全 文 ：seizure)指标。实验前 , 预选具有强直性发生的小鼠 42 只随机
分成 4 组 ,连续灌胃给药 3 天 , 在末次给药 1 小时后每组小鼠给
预选时的参数的电刺激 , 观察记录小鼠惊厥反应 , 结果表明莪
术油在 500mg/ kg 、300mg/kg剂量组时对小鼠的 MES 有显著的
对抗作用 ,见表 1。
　　表 1　莪术油对小鼠 MES的对抗作用
组别 剂量(mg/ kg)
实验鼠数
(只)
惊厥鼠数
(只) P 值
吐温-80 12 12
莪术油 500 10 0 <0.01
莪术油 300 10 3 <0.01
莪术油 150 10 7 >0.05
2.2　莪术油对回苏灵致小鼠惊厥的影响　小鼠 40 只随机分 4
组 ,连续灌胃给药 3 天 , 在末次给药 1 小时后各组 ip 0.08%回
苏灵 0.1ml/ 10g ,记录小鼠发生强直性惊厥的时间及惊厥发生
率 ,观察时间为 20 分钟。结果表明莪术油在 500mg/ kg 剂量组
时 ,对回苏灵所致小鼠的惊厥有显著的对抗作用 ,见表 2。
　　表 2　莪术油对小鼠回苏灵致惊厥的影响
组别 剂量(mg/ kg)
实验鼠数
(只)
惊厥鼠数
(只) P 值
吐温-80 10 10
莪术油 500 10 0 <0.01
莪术油 300 10 5 <0.05
莪术油 150 10 7 >0.05
2.3　莪术油对小鼠氨基脲致惊厥的影响[ 2] 　小鼠 36 只随机
分 4组 , 连续灌胃给药 3 天 , 在末次给药 0.5 小时后 , 各组 ip 氨
基脲 200mg/ kg ,记录小鼠发生惊厥的时间及惊厥发生率。惊厥
指标为首次出现跳跃或奔跑 , 观察时间为 1 小时。结果表明莪
术油不能对抗氨基脲致惊厥 , 但在 500mg/ kg 组能延长发作潜
伏期 ,见表 3。
2.4　莪术油对小鼠的自主活动的影响　小鼠 46 只随机分 4
组 ,连续灌胃给药 3 天 , 在末次给药 1 小时内进行测试 , 室温
25℃,测试时间在 10:00 ～ 11:30 , 将小鼠放入自主活动计数器
中 ,适应 3min , 记录 5min 内小鼠自主活动数 , 结果表明莪术油
在 500mg/ kg和 300mg/kg 组有镇静的趋势 ,见表 4。
　　表 3　莪术油对小鼠氨基脲致惊厥的影响( x±s)
组别 剂量(mg/ kg)
实验鼠数
(只)
惊厥鼠数
(只)
潜伏期
(min) P 值
吐温-80 12 12 42.8±7.9
莪术油 500 12 12 51.0±10.4 <0.05
莪术油 300 12 12 47.3±18.4 >0.05
　　表 4　莪术油对小鼠的自主活动的影响( x±s)
组别 剂量(mg/ kg)
鼠数
(只)
5min活动次数(次)
给药前 给药后
吐温-80 12 323.33±90.97 323.83±71.08
莪术油 500 12 280.16±61.46 261.25±67.47
莪术油 300 12 345.50±83.66 320.75±81.76
莪术油 150 12 288.70±102.23 283.7±114.3
3　讨论
　　本研究表明 ,莪术油能对抗多种实验性动物惊厥。因为癫
痫是脑部神经元异常放电所致的暂时性中枢功能失常 , 莪术油
能对抗 MES 和回苏灵惊厥作用 , 提示对脑部神经元异常放电
有抑制作用。氨基脲是谷氨酸羧酶的抑制剂 , 可减小脑内抑制
性递质 GABA 的合成 ,使中枢的兴奋性递质作用相对增强而致
