全 文 ：第 9卷第 5期
1 9 93年 1 0月
生 物 化 学 杂 志
C h in e s e B io e h em i e a l J o u r n a l
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O e t
.
, 1 9 9 3
括楼素的纯化及其免疫毒素的制备
王润华 郑 硕 带 沈倍奋
( 军事医学科学院基础医学研究所 , 北京 1 0 0 8 5伪 * 防化研究 院四所 , 北京 )
摘要 利用凝胶过滤及离子交换层析从 T r `e h o s a o t h e s 瓦f r f l o w I’ i M a x im o切 i e 二 种子
中分离 出一种核格体失活蛋白 , 称之为括楼素 ( rT i c h o k ir n) 。 这种毒素在无细胞体
系中对蛋白质生物合成具有明显的抑制活性 而对 完整细胞的毒性很低 。 与单克隆杭
体偶联后 , 括楼素对北细胞显示 了明显的特异性 细胞毒作用 。
关锐词 : 括楼素 , 核糟体失活蛋白 , 免疫毒素
核糖体失活蛋白是普遍存在于植物组织中的毒素蛋白 , 它们分为两类 〔” 。 I 类核糖体失
活蛋白是分子量在 30 k D 左右的呈碱性的单链蛋白质 , 或称单链毒素 , 如肥皂草素 ( s a P or in) ,
n 类核糖体失活蛋白是由 A 、 B 两条肤链通过二硫键连接而成的完整毒素 ,如蓖麻毒素 (r ic n) ,
其中的 B链具有凝集素作用而 A 链与已发现的大多数单链毒素一样 , 是一类特殊的 R N A N -
糖昔酶 〔 2 ’ 。 ” 2 ’ ` 3 ’ , 能使真核细胞核糖体 60 5 亚基失活从而抑制其蛋白质合成 。 此外 , 单链毒素
还具有抗病毒活性及引产活性 。 与杭体交联后 , 单链毒素能特异性地杀伤靶细胞从而在导向
治疗中有广泛的应用价值 “ ’ 。
从 T r i c h o s a n `h e s 瓦`r i l o切 i` M a x ￡。 o 。 `e 二 根茎中提 取出的一种单 链 毒 素 天 花 粉 蛋 白
(t ir
o
ho sa nt ih )n 在中医临床上用于中期妊娠引产 , 目前还用于治疗艾滋病 s[] 。 本文从该植物
的种子中分离到另一种单链毒素 , 称之为括楼素 (t r i o h o ik r in ) , 检测了这种毒素对无细胞体系
中蛋白质合成的抑制效应以及制备成免疫毒素后的体外特异性细胞毒性 。
材 料 和 方 法
T 八 e h o s a o t h e s k i r 坛孟。丽云M a x f二 o阳 : e : 种子购自北京中医研究院中药所 。 兔网织红细胞 裂
解液由本室按常规方法制备 。 抗人 T 淋巴细胞单克隆抗体 H 65 (C D )S 由本室制备并经 rP ot e in
A一 S e P h a r o s e C L 一4B 亲和柱纯化 , 属 lg G : 亚类 。 M o h 一 4 细胞属人 T 淋巴母细胞系 , 弓}自英国
皇家肿瘤基金会 。
收稿 日期 . 19 9 2 一 0 7一 2 0 , 修 回 日期 : 19 93 一 0 2 0 8
5 8 6
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1993. 05. 015
` 、 单链鑫案的分离纯化
按 Bar b ir ei L等的方法 ` 6,稍作改动从 7’ r ` e入o s a n t h e s 无密r i l o碗 1 M a x i fn o 碗。二种子中分离
括楼素。 按金善炜等的方法 川从该植物的根茎中分离夭花粉蛋白。纯化后的单链毒素用 S D S -
聚丙烯院胺凝胶电泳检侧 , 成层胶浓度为 7 . 5 % , 分离胶浓度为 10 % 。
二 、 蛋白含 , 测定
用 L O w yr 方法 `幻 测定单链毒素的蛋白含量 , , 以 B s A 作标准 。 -
三 、 无细胞体系中蛋白质合成的测定 [ ’ 】
用 3 H一 e “ 参人测定单链毒素对兔网织红细胞裂解液中蛋白质合成的抑制活性 。
四 、 免度雍案的制备 10[ 了
10 m g 单链毒素与 5 倍过量 (克分子比 )的 2一亚氮基四氢噬吩 (2 一T) 于室温反应 l h 后再
加人 E l l二 a n 试剂使之终浓度达到 2 . 5 , m o l / L ,继续反应 3 0 m i n后 ,反应物过 S e P五a d e x G一 2 5柱
( 1
.
