全 文 ：HPLC法测定三桠苦中山柰酚的含量
王腾华，高幼衡，张丽媛，卢锦熙，万明珠，谭敏
(广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006)
摘要:目的 建立三桠苦中山柰酚的 HPLC 含量测定方法。方法 采用反相高效液相色谱法。色谱柱:
Diamonsil C18柱(250 mm × 4． 6 mm，5 μm) ;流动相:甲醇-0． 4% H3PO4(体积比 55 ∶ 45) ;流速:1 mL·
min －1;检测波长:368 nm;柱温:25 ℃;进样量:10 μL。结果 山柰酚在 0． 48 ～ 4． 80 μg 范围内与峰面积
呈良好线性关系(r = 0． 999 4) ，平均回收率为 98． 52%，RSD为 2． 45%(n = 6)。结论 该方法简便、准确、
分离度好，可用于三桠苦中山柰酚的含量测定。
关键词:三桠苦;山柰酚;含量测定;高效液相色谱法
中图分类号:R284． 1 文献标志码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1006-8783． 2012． 05． 013
文章编号:1006-8783(2012)05-0519-03
Determination of kaempferol in Melicope ptelefolia (Champ． ex Benth．)Hartley by HPLC
WANG Teng-hua，GAO You-heng，ZHANG Li-yuan，LU Jin-xi，WAN Ming-zhu，TAN min
(School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China)
Abstract:Objective To establish a HPLC method for the determination of kaempferol in Melicope ptelefolia
(Champ． ex Benth．)Hartley． Methods RP-HPLC method on C18 column (250 mm ×4． 6 mm，5 μm)was used
with the mobile phase consisted of methanol and 0． 4% phosphoric acid． The flow rate was 1． 0 mL·min －1 ． The
UV detection wavelength was 368 nm． The column temperature was maintained at 25 ℃ and the injection volume
was 10 μL． Results The linearity of kaempferol was good in the range of 0． 48 －4． 80 μg(r = 0． 999 4) ，and its
average recovery was 98． 52%，RSD =2． 45%(n =6)． Conclusion This method is simple，accurate，reliable with
good resolution and can be used for the quantitative determination of kaempferol in M． ptelefolia．
Key words:Melicope ptelefolia (Champ． ex Benth．)Hartley;kaempferol;quantitative determination;HPLC
收稿日期:2012-09-10
作者简介:王腾华(1988 －) ，女，硕士研究生，从事中药活性成分及质量标准研究，Email:wangtenghua88@ 126． com;通信作者:
高幼衡(1956 －) ，男，教授，博士生导师，电话:020-39358083，Email:gaoyouheng@ yahoo． com． cn。
网络出版时间:2012-10-10 14:22 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /44． 1413． R． 20121010． 1422． 003． html
三桠苦［Melicope ptelefolia (Champ． ex Benth．)
Hartley］为芸香科吴茱萸属植物，又名三丫苦、三丫
虎、三叉虎、三部虎、三支枪、三脚鳖［1］。始载于《岭
南采药录》，现收载于《广东省中药材标准》，既为我