惊厥 ,而本实验莪术油可明显延长小鼠氨基脲惊厥的潜伏期 ,
提示莪术油有可能通过影响脑干的神经功能而使皮层兴奋性
阈值提高 ,而达到对抗癫痫。
参考文献
1　王浴生 ,邓文龙, 薛春生, 主编.中药药理与应用.人民卫生出版社 ,
1998∶952
2　任利兵 ,温玉梅 ,等.松寿丹对小鼠中枢神经系统的作用.张家口医学
院学报, 1997;14∶9
铁筷子多糖诱导小鼠 S180细胞凋亡的实验研究
张　勇　王晶宇　刘　昕
(兰州医学院病理生理教研室　兰州　730000)
　　提　要　目的:观察铁筷子多糖(HFPS)诱导小鼠 S180细胞凋亡的作用。方法:M TT 比色法检测 HFPS 对小鼠原代腹水型 S180
肉瘤细胞的生长抑制效应 ,应用光镜 、激光共聚焦显微镜 、DNA 凝胶电泳和流式细胞术研究 HFPS 诱导 S180细胞凋亡的作用。结
果:MTT 检测结果显示 HFPS 可以有效抑制 S180细胞生长 , 作用呈时间和剂量依赖性。光镜 、激光共聚焦显微镜观察凋亡细胞的形
态学变化 ,表现为核固缩 、碎裂 、染色质边集 、凋亡小体形成等。 DNA 凝胶电泳可见以 180bp 倍数裂解的 DNA 梯形电泳带出现 , 同
时随药物浓度的升高 ,细胞周期 S 期比例下降 , G0/G1 期比例上升 , PI 增殖指数下降。结论:铁筷子多糖可诱导 S180肿瘤细胞凋亡。
　　关键词　铁筷子多糖;细胞凋亡;肿瘤 S180
　　国外曾报道铁筷子(Hellborus thibeanus Franch.)中噎根草
甙及甙元能抑制人上皮癌 KB 细胞的生长[ 1] 。本室以往的研究
证实从铁筷子根茎中提取出的多糖成份铁筷子多糖(HFPS)在
体内 、外实验均显示其对人和鼠类恶性肿瘤生长有抑制作
用[ 2 , 3] ,并初步证实 HFPS 的体内抑瘤效应与其调节荷瘤鼠机
体免疫力及抗氧化能力有关[ 4 ～ 6] 。 本实验利用体外细胞培养
体系观察了 HFPS 对小鼠原代腹水型 S180细胞的促凋亡作用。
1　材料与方法
1.1　试验药物　铁筷子采于甘肃甘南地区 , 经兰州医学院药
用植物教研室赵汝能教授签定 , 由药物化学教研室提取出多糖
成份 ,为易溶于水的棕褐色粉末 , 临用前用 RPMI 1640 培养液
配成实验所需的六种不同浓度 ,针型抽滤器灭菌后 4℃保存。
1.2　肿瘤细胞株　小鼠肉瘤 S180细胞由兰州医学院药学院药
12 中药药理与临床 2004;20(3)
DOI :10.13412/j.cnki.zyy l.2004.03.008
理教研室提供。
1.3　主要试剂　RPMI1640 培养基:GIBCO 公司产品 , 使用时
配成含 10%新生小牛血清的完全培养液;新生小牛血清:杭州
四季青生物工程公司 ;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、凋亡细胞 DNA
提取试剂盒:上海华舜生物工程公司;吖啶橙(AO)碘化丙锭
(PI):SIGMA公司
1.4　方法
1.4.1　HFPS 对肿瘤细胞增殖的影响　采用 M TT 比色法 。将
S180瘤株复苏并经小鼠腹腔传代 3 次后 , 取对数生长的瘤细胞 ,
用含青链霉素 1×105U/ L 的 RPMI 1640 完全培养液制备细胞
数为 1×108/ L 的细胞悬液 ,接种于 96 孔板内 ,每孔 100μl ,实验
组分别加入 6 种不同浓度的铁筷子多糖(0.2 、0.4 、0.8、1.6 、3.