4 x ls
o m )除去未反应的小分子物质 , 收集第一个流出的蛋白峰为硫醇化的毒素 。 s m g H 65
抗体加人 10 倍过量 (克分子比 ) 的 2一 IT 于室温反应 户 ,在 S eP 五a d e x G一25 柱上脱盐后立即加
到硫醇化的毒素中 , 继续反应 2五后用马来酞亚氨终止反应 , 反 应 物 用 s eP h ac r yl s 一 20 柱
( 1
.
9 又 9 5 e m )纯化 。
五 、 免度毒案的体外细胞毒性测定
用 M T T (唾哇蓝 )方法 【川 侧定括楼素及其免疫毒素的体外细胞毒性 。
结 果
一 、 括楼案的分离纯化
括楼种子的磨碎粉 3 0 0 9 加人 3 0 0 0 m L含 o . i 4 m o l / L N a C I的 s m o o l / L磷酸缓冲液 ( P B ) ,
p H 7
.
2 浸饱过夜后 , 过滤 ,调整滤液 PH为 4 . 0 , 过快速 S一 s e Ph a r o s e柱 ( 2 . 6 x 1 0 e m ) ,用 l o m o o l /
ě已侣日己甘ē`Zé
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加 韵 40 印
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.
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一 e x e h a n g e e h r o m a t o g r a p h i e .
o f fr a e七i o n P 一 2 o n C M一 S e Ph a r o o e
587
L醋酸缓冲液 , P甘 4 . 5平衡及洗脱杂蛋白后 , 再用含 l m o l/ L N a亡1的 s m m o l/ L P B , Pn 7 . o洗
脱 , 流出物中加入 90 % 饱 和 硫酸按沉淀 。 沉淀过滤后 , 对 s m m ol / L P B , P H 7 . O透析 , 过
se Ph a d e x G一 75 柱 (2 . 6 x 7 5 o m ) , 用同样缓冲液平衡及洗脱 , 收集第二个流出的蛋白峰 ( iF g .
1 )
,再过 CM 3 2一S e Ph a r o s e 柱 ( 1 . 6 x 2 0 e nz ) , 用含 0一
2 0 0~
0 1/ L N
a c l 的 5 o m o l / L p B , PH 7 . 0 洗脱 ,
收集第二个流出的蛋白峰 ( iF g . 2 ) ,对蒸馏水充分透
析后 , 浓缩 、 冻干 , 20 ℃ 保存 。 括楼素在 s D s一聚丙
烯酞胺凝胶电泳图谱上表现为单一蛋白区带 , 其分
子量为 一2 9 k D , 加人 l % 2一疏基乙醇 , 电泳带的形状
和位置不变 , 见 iF .g 3 。
F 19
.
3 S D S
一
P A G E o f 七r i e h o k i r i n
1
.
t r i e h o s
a n t h i n
,
2
. 七r i e h o k i r i n ,
3
.
s t a n d a
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r o t e i n 台
二 、 单链毒素对无细胞体系中蛋白质合成的抑
制作用
3H 一 le u 参入表明 , 括楼素及天花粉蛋白对兔网
织红细胞裂解液中蛋白质合成具 有 明 显 的抑制冷
应 , 它们使蛋白合成抑制 5 0%所需浓度 (I C 50 )分别
为 1 . 1 x 1 0 一 ` 0 m o l / L 及 0 . 5 又 1 0 一 ’ ” m o l / L ( F i g . 4 ) 。
三 、 免疫毒素对靶细胞的特异性毒性作用
括楼素及天花粉蛋白通过 2一 IT 与识别人 T 淋巴细胞表面 c D S 抗原的单克隆抗体 H 65 偶
联后 , 形成的免疫毒素称之为 H 6 5一 T e K , H 6 5一 T C s 。 M T T 比色测定表明 , H6 5一 T e K `及 H 6 5 -
T cs 对表达 c D S 抗原的靶细胞 M o lt 一4 具有明显的毒性作用 , 这两种免疫毒素杀死 50 %靶细
胞所需浓度 ( IC 5 0 )分别为 7 . 2 x l 0一 g m o l / L 及 0 . 4 x l 0一 9 , 0 1 / L , 而在同样条件下 , H 6 5一 T C K
二一吕甘侧卜曰乞.,月泉白山
F 19
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I n h i b i t i o n o f P r o t e i n s y n t h e s i s
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t r i e h o k i r i n a n d t r i e h o s a n t h i n
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一 + 一
H 65
一
T C K
H 6 5
·
T C K
一△ 一 H 6 一 T C S
58 8
对不表达D S C抗原的Da u d i细胞毒性很低 。 另外 , 单独的括楼素对 M ol t一4 细 胞的毒性作用
也很低 , 见 iF g . 5 。 因此证明当单链毒素与具有导向作用的分子 , 如抗体连接后 , 对 靶细胞
显示特异性杀伤作用 。
讨 论
同种植物中往往含有不同形式的核搪体失活蛋白 ,如 T , 沁hos 曲。h e s 双 , ` lo 。 “ M “ 杭`。。 “`