国岭南地区药食同用的中草药之一，也是广东凉茶
中的一味原料药［2］，具有清热解毒、祛风除湿、消肿
止痛等功效［3］。现代药理研究表明，三桠苦有抑
菌、抗感染、镇痛、抗氧化等作用［4］，用于治疗咽喉
肿痛、疟疾、黄疸型肝炎、风湿骨痛、湿疹、皮炎、肺肿
痛、跌打及各种炎症等［5］。对其物质基础研究表
明，三桠苦中含有色烯、生物碱、黄酮、挥发油、香豆
素、植物甾醇等多种化学成分［6 － 9］。李硕果等［10］已
采用 HPLC法测定了三桠苦中吴茱萸春的含量，但
尚未见关于山柰酚含量测定的报道。本课题组对三
桠苦药材进行了系统的化学成分研究，在该植物中
分离并鉴定出山柰酚，并在药理活性试验中证明山
柰酚具有抑制小鼠巨噬细胞释放氧化亚氮的活
性［11］;另据文献报道，山柰酚还有防癌、抗癌，抗感
染作用，可防治动脉粥样硬化及糖尿病，并且是蛋白
激酶及免疫系统的抑制剂［12］。本试验采用 HPLC
法测定三桠苦中山柰酚的含量，为补充和完善该药
材的质量标准、合理利用植物资源以及开发新药提
供了科学论据。
广东药学院学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University Oct． 2012，28(5)
1 仪器与试药
1． 1 仪器
Dionex Summit 高效液相色谱仪(德国 DIONEX
公司，P680 HPLC 四元梯度泵、STH585 柱温箱、
UVD-170 检测器、ASI-100 自动进样器) ;Chromeleon
色谱工作站;Dikmonsil C18色谱柱(250 mm × 4． 6
mm，5 μm) ;SB25-12DT 超声波清洗机(宁波新芝生
物科技股份有限公司，功率 100 W，频率 40 kHz) ;
Shmadazu AUY120 型电子分析天平(广州湘仪机电
设备有限公司)。
1． 2 试药
三桠苦药材于 2011 年 6 月采自广东从化良口
县，由广州中医药大学潘超美教授鉴定为芸香科植
物三桠苦的叶及枝条，药材留样存放于广州中医药
大学中药学院标本室;山柰酚对照品由本实验室提
供(经波谱解析鉴定结构，HPLC 归一化法计算其质
量分数 ＞ 98%) ;甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他
试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2． 1 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱:Diamonsil C18柱(250 mm × 4． 6 mm，5
μm) ;流动相:甲醇-0． 4%H3PO4(体积比 55∶ 45) ;流
速:1 mL·min －1;检测波长:368 nm;柱温:25 ℃;进
样量:10 μL。分别精密吸取山柰酚对照品、三桠苦
供试品溶液 10 μL，在上述色谱条件下测定。山柰
酚的拖尾因子为 1． 04，与其他组分色谱峰分离度良
好，出峰时间为 16． 01 min;以山柰酚计算色谱柱的
理论塔板数为 5 310，见图 1。
2． 2 溶液的制备
2． 2． 1 对照品溶液的制备
精密称取山柰酚对照品 6． 0 mg，置于 25 mL 容
量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量
浓度为 0． 24 mg·mL －1的对照品溶液。
2． 2． 2 供试品溶液的制备
取三桠苦药材粉末 2． 0 g，精密称定，置具塞
锥形瓶中，精密加入 80%(体积分数)甲醇 80 mL，
称定质量，超声提取 1 h。取出，放冷，补足失重，
摇匀，滤过。弃去初滤液，精密量取续滤液 30 mL，
加 10%(体积分数)HCl溶液 10 mL，超声提取 0． 5
h。水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至 10 mL 容
量瓶中，取上述溶液经 0 ． 45 μm 微孔滤膜滤过，
即得。
U/
m
V
1
120
80
60
40
20
0
-20
0.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0 23.0
U/
m
V
t/min
1
120
100
80
60
40
20
-5
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0
A
B
1．山柰酚。
图 1 对照品(A)、供试品(B)溶液的 HPLC图