2 、6.4g/ L)各 ,对照组加入等量 RPMI 1640 完全培养液 ,空白组
只有培养基而无细胞。每组设 8 个复孔 , 在 37℃ 5%CO2 饱和
湿度的培养箱中培养。分别于 12、24 、36 及 48h 时间段在各组
培养板中加入 MTT 溶液(5mg/ ml)10μl/孔 ,继续培养 4h ,终止
培养前每孔中再加入 10%SDS(用 0.01mol/ L HCl配制)100μl ,
37℃过夜。最后用酶标仪于 570nm 波长下测定吸光度值 ,共重
复 3 批。
1.4.2　HFPS 诱导细胞凋亡的形态学观察　光镜:实验分组及
药物诱导浓度 、诱导时间同前。于作用后 12 、24 、36 及 48h 分别
收集 S180肿瘤细胞 , 离心涂片 ,HE 染色 ,光镜下观察细胞形态学
改变及其特征。
　　激光共聚焦显微镜:收集药物处理不同时间段的 S180细胞 ,
PBS 洗涤 3 次 , AO 染色 , 激光共聚焦显微镜下观察照相。
　　细胞总 DNA 提取及琼脂糖凝胶电泳:按试剂盒说明进行
1.5%琼脂糖凝胶电泳 , 在凝胶成像分析系统下观察并照相。
　　流式细胞术分析(FCM):收集 1×106 个细胞 , 经冷 PBS 洗
2 次 ,冰冻的体积分数为 70%的乙醇固定 , 4℃过夜 , PI 染色 ,
FCM 检测 DNA 含量。
2　结果
2.1　HFPS 对 S180细胞增殖的影响　表 1、表 2 结果显示 ,不同
浓度铁筷子多糖对 S180细胞生长均有一定抑制作用 , 且呈时间 、
剂量依赖性 ,细胞生长抑制率随铁筷子多糖浓度的增加 、作用
时间的延长而增高。
　　表 1　HFPS作用于 S180细胞 48h的 M TT 结果分析( x±s , n=8)
药物浓度(g/ L) A570　　 抑制率(%)
0 0.24±0.06 0
0.2 0.23±0.17＊ 5
0.4 0.20±0.13＊＊ 17
0.8 0.11±0.04＊＊ 54
1.6 0.06±0.02＊＊ 75
3.2 0.04±0.016＊＊ 83
6.4 0.02±0.01＊＊ 92
　　与对照组比较 ＊P<0.05 , ＊＊ P<0.01(下同)
　　表 2　3.2g/ L HFPS作用于 S180细胞不同时间的M TT 结果分析( x
±s , n=8)
作用时间 对照组(A570) 实验组 A570　 抑制率(%)
12 0.22±0.08 0.20±0.028＊ 9
24 0.32±0.07 0.21±0.013＊＊ 34
36 0.27±0.10 0.11±0.03＊＊ 59
48 0.24±0.06 0.04±0.016＊＊ 83
2.2　HFPS 诱导肿瘤细胞凋亡的形态学观察　光镜及激光共
聚焦显微镜:S180细胞经铁筷子多糖诱导 12h 后即可见较多的
凋亡细胞 ,表现为细胞皱缩 , 体积变小 , 细胞膜基本完整但有出
泡现象 ,核浓缩 , 核碎裂 ,核溶解 , 出现凋亡小体。对照组细胞大
小不一 ,异型性明显 , 胞浆少 , 细胞核大 , 核浆比例显著失调 , 核
分裂像多见 ,偶见凋亡的细胞。见图 1、2所示。
　　DNA 凝胶电泳:经铁筷子多糖处理的 S180细胞 , 在 DNA 琼
脂糖凝胶电泳中显示出梯状降解条带。
　　FCM 分析 S180DNA 含量:经不同浓度铁筷子多糖处理的
S180细胞 , G0/G1期比例随药物浓度的增高而增高 , 而且 S 期比
例下降 , G2/M 期比例变得较为稳定 , 肿瘤的增殖指数 PI 值亦
随浓度的升高呈下降趋势。表明铁筷子多糖可使 S180细胞过长
阻滞在 G0/ G1 期 , 即使细胞增殖活动受到抑制 ,见表 3。
　　表 3　HFPS作用 24小时后对 S180细胞周期和增殖指数的检测结果
药物浓度(g/ L) 细胞周期(%)
G0/G1 S G2/m
PI
(%)
0 21.1 46.9 32.1 79.0
0.4 32.6 44.0 23.4 67.4
0.8 37.2 40.9 21.9 62.8
1.6 38.1 36.3 25.6 61.9
3.2 41.6 37.5 21.0 58.5
6.4 55.4 31.8 12.8 44.6
3　讨论
　　人们意识到肿瘤的发生不仅与细胞的增殖有关 , 而且与细
胞正常的程序性死亡受到抑制 , 从而使已转化的细胞的生存期
限延长有关 ,因此细胞凋亡在肿瘤的发生发展中扮演着重要的
角色 ,即肿瘤的发生是由于细胞增殖与细胞凋亡平衡失调的结
果[ 7] 。细胞凋亡受阻是癌形成的重要原因[ 8] 。目前通过细胞
凋亡途径诱导肿瘤细胞死亡 ,已成为肿瘤研究的热点之一。
　　目前 ,研究细胞凋亡的方法很多 , 归纳起来可分为三个方
面 ,即细胞凋亡的形态学特征 、生化特征及分子生物学方法 , 早
在 1972 年 Ker r等就从形态学上对细胞凋亡进行了详细的阐
述[ 9] ,即细胞在凋亡过程中细胞染色质凝缩 ,胞体皱缩 , 胞膜不
断出芽形成质膜小泡 ,最终脱落形成数个大小不等的由膜包裹
的凋亡小体。凋亡的主要标志是内源性 Ca2+-Mg2+依赖性核
