愈率也不相同 。表 2、表 3分别是叶片和
茎段在不同培养时间段的出愈情况。
叶片培养 10d后开始从边缘出现颗粒状愈伤组织 ,呈黄白色 , 15 d后从叶片表面也有愈伤组织产生 ,颜
色呈黄绿色(图 1)。叶片在 4号培养基的愈伤组织诱导相对较快 ,培养 10d后出愈率即达 85.7%, 2、3号培
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养基在培养 15d后出愈率可达 90%或以上 , 1号培养基愈伤组织诱导较慢 ,诱导率也较低(表 2)。
茎段接入 5d后即可发现愈伤组织的形成 ,愈伤组织产生于茎段的两端呈哑铃型 ,颜色为黄绿色 ,少量
愈伤组织呈浅紫色(图 2)。培养 15 d后形成大量愈伤组织 ,其形态疏松 、长势旺盛。培养 20 d后少量愈伤
组织开始出现褐化现象。大多数带腋芽的茎段在激素作用下能诱导出丛生芽 ,平均有 3个单芽 ,多的有 5个
单芽。茎段在 3、4号培养基培养 5 d即可全部诱导出愈伤组织 , 1、2号培养基的出愈率也能达到 70%以上 ,
培养 15 d均能达到很好的效果(表 3)。
比较表 2、表 3结果 ,茎段的愈伤组织诱导启动较快 ,叶片稍慢一些。 3、4号培养基均适合进行叶片和茎
段愈伤组织的诱导。
表 2　叶片愈伤组织诱导的变化情况
Table2Changeofcalusinductionrateofleafatdifferenttime
编号
处 理 /mg· L-1
6-BA NAA 接种数
　　培养 10 d　　 　　培养 15 d　　 　　培养 20d　　 　　培养 25 d　　
出愈数
/个
出愈率
/ %
出愈数
/个
出愈率
/ %
出愈数
/个
出愈率
/ %
出愈数
/个
出愈率
/ %
1 1.0 0.5 47 24 51.1 25 53.2 29 61.7 29 61.7
2 2.0 0.5 55 28 50.9 49 89.1 52 94.5 52 94.5
3 1.0 1.0 40 25 62.5 39 97.5 39 97.5 40 100.0
4 2.0 1.0 56 48 85.7 51 91.1 53 94.6 56 100.0
表 3　茎段愈伤组织诱导的变化情况
Table3Changeofcalusinductionrateofstematdifferenttime
编 号 处 理 /mg· L
-1
6-BA NAA 接种数
　　接种 5 d　　 　　接种 15 d　　 　　接种 25 d　　
出愈数 /个 出愈率 / % 出愈数 /个 出愈率 / % 出愈数 /个 出愈率 / %
1 1.0 0.5 36 28 77.8 35 97.2 35 97.2
2 2.0 0.5 65 47 72.3 57 87.7 58 89.2
3 1.0 1.0 44 44 100.0 44 100.0 44 100.0
4 2.0 1.0 47 46 97.9 47 100.0 47 100.0
2.3　茎段愈伤组织继代培养与分化
将初始诱导过程中茎段上产生的呈浅黄色 、疏松易碎的愈伤组织转接到 3种培养基中进行继代增殖培
养(表 4)。结果表明 ,愈伤组织继代培养 20d后会出现不同程度的褐化 ,培养 25 d后在 1号培养基开始出
现根的分化 ,产生的根似毛状根 , 2号培养基除有少量根分化外 ,还有芽点出现 。相比之下 , 3号培养基 NAA
0.5mg· L-1 +6-BA0.5mg· L-1的效果较好 ,表现为愈伤组织生长增殖快 、质地疏松 、褐化程度轻。因
此 ,后续继代培养采用 3号培养基 ,以 20 d为周期进行转接 ,同时在培养基中添加 0.1%的活性炭 ,可以减缓
褐化现象。
105　第 1期　　　　　　　　　　　赵　俊 ,等:土人参愈伤组织诱导及植株快繁体系建立　
表 4　愈伤组织继代增殖与分化
Table4 Subcultureanddifferentiationofcalusfromstemsegments
编号 处理 /mg· L-1NAA 6-BA 愈伤组织生长与分化情况
1 1.0 2.0 　　质地致密 、生长缓慢 、根分化较多 、褐化严重 、培养一段时间后边缘呈水渍状
2 1.0 1.0 　　质地较疏松 、颜色淡绿 、有芽点产生但未见出芽 、有少量根分化
3 0.5 0.5 　　质地疏松 、生长增殖快 、褐化程度轻 、少见根芽分化
2.4　丛生芽的增殖与壮苗培养
茎段愈伤组织诱导过程中 ,产生了较多的丛生芽。每个带腋芽的茎段可产生 3 ～ 5个芽 ,将诱导产生的
芽在培养 25 d后切下 ,接种到 3种培养基中培养 。 25 d后统计芽的增殖情况(表 5)。
结果表明 ,不同浓度激素组合对芽增殖均有较明显的效应 。 6-BA1.0 mg· L-1 +IAA0.1 mg· L-1的
增殖效应最好 ,增殖系数为 3.33,诱导产生的丛生芽生长健壮 、茎较粗 、叶片肥厚;6 -BA1.0 mg· L-1 +
NAA0.1mg·L-1的增殖效果较差 ,增殖系数仅 1.75,且芽细弱 、叶片较小;而 6-BA1.0mg· L-1 +IAA0.
