全 文 ：蓝堇草离体快繁和植株再生研究
段晓姗，田先华* (陕西师范大学生命科学学院，陕西西安 710062)
摘要 ［目的］为蓝堇草的引种栽培和转基因研究建立平台。［方法］研究了外植体类型、植物生长调节剂类型及浓度配比对愈伤组织
诱导和不定芽分化的影响。［结论］以叶片为外植体，在 MS +6-BA 0． 5 mg /L + IBA 3． 0 mg /L培养基上进行愈伤组织的诱导，并将愈伤
组织转接到 MS +6-BA 0． 5 mg /L + IBA 1． 0 mg /L培养基上诱导不定芽的分化效果最好。
关键词 蓝堇草;愈伤组织;不定芽;再生
中图分类号 S132 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)19 －11391 －03
Study on in vitro Rapid Propagation and Plant Regeneration of Leptopyrum fumarioides
DUAN Xiao-shan et al (College of Life Science，Shaanxi Normal University，Xi’an，Shaanxi 710062)
Abstract ［Objective］To provide platform for the domestication and transgene research of Leptopyrum fumarioides．［Method］The effects of
explants type，plant growth regulator type and concentration ratio on the callus induction and adventitious buds differentiation of this species
were studied．［Results］With the leaves as the explants，the optimized callus induction medium was MS + 6-BA 0． 5 mg /L + IBA 3． 0 mg /L，
and the optimized medium for the differentiation of adventitious buds was MS + 6-BA 0． 5 mg /L + IBA 1． 0 mg /L．
Key words Leptopyrum fumarioides;Callus;Adventitious buds;Regeneration
作者简介 段晓姗(1986 －) ，女，陕西三原人，硕士研究生，从事植物学
研究。* 通讯作者，教授，硕士生导师，从事植物学研究，E-
mail:tianxianhua@ snnu． edu． cn。
收稿日期 2011-03-28
蓝堇草(Leptopyrum fumarioides)［1］是毛茛科蓝堇草属一
年生草本植物。它的花瓣外形奇特，呈二唇形，在其凹槽处
有蜜腺，这样的结构具有吸引传粉者并为其提供回馈的作
用，因此蓝堇草花瓣的形态结构是其分类的重要特征。它还
是一种早春野生花卉，主要分布于我国的东北地区，花期 5 ～
6月，对丰富北方早春的景观有着重要作用。但蓝堇草的分
布范围很窄，且根系不发达，所以对其引种驯化工作比较困
难。为了解决蓝堇草的引种栽培难的问题，笔者通过组织培
养的方法建立了蓝堇草的快繁和高效植株再生体系，同时为
其繁殖栽培和分子育种研究提供了有力的技术支持。
1 材料与方法
1． 1 试验材料 选取蓝堇草的种子，于 2009年 5月在东北
林业大学校内采集。
1． 2 试验条件 试验中所用基本培养基为MS，蔗糖浓度为
3%，琼脂为 0． 6%，pH5． 9。培养条件为光照强度 1 000 lx，
每日光照 16 h，黑暗 8 h，室温 25 ℃。
1． 3 无菌快繁体系的建立 将蓝堇草的种子用 10%次氯
酸钠消毒 20 min后播在 MS 培养基上，待其长出 2 ～ 3 片真
叶的时候，将小苗接种在快繁培养基 MS + 6-BA 0． 5 mg /L +
IBA 0． 25 mg /L上，15 d 后开始在小苗基部分化不定芽(图
1d) ，30 d后形成完整的丛生苗。再将分化的丛生苗接种在
伸展培养基MS + IBA 2． 0 mg /L +活性炭 2． 0 g /L(AC)上，15
～20 d后丛生苗上的叶片就完全伸展开(图 1e) ，我们以蓝
堇草的叶片和叶柄作为外植体进行愈伤组织的诱导和不定
芽的分化实验。
1． 4 愈伤组织的诱导 以蓝堇草快繁苗伸展的叶片和叶
柄作为外植体，将其接种在不同的愈伤诱导培养基上，其处
理为 MS + 6-BA(0． 5、1． 0、2． 0 mg /L)+ NAA/IBA(1． 0、2． 0、
3． 0、4． 0 mg /L) (表 1)。接种的外植体先进行 15 d 的暗培
养，再放在光下进行培养，15 d后统计出愈率，出愈率 =诱导
的愈伤组织个数 /接种外植体数 ×100%。
1． 5 不定芽的诱导 将绿色致密的愈伤组织接种到不同
的不定芽分化培养基中，其处理为 MS + 6-BA(0． 5、1． 0、2． 0
mg /L)+ IBA(0． 5、1． 0、2． 0 mg /L)见表 2。接种 20 d后统计
不定芽的分化率，分化率 =分化不定芽的外植体数 /接种的
愈伤数 ×100%。
2 结果与分析
2． 1 外植体类型对愈伤组织形成的影响 在接种 30 d后
观察愈伤组织的诱导情况，发现叶柄作为外植体诱导的愈伤
组织呈黄色透明状，质地疏松，生长情况较差。但叶片作为
外植体可以长出致密的愈伤组织，颜色深绿，生长状况良好。
从总体来看，叶片的诱导率显著高于叶柄的诱导率，其愈伤
组织生长情况也显著优于叶柄。
2． 2 培养基配比及外植体类型对愈伤组织分化的影响 由
表 1可见，当 6-BA浓度为 0． 5 ～1． 0 mg /L且 IBA浓度为 2． 0
～3． 0 mg /L时，对叶片有较高的诱导率，以 1号培养基，对叶
片的诱导率最高，达 98． 2%，且愈伤组织生长情况良好(图
1a、b)。添加 NAA 与 6-BA 虽然也达到了一定的诱导率，但
愈伤组织颜色较深，不利于不定芽的进一步诱导，而在使用
KT的培养基上，其外植体则出现了褐色的愈伤，且愈伤诱导
率更低。可见，6-BA 与 IBA 较适宜诱导蓝堇草愈伤组织的
发生。
表 1 部分培养基配比及外植体类型对诱导愈伤组织的影响
Table 1 Effects of the mixture ratio of some media and the type of ex-
plant on callus induction
培养基
编号
No． of
medium
细胞分裂素∥mg /L
Cytokinin
6-BA KT
生长素∥mg /L
Auxin
IBA NAA
外植体
类型
Type
of
explant
出愈
率∥%
Induction
rate
愈伤
状态
Callus
state
1 0． 5 0． 0 3． 0 0． 0 叶片 98． 2 嫩绿、致密
叶柄 85． 1 淡黄、疏松
2 1． 0 0． 0 3． 0 0． 0 叶片 86． 3 嫩绿、致密
叶柄 73． 2 淡黄、疏松
3 2． 0 0． 0 4． 0 0． 0 叶片 92． 6 嫩绿、疏松
叶柄 88． 4 淡黄、