酸内切酶被激活 ,特异性地在核小体连接区把 DNA链切断 , 使
染色体 DNA 降解成核小体单位长度的整倍数 , 从而在琼脂糖
凝胶电泳上呈现规则的间断的阶梯状条带。 流式细胞仪利用
DNA 结合荧光染料使细胞 DNA 染色 , 利用各期细胞 DNA 含量
的差异 ,获得不同强度的荧光信号进行细胞同期分析 , 同时能
反映细胞的某些特性。
　　本实验经 HE染色 、激光共聚焦显微镜 、琼脂糖凝胶电泳 、
流式细胞仪检测 ,发现铁筷子多糖诱导原代 S180细胞凋亡时发
13中药药理与临床 2004;20(3)
生的形态与生化特征等和文献报道的细胞凋亡的特征性变化
基本一致 ,通过流式细胞仪观察到铁筷子多糖使 S180细胞阻滞
于G0/ G1 期 ,从而抑制了细胞的增殖活动。实验证明铁筷子多
糖具有诱导原代 S180细胞凋亡的作用 , 从这个角度论证了了其
体外抗肿瘤作用的机制。
参考文献
1　郭晓庄.有毒中药大辞典.天津科技翻译出版 , 1992∶435
2　刘昕 ,王振军 ,王晶宇.铁筷子多糖对荷瘤机体细胞因子产生的影响
及其抑瘤作用的电镜观察.中药药理与临床 , 2003;19(6)∶13
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效应的观察.兰州大学学报(自然科学版), 2000;36∶57
4　刘昕,杨林西 ,潘兴斌 ,等.铁筷子多糖抑制小鼠体内 S180生长作用
及机制的实验研究.中国现代药学杂志 , 2001;1∶94～ 96
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临床药理 , 2000;4∶213
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8　张之南 ,潘华珍.细胞凋亡与血液病中华血液学研究, 1996;17(5)∶
267～ 270
9　Kerr JF , Wyllie AH , Cu rrie AR.Apoptosis:a basic biological phe-
nomenon w ith w ide-range implications in ti ssue kinet ics.Br J Cancer , 1972;
26(4)∶239～ 257
An experimental study on induced apoptosis of mice S180 cell by HFPS(铁筷子多糖)
Zhang Yong , Wang Jingyu , Liu Xin
(Department of Pathophy siology , Lanzhou Medical College , Lanzhou　730000)
　　Objective:To observe the effect of HFPS inducing apoptosis on mice sarcoma 180 cell.Method:MTT colorimetry w as used fo r ex am-
ining the proliferation inhibition effects of HFPS on original S180 cells.The cells apoptosis sta te w hich was induced by HFPS was detected
using light microscopy , confocal laser scanning microscopy , flow cy tometry and DNA agarose gel electrophoresis.Results:The results of
M TT colo rimetry show ed that HFPS could restrict S180 cell proliferation evidently , which depend on the dose and time of HFPS , the apopto-
sis ratio would increase w ith time leng thening and concentration of HFPS , and would appear PI and S phase decreasing as well as G0/G1
phase increasing.One examining with light microscopy and confacal laser sacanning micro scopy apoptosis cells showed typical morphological
change of apoptosis.Apopto tic cells displayed ladder bands w hen measured by agarose gel electropho resis.Conclution:HFPS could induce
apoptosis in cells of mice S180.
