全 文 ：地丁草组织培养及无性系建立的研究
汤　莹 ,巴华忠 ,赵禹杭 ,张冬艳 ,姜长阳
(辽宁师范大学生命科学学院 ,辽宁大连 116029)
摘要:目的:为满足人们栽培对种苗的需要 ,并保护野生资源。方法:以地丁草不同外植体为材料 , 进行了愈伤组织诱导
与分化 、不定芽生根和试管苗生根继代培养研究 , 建立起地丁草的无性系。结果:MS+NH
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20 mg· L-1 +BA0.2 mg·
L-1 +IBA0.1mg· L-1 +NAA0.8 ～ 1.0mg· L-1是愈伤组织继代扩增培养的理想培养基;MS+AgNO3 0.5mg· L-1 +BA0.8 mg
· L-1 +NAA0.1 mg· L-1是愈伤组织继代扩增培养的愈伤组织分化理想培养基。 MS+AgNO3 0.5mg· L-1 +BA0.8mg· L-1
+NAA0.1mg· L-1是愈伤组织分化理想培养基。 1/2MS+IAA0.2mg· L-1 -0.4mg· L-1是试管苗生根培养的理想培养基。
1/2MS+IAA0.3mg· L-1是试管苗生根继代培养的理想培养基。移植到草地上的试管苗保持了野生地丁草的所有生物性 ,当
年鲜草产量增加 32%。结论:建立起地丁草的无性系。
关键词:地丁草;组织培养;无性系建立
中图分类号:R282　文献标识码:A　文章编号:1008-0104(2011)04-0005-03
　　地丁草(Corydalisbungeana)又称苦地丁 、小根地丁紫堇
等 , 属于罂粟科紫堇属多年生草本植物 , 生长于山沟 、溪旁和
杂草丛等环境中 , 在我国的甘肃 、陕西 、山西 、山东和河北等
地有分布 , 在辽宁的很多地区也有分布 [ 1] 。地丁全草含右旋
紫堇醇灵碱 、乙酰紫堇醇灵碱 、四氢黄连碱 、原阿片碱 、二氢
血根碱等多种生物碱 , 全草均可入药 , 具有清热解毒 、活血消
肿等功效 , 能治流行性感冒 、上呼吸道感染 、扁桃体炎 、痈肿 、
丹毒 、淋巴结炎 、眼结膜炎等疾病 [ 2] 。由于地丁具有重要的
药用价值 , 多年来人们一直进行大量的采挖。近年来辽宁南
部地区的农民还将其采挖回来粉碎 , 作为饲料的添加剂 , 不
仅能减少猪 、鸡的患病率 , 而且还能提高肉蛋的营养价值和
市场售价。 这使本来分布和数量都很少的地丁越来越少。
现在连临床药用所需的植物体都已经难以采到 ,更谈不上采
收饲料用的植物体。为此 , 大连的有关农民准备进行种植 ,
但由于难以采集到所需的种子 ,难以进行种植。为解决农民
对地丁草种植的需要 , 我们对地丁进行了无性系建立的研
究。虽然 , 目前已有罂粟科植物组织培养研究的报道 [ 3 , 4] ,但
迄今未见地丁组织培养研究的报道。
1　材料与方法
1.1　材料灭菌
5月上旬 ,将旅顺英歌石山坡上生长出子叶的地丁草小
苗和生长旺盛还没有开花的植株采回实验室 , 剪取子叶 、下
胚轴 、嫩茎 、叶片和叶柄 , 将其分别放到不同磨口广口瓶中 ,
用自来水振荡洗涤 10min左右 , 再用蒸馏水振荡洗涤 10min
左右 , 然后移到超净工作台上 , 用 75%的乙醇灭菌 10 ～ 15s,
再用 0.05% HgCl
2
溶液振荡灭菌 13min, 接着用无菌水振荡
洗涤 5次 , 即可获得无菌材料。
1.2　培养条件
参见李森等珊瑚菜的研究 [ 5] 。
1.3　试验方法
1.3.1　不同外植体对愈伤组织诱导的影响
把无菌子叶 、下胚轴 、嫩茎 、叶片和叶柄切成长 0.2 ～
0.3cm的块状后 , 接种到 MS+BA0.2 mg· L-1 +2, 4 -D
0.9mg· L-1 +NAA0.1 mg· L-1的培养基上 , 放到无光的培
养箱中 , 进行愈伤组织诱导培养。愈伤组织诱导培养试验重
复了 3次 , 每种材料接种培养 100块材料。
1.3.2　不同培养基对愈伤组织继代扩增培养的影响
把以上由嫩茎诱导培养的愈伤组织分散成颗粒状后 ,接
种到以 MS+NH
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20mg· L-1 +BA0.2mg· L-1 +IBA
0.1mg· L-1为基本培养基 , 附加浓度分别为 0.2mg· L-1 、
0.4mg· L-1 、 0.6mg· L-1、 0.8mg· L-1、 1.0mg· L-1 、
1.2mg· L-1 、1.4mg· L-1的 IAA、NAA培养基上 , 在光照下
进行愈伤组织的继代扩增培养。愈伤组织继代扩增培养试