1 mg· L-1 +NAA0.1 mg·L-1的效果介于两者之间 ,增殖系数为 2.50 ,茎较细但叶片肥厚 。
将增殖培养得到的丛生芽分成单芽接种到 MS+6-BA1.0 mg· L-1 +IAA0.1 mg· L-1进行壮苗培
养 , 15 d左右可长成叶色浓绿的健壮小苗 。
表 5　不同激素组合对芽增殖的影响
Table5Effectsofhormonecombinationsonmultiplicationofshoot
编 号 处理 /mg· L-1
6-BA IAA NAA 接种数 /个 总出芽数 /个 增殖系数 生长势
1 1.0 0.1 0 12 40 3.33 生长健壮 、茎较粗 、叶片肥厚
2 1.0 0 0.1 12 21 1.75 芽细弱 、叶片细小
3 1.0 0.1 0.1 12 30 2.50 叶片肥厚 、茎较细
2.5　生根效果及移栽成活率
健壮小苗长到高约 5 ～ 8 cm后进行生根培养 ,其余生长细小的芽苗仍进行增殖继代和壮苗培养 ,生根培
养试验结果见表 6。
结果表明 ,不加任何激素的 MS培养基对生根最有利 ,分枝最多且粗壮 ,平均生根数达到 47条;1/2 MS
生根数相对较少 ,根较纤细 ,不利于移栽。加入 NAA的处理平均生根数虽较多 ,但分枝较少 。
生根培养 20 d后 ,在培养室内炼苗 2 ～ 3 d,将小苗从培养容器中移出 ,小心洗净根部琼脂 ,移栽到经灭
菌预处理的腐殖土中 ,盆栽 。开始时用 1/2 MS营养液浇灌 ,保持土质湿润 ,常规管理 , 30 d后统计成活率可
达 90%。
表 6　不同培养基对生根的影响
Table6 Effectsofdifferentmediumonrooting
编 号 处理 /mg· L-1 接种数 /个 总生根数 /个 平均生根数 生长势
1 MS 10 470 47 分枝特别多 ,根粗壮 , 长约 3 cm
2 1/2MS 10 183 18.3 分枝较多 、细小
3 MS+NAA1.5 10 246 24.6 粗壮 、分枝不多
3　讨论
叶片和茎段在 MS+NAA1.0 mg· L-1 +6 -BA1.0 ～ 2.0 mg· L-1培养基的愈伤组织诱导率可达
100%,这与张相岐等 [ 4]以幼茎 、叶片及花梗作外植体 ,在 MS+2, 4-D1.0 ～ 2.0 mg· L-1 +NAA0.2 mg·
L-1 +6-BA0.7mg· L-1培养基的愈伤组织诱导率为 75% ～ 90%所得到的结果相近 。由于茎段消毒灭菌
处理方便 ,诱导启动快 ,是土人参组织培养的适宜外植体 。
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茎段愈伤组织在继代增殖培养过程中出现分化现象 ,在培养基 MS+NAA1.0 mg·L-1 +6-BA1.0 ～
2.0mg·L-1中继代培养 ,愈伤组织逐渐形成深绿色较坚硬的突起 ,部分有根的分化出现。张相岐等 [ 4]的研
究结果也表明土人参在较高浓度 6-BA(1.0 ～ 3.0 mg· L-1)情况下 ,大部分愈伤组织变为暗绿色坚硬的类
型 ,部分愈伤组织表面有瘤状突起 ,但未见有根的分化。本研究出现部分根的分化 ,可能与使用较高浓度的
NAA有关。茎段愈伤组织在培养基为 MS+NAA0.5 mg· L-1 +6-BA0.5 mg· L-1增殖效果较好 ,愈伤组
织浅黄绿色 ,少见根芽分化 。而张相岐等[ 4]则认为 6-BA浓度为 0.5 ～ 0.7 mg· L-1有利于愈伤组织的分
化 ,且芽分化率最高可达 20%。至于这一明显差异具体原因不甚明确 ,有待进一步研究。
本研究利用 MS+IAA0.1mg· L-1 +6-BA1.0mg· L-1所得的丛生芽增殖系数最高为 3.33,而张相
岐等[ 4]利用 MS+NAA0.2 mg·L-1 +6-BA0.7mg· L-1幼苗增殖系数达 6.7,杨鹭生等 [ 6]利用 MS+
NAA0.05 mg·L-1 +6-BA3.0 mg·L-1增殖系数可达 20倍。差异较大的原因可能与所用外植体材料有
极大关系 ,张相岐等 [ 4]所用材料为单细胞再生的幼苗 ,杨鹭生等 [ 6]利用的是种子萌发后的茎尖 ,而我们直接
采用野生材料诱导出幼芽再进行快速繁殖 。同时 ,我们所用的野生土人参采自四川省甘孜州康定县 ,植物生
长在西部高寒山区 、生长环境恶劣 ,这也可能使得增殖系数较低。至于其它原因 ,有待进一步研究。
土人参愈伤组织诱导及继代培养后期褐化现象较明显。在培养 20 d后进行继代转接并在培养基中添
加 0.1%的活性炭 ,有助于降低褐化对继代增殖的影响 ,添加活性炭虽有一定效果 ,但仍不能完全解决褐化
问题 ,这也有待进一步研究 。从叶片或茎段诱导的愈伤组织容易进行继代增殖培养 ,培养周期短 ,有利于进
一步筛选建立细胞体系 ,进而通过细胞培养方式获得土人参有效成分。
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