Key words　HFPS(铁筷子多糖);apoptosis;tumor S180
辛夷提取物对变应性鼻炎 、P 物质及其受体 mRNA 表达的影响
徐群英　董　淳　洪俊荣1
(暨南大学医学院第二附属医院　518020 , 1广东汕头市药品检验所　515041)
　　提　要　目的:比较辛夷超临界萃取物(XY-SFE)和水蒸气蒸馏提取物(XY-WVD)对豚鼠变应性鼻炎(Allergic Rhinitis , AR)
模型的治疗作用和 P物质(Substance P , SP)及其受体(Substance P Recepto r , SP-R)mRNA表达的影响。方法:以卵白蛋白(Ovalbu-
min , OV)为致敏原 ,用豚鼠复制人类AR模型 ,观察症状及鼻粘膜病理状况以研究XY-SFE 对豚鼠AR的治疗作用;放免法测定鼻腔
分泌物中 SP 浓度 ,逆转录-多聚酶链反应(reverse transcriptive polymerase chain reaction , RT-PCR)测定鼻粘膜中 SP-R mRNA 含量以
研究 XY-SFE 对 SP/ SP-R分泌及表达的影响。结果:两种提取物均能有效改善豚鼠 AR症状 ,减轻鼻粘膜病理性改变 , 调低 SP/ SP-
R mRNA 分泌及表达。结论:辛夷超临界萃取物和水蒸气蒸馏提取物对人类 AR可能有类似的治疗作用 ,且其作用机制与调低 SP/
SP-R分泌及表达有关。
　　关键词　辛夷;超临界萃取;变应性鼻炎;P 物质;P 物质受体
　　辛夷(Flo s Magnoliae)其有效成分目前认为主要为挥发油 ,
包括α-松油二环烯 、桉油精 、胡椒酚甲醚 、丁香油酚 、黄樟醚等 ,
通常采用水蒸气蒸馏法提取 ,得率约为 1 ～ 2%。 超临界流体萃
取技术(Supercritical fluid ex traction , SFE), 能大幅度提高提取
率 ,其提取物与传统的水蒸气蒸馏法提取物成分在种类和含量
上均有所不同。我们采用 CO 2 超临界萃取技术(Supercritical-
CO2 fluid extraction , CO2-SFE)提取了辛夷挥发性成分(XY-
SFE), 与水蒸气蒸馏法提取物(XY-WVS)对比研究其对 AR 的
治疗作用及其机制。
1　材料与方法
1.1　试验药物　辛夷购自深圳市药材公司 ,鉴定为木兰科植物
望春花(Magno lia biondii Pamp.)的干燥花蕾。 采用德国 KUL-
1L 型小型 CO2 超临界萃取装置 , XY-SFE 得率 4.2%;水蒸气蒸
馏装置获得的 XY-WVS 得率 2.3%。
1.2　动物　豚鼠 , 由广州中医药大学实验动物中心提供(粤动
14 中药药理与临床 2004;20(3)