验重复了 2次 , 每种材料接种培养 200个愈伤组织颗粒。
1.3.3　不同接种方式 、不同浓度生长素对继代扩增培养的
愈伤组织分化培养影响
把上述诱导培养的愈伤组织分成独立的颗粒和切成由
约 10个颗粒组成的块状后 , 接种到以 MS+AgNO3 0.5 mg·
L-1 +BA0.8 mg· L-1为基本培养基 , 附加不同浓度的 NAA、
IBA培养基上 ,在光照下进行愈伤组织的分化培养。愈伤组
织继代扩增培养试验重复了 3次 , 每种培养基接种培养 100
个愈伤组织颗粒或愈伤组织块。
1.3.4　不同浓度生长素对不定芽生根培养的影响
把以上分化培养的不定芽从基部剪下后 ,把下部切口在
浓度为 10mg· L-1的 NAA溶液中处理 5min后 , 接种到以
1/2MS为基本培养基 , 附加不同浓度的 IAA、 2, 4 -D培养基
上 , 在光照下进行生根培养。愈伤组织继代扩增培养试验重
复了 3次 , 每种培养基接种培养 100个愈伤组织颗粒或愈伤
组织块。
1.3.5　试管苗生根继代培养
把由不定芽生根培养的试管苗剪成 2 ～ 3段(每段长 1 ～
2cm, 至少要保留 2个叶片)后 , 直接接种到 1/2MS+IAA
0.3mg· L-1的培养基上 ,进行试管苗的生根继代培养。试管
苗的生根继代培养试验重复了 3次 , 每种培养基接种培养
400个材料 ,继代培养 5代。
1.3.6　试管苗的移栽与移植
把以上生根继代培养 25d左右的试管苗,从培养瓶中取出,
洗净根部的培养基后,直接移栽到温室中上部装着河沙的营养
钵中。移栽后前 12d要保持湿度 90%以上 ,没有直射光的环境
条件。移栽试验重复了 2次 ,每次移栽 600株试管苗。
把在营养钵中移栽成活的试管苗于 5月下旬分 2次移
植到到大连郊区水库附近的草地上。移植试验重复了 2次 ,
·5·HEILONGJIANGMEDICINEANDPHARMACYAug.2011, Vol.34No.4　　　　　　　　　　　　　　　　　
每次移植 550株试管苗。
2　结果与分析
2.1　不同外植体对愈伤组织诱导的影响
观察表明 , 接种培养 10d左右 ,培养材料基本没有变化。
培养到 13d时 , 在嫩茎的切口处开始生长膨大 , 随后生长出
半透明状愈伤组织 , 接着 ,伴随着嫩茎愈伤组织的生长 , 其颜
色也逐渐变黄。培养到 50d时统计证明:接种材料下胚轴的
愈伤组织诱导率为 8%, 嫩茎为 57%。并且由嫩茎诱导的愈
伤组织呈均匀较松散的黄色颗粒状。这说明 MS+BA0.2mg
· L-1 +2, 4-D0.9mg· L-1 +NAA0.1mg· L-1这种培养基
是诱导地丁草嫩茎愈伤组织的较理想培养基。
2.2　不同培养基对愈伤组织继代扩增培养的影响
接种培养 40d时统计证明:在附加不同浓度 IAA的培养
基上 , 愈伤组织不能生长扩增 , 而在附加不同浓度的 NAA的
培养基上 , 愈伤组织均能生长扩增。其中在附加浓度分别为
0.8mg· L-1 、1.0mg· L-1两种培养基上 , 愈伤组织的生长率
为 100%,愈伤组织颗粒的平均扩增为 7.6个 /颗和 8.1个 /
颗。并且所生长扩增的愈伤组织颗粒呈绿色松散状 , 大小为
0.1 ～ 0.15cm较均匀的颗粒状。 2次重复试验的结果也基本
一致。这说明 MS+NH4H2PO4 20 mg· L-1 +BA0.2mg· L-1
+IBA0.1mg· L-1 +NAA0.8 ～ 1.0 mg· L-1这种培养基是
地丁草愈伤组织继代扩增培养的理想培养基。
表 1　不同浓度激素对愈伤组织诱导的影响
NAA
mg· L-1
IBA
mg· L-1
诱导率
%
平均分化芽
数 /个或块
不定芽
长　势
0 0 0/0 0/0 -/-
0.1 0 12/81 1.8/4.2 ++/++
0.3 0 9/68 1.6/4.5 +/++
0.5 0 3/22 1.3/1.9 +/+
0.6 0 0/13 0/1.9 -/+
0.7 0 0/13 0/1.4 -/+
0.8 0 0/10 0/1.5 -/+
1.2 0 0/13 0/1.3 -/+
1.4 0 0/5 0/1.0 -/+
0 0.1 0/0 0/0 -/-
0 0.3 0/0 0/0 -/-
0 0.5 0/0 0/0 -/-
0 0.6 0/0 0/0 -/-
0 0.7 0/0 0/0 -/-
0 0.8 0/0 0/0 -/-
0 1.2 0/0 0/0 -/-
0 1.4 0/0 0/0 -/-
　　注:++为长势好;+为长势一般;-为不生长。 “ /”前表示材
料为独立颗粒 ,后为块状。