根茎中的天花粉蛋白及其种子中的括楼素 , 它们都是一类 R N A N 一糖普酶 [` 2 , , 3 1 ,但是它们的
氨基酸组成 、 分子量 、 糖基化程度等都不同 , 而且在植物组织中含量相差较大 。
某些核糖体失活蛋白经化学交联剂修饰后会对其活性部位产生影响 、 因此 , 相应的免疫
毒素的细胞毒性质也受影响 。 2一 r 是目前制备免疫毒素最常用的交联剂之一 , 但是括楼素经
2一 T 修饰后 , 其生物活性丧失 70 % 以 _L 〔’ “ ] 。 括楼素与天花粉蛋白在无细胞体系中对蛋白质
合成的抑制活性相差 2 倍 , 但是 ,用 2一 IT 作交联剂制备成免疫毒素后对靶细胞的毒性相差 20
倍 。 如果换用其它的化学交联 , 如用 S一乙酷琉基珑拍酸醉 (S A M S人 ) 与括楼素反应后 , 至少
可以保持其 90 % 的生物活性 。 因此 , 括楼素通过这种交联剂偶联形成的免疫毒素其体外细胞
毒性与含蓖底毒素 A 链的免疫毒素相似 , 而其毒副作用更低 , 更 适 合 于 临 床 上 的 体内治
疗 [ , , r 。
参 考 文 献
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T s u r u g i K
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S t i r P e F
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B ` o c 几e仍 .1 , i 分8 9 , 2日2 : x 0 0 1
I l e r l t e r A A
,
F r a n k e l A E
.
J C l i . o . e o l
,
19 8 9
,
1 2
: 1 9 3 2
B y e r s V S
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工On
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Pu r f i ie at ion o f Tr ie ho i kr in
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i n a e t i v a t i n g P r o t e i n
f r o m t h e S e e d s o f T r玄e 瓦o s a n t h e s K玄r i不o w i i M a x 玄仇 o w 玄e z , a n d
P r e P a r a t i o n o f I m m u n o t o x i n s
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, R u n小 u a Z h e n g , S h u o S h e n , B e i一 f e n
( I : s t位￡“ ￡e o f B o s 成e 形 e d玄c a l S e i e 介 e e s , A e a 己召扭夕 o f 万 11“ a r 梦对 e J `e a l 夕 c i e . e e s ,
B e 玄护艺n g 1 0 0 8 5 0 )
A b s t r a e t A r i b o s o m e 一i n a e t i v a t i n g p r o t e i n , t r i e h o k i r i n , w a s e x t r a e t e d f r o m t h e
s o e d s
o f T r I’ e h o s a ” t h e s k i r i l o l口 fi M a x im o 切 i e z a n d p u r i f i e d b y g e l一 f i l t r a t i o n a n d i o n -
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·
T r i e h o k i r i n i n h i b i t e d P
r o t e i n s y n t h e s i s P o t e n t i a l l y i n r a b b i t r e t i c u l o c y t e
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s r e l a t i v e l y I o w t
o x i e t o i n t a e t e e l l s
.
T r i e h o k i r i n w a s e o n j
u g a t e d t o m o n o -
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i m m u n o t o x i n , r e f e r
r e d t o a s H 6 5一 T C K , s h o w e d P o t e n t e y t o t o x i e i t y t o t a r g e t e e l l m o l t
一 4 , L u t n o t t o n o n t a r g e t e e l l D a u d i
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K e y w o r d s : T r i e h o k i r i n , I m m u n o t o x i u 一 R ib o s o m e一 i n a e t i v a t i n g P r o t e i n
5 9 0