Figure 1 HPLC chromatograms of reference (A)and sample
(B)solution
2． 3 线性关系的考察
分别精密吸取“2． 2． 1”项下对照品溶液 2、6、
10、14、18、20 μL 注入液相色谱仪中，按“2． 1”项下
色谱条件测定峰面积，以山柰酚的进样量为横坐标，
山柰酚的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归
方程:A = 5． 3531 × 104X + 1． 9556 × 104，r = 0． 999 4。
结果表明山柰酚在 0． 48 ～ 4． 80 μg范围内与峰面积
呈良好线性关系。
2． 4 精密度试验
精密吸取同一山柰酚对照品溶液 10 μL，按
“2． 1”项下色谱条件，重复进样 6次，测定山柰酚峰面
积，计算其 RSD值为 1． 50%，表明仪器精密度良好。
2． 5 稳定性试验
取同一三桠苦药材供试品溶液，按“2． 1”项下
色谱条件，分别于 0、2、4、8、12、24 h精密吸取 10 μL
注入液相色谱仪测定。结果山柰酚峰面积的 RSD
为 2． 03%，表明供试品溶液在 24 h内稳定。
2． 6 重复性试验
取同一批三桠苦药材粉末适量，共 6 份，按
“2． 2． 2”项下方法制备供试品溶液，“2． 1”项下色谱
条件进行测定，结果三桠苦中山柰酚的平均质量分
数为 0． 242 mg·g －1，其 RSD为 1． 43%(n = 6)。
2． 7 加样回收率试验
取已知质量分数的三桠苦药材粉末，精密称定，
共 6 份。分别精密加入山柰酚对照品溶液(0． 24 mg
·mL －1)2 mL，按“2． 2． 2”项下方法制备供试品溶
液，按上述色谱条件进行测定，计算山柰酚的回收
率，结果见表 1。山柰酚的平均回收率为 98． 52%，
RSD为 2． 45%。
025 广东药学院学报 第 28 卷
表 1 加样回收率试验结果
Table 1 Results of the recovery test (n = 6)
序号 样品量 m /g 样品中的量 m /mg 加入量 m /mg 测得量 m /mg 回收率 /% 平均回收率 /% RSD /%
1 2． 001 4 0． 484 3 0． 48 0． 976 9 102． 63
2 2． 002 8 0． 484 7 0． 48 0． 960 2 99． 06
3 2． 003 6 0． 484 9 0． 48 0． 951 1 97． 13
4 2． 004 8 0． 485 2 0． 48 0． 960 5 99． 02
5 1． 999 2 0． 483 8 0． 48 0． 953 2 97． 79
6 2． 000 4 0． 482 1 0． 48 0． 940 4 95． 48
98． 52 2． 45
2． 8 样品含量测定
分别取三桠苦药材 3 批，精密称定，按“2． 2． 2”
项下方法制备供试品溶液，依法测定，每批平行操作
3 次。分别精密吸取各供试品溶液 10 μL，注入高效
液相色谱仪，依法测定。计算出样品中山柰酚的质
量分数分别为 0． 278、0． 269、0． 232 mg·g －1，总 RSD
值为 2． 73 %。
3 讨论
3． 1 检测波长的选择
比较了 244、260、300、368 nm 对样品含量测定
的影响，山柰酚对 368 nm 波长较灵敏，且杂质干扰
较少，故确定检测波长为 368 nm。
3． 2 提取方法的选择
三桠苦药材的提取主要考察以下几个方面:提
取溶剂(80%甲醇、甲醇和乙醇)、提取方式(热回
流、索氏、超声)、提取时间(30、40、60、90 min)。结
果表明，采用本文提取方法，操作简单快速，且重复
性良好。
3． 3 流动相的选择
分别考察了甲醇-水、甲醇-0． 4%(体积分数)
H3PO4、乙腈-水、乙腈-0． 4% (体积分数)H3PO4。
乙腈系统分离峰形良好，但分离度不佳;甲醇系统
分离虽峰数较多，但目标峰分离效果良好，故选择
甲醇系统。又因山柰酚结构中具羟基，所以流动
相中加入 H3PO4，使色谱峰对称性良好，抑制了峰
形的拖尾现象。经过对流动相的类别、比例和洗
脱方式等参数的考察和优化，以本文所采用的检
测条件效果最佳。
本实验首次建立了高效液相色谱检测三桠苦中
山柰酚的定量分析方法。该方法简便、准确、重复性
好、专属性强，为完善三桠苦药材的质量标准及充分
合理利用三桠苦资源提供依据。
参考文献:
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(责任编辑:刘晓涵)
125第 5 期 王腾华，等． HPLC法测定三桠苦中山柰酚的含量