2.3　不同接种方式 、不同浓度生长素对继代扩增培养的愈
伤组织分化培养影响
接种后 40d统计 , 结果见表 1。由表可见 , 在不附加生长
素和附加不同浓度 IBA的培养基上 , 接种培养的材料不分
化;在附加不同浓度的 NAA的培养基上 ,接种培养的愈伤组
织颗粒分化率也很低 , 在附加不同浓度 NAA的培养基上接
种培养的愈伤组织块分化较好。 其中在附加浓度为 0.1mg
· L-1NAA的培养基上接种培养的愈伤组织块 , 其诱导率 、每
块愈伤组织分化芽数和分化不定芽的长势 , 均为所有处理组
中最好的。 并且观察还表明 , 在附加浓度为 0.1mg· L-1
NAA的培养基上接种培养的愈伤组织块 , 培养到 9d时可见
开始分化不定芽 ,随后 , 随着先分化不定芽的生长 , 在其下部
周围又会分化出多个不定芽。培养到 40d时 , 培养的愈伤组
织块就会分化出有 2 ～ 9个芽组成的不定芽丛 , 不定芽的高
度为 0.8 ～ 1.7cm, 长势较旺盛 , 几乎没有无效苗。 3次重复
试验的结果基本一致。上述结果说明:MS+AgNO3 0.5mg·
L-1 +BA0.8mg· L-1 +NAA0.1mg· L-1这种培养基是地丁
草愈伤组织继代扩增培养的愈伤组织分化理想培养基。
2.4　不同浓度生长素对不定芽生根培养的影响
接种培养 30d统计 , 结果见表 2。表 2的结果说明:在不
加生长素和附加浓度分别为 0.1 ～ 0.7mg· L-1 2, 4-D的培
养基上 , 培养的不定芽不能生根。 在附加浓度分别为 0.1 ～
0.7mg· L-1IAA的培养基上 , 培养的不定芽均能生根。其中
在附加浓度分别为 0.2 ～ 0.4mg· L-1IAA的培养基上 , 培养
的不定芽生根效果较好。其生根率为 88% ～ 93%, 平均每株
试管苗的生根数为 4.9 ～ 5.9条 , 高 3.0 ～ 4.6cm,并且培养生
长的试管苗长势好。在培养过程的观察中也表明 , 在附加浓
度分别为 0.2 ～ 0.4 mg· L-1IAA的培养基上培养的不定芽
培养 7 ～ 9d大多数能形成可见根原基 , 随后伴随着白色根的
生长 , 伸展的叶片数也迅速增加 , 使其培养的试管苗外观上
生长旺盛 , 并且 3次重复试验的结果基本一致。在培养中还
观察到 , 所培养的愈伤组织块中一旦其中的一个颗粒已经分
化生长出不定芽 ,周围其它的颗粒就不易分化 , 即使少数颗
粒出现了分化芽 , 也难以正常生长。以上结果说明:把下部
切口在浓度为 10 mg· L-1的 NAA溶液中处理 5min后的不
定芽 , 接种到 1/2MS+IAA0.2 ～ 0.4 mg· L-1的培养基是地
丁草试管苗生根培养的理想培养基。
表 2　不同浓度激素对愈伤组织诱导的影响
IAA
mg· L-1
2, 4-D
mg· L-1
生根率
%
平均生根数
(条)/株
试管苗
长　势
0 0 0 0 -
0.1 0 35 2.1 +
0.2 0 88 5.4 ++
0.3 0 93 5.9 ++
0.4 0 90 4.9 ++
0.5 0 43 2.6 +
0.6 0 41 2.0 +
0.7 0 33 2.0 +
0 0.1 0 0 -
0 0.2 0 0 -
0 0.3 0 0 -
0 0.4 0 0 -
0 0.5 0 0 -
0 0.6 0 0 -
0 0.7 0 0 -
　　注:++为长势好;+为长势一般;-为不生长。
2.5　试管苗生根继代培养
继代培养统计证明:继代培养 1代生长的与由不定芽生
根培养生根试管苗一致的试管苗 ,培养周期是 27d,每代的繁
殖系数为 2.7。继代培养的试管苗生根率为 95.5%、平均每
株生根数为 5.9条 ,试管苗平均高度为 4.2cm,外观上生长非
常旺盛 , 没有无效苗。 3次重复试验的结果基本一致。以上
结果证明:1/2MS+IAA0.3 mg· L-1的培养基是地丁草试管
苗生根继代培养的理想培养基。
2.6　试管苗的移栽与移植
二次移栽的平均成活率为 93.4%。移栽 14d后 , 成活的
·6· 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　黑龙江医药科学　2011年 8月第 34卷第 4期
试管苗开始正常生长。二次移栽的平均成活率为 98.6%。
移栽 40d左右 , 成活的试管苗开始旺盛生长 , 保持了地丁草
的所有生物性状。与当年播种实生苗相比 , 移植成活的试管
苗具有根系发达 、生长旺盛 、开花时间晚 20d左右的特点。
移植的试管苗当年鲜草的收获量比当年播种实生苗提高
32%。
3　讨论
由愈伤组织分化形成不定芽的研究已多有报道 [ 1] , 但迄
今未见同一种植物在相同条件下诱导的愈伤组织颗粒 , 对单
个颗粒进行分化培养和由几个颗粒组成的愈伤组织块进行
分化培养的比较研究。 在本研究的愈伤组织颗粒分化培养
研究中 , 接种培养的单独愈伤组织颗粒分化率也很低 , 接种
培养的愈伤组织块分化较好。产生这种现象原因如下:一是
不同的愈伤组织颗粒生长发育的程度差异较大。由 10个左
右愈伤组织颗粒组成愈伤组织块中 , 有的颗粒发育好 , 容易
分化 , 而其中的大多数生长发育一般 ,不易分化。接种于分
化培养基上有的愈伤组织颗粒也能分化也证明了这一点;二
是把愈伤组织块接种到分化培养基上 , 生长在一起的愈伤组
织颗粒对先分化颗粒会产生看护性的促进分化作用;三是先
分化的愈伤组织颗粒一旦分化生长出不定芽 , 其自身合成的
生长素就会对周围其它愈伤组织颗粒的分化和生长产生抑
制作用。在本研究的生根继代培养中 , 27d为一个培养出一
代生根试管苗周期 , 每代的繁殖系数为 2.7。 再加之通过这
种方法繁殖的试管苗几乎没有无效苗。所以 ,通过这种方法
对地丁草进行繁殖 ,所获得种苗数量可以满足人们栽培的需
求 , 达到了快速繁殖的目的。
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(收稿日期:2011-02-27)
基金项目:辽宁省高等教育教学改革资助项目(20090304);辽宁师范大学教学改革资助项目(LSJG:20090108)。
作者简介:汤莹(1987 ～ )女 , 辽宁朝阳人 ,辽宁师范大学生命科学学院本科学生 ,从事植物组织培养研究。
通讯作者:姜长阳(1953 ～ )男 , 辽宁大连人 ,教授 , 从事植物技术研究。 E-mail:changyangjiang@126.com。
TissuecultureandestablishmentofcloneofCorydalisbungeana
TANGYing, BAHua-zhong, ZHAOYu-hang, ZHANGDong-yan, JIANGChang-yang
(CollegeofLifeScience, LiaoningNormalUniversity, Dalian116029, China)
Abstract:Objective:Tomeettheneedforcultivationofgermchitsandprotectwildresources.Methods:Dif-
ferentexplantsfromCorydalisbungeanawereculturedinvitrotoinvestigatecalusinducementanddiferentiation,
formationofadventitiousroots, multiplicationofadventitiousrootsandtheclonesofCorydalisbungeanawasestab-
lished.Results:TheidealmediumforcalusmultiplicationwasMS+NH4H2PO4 20mg· L-1 +BA0.2 mg· L-1 +
IBA0.1mg· L-1 +NAA0.8 ～ 1.0 mg· L-1;themediumofMS+AgNO30.5mg· L-1 +BA0.8mg·L-1 +
NAA0.1 mg· L-1 wassuitableforcalusdiferentiation;1/2MS+IAA0.2 ～ 0.4mg·L-1 wasthebestrootingme-
diumforthetubeseedlings, andthemultiplicationofadventitiousrootidealmediumwas1 /2MS+IAA0.3mg·
L-1.ThetubeseedlingsretainedalbiologicalcharacteristicsoftheescapeCorydalisbungeanaaftertransplantedto
grassplot.Theyearyieldoffreshgrasswasincreasedby32%.Conclusion:ThecloneofCorydalisbungeanaises-
tablished.
Keywords:Corydalisbungeana;tissueculture;establishmentofclone
·7·HEILONGJIANGMEDICINEANDPHARMACYAug.2011, Vol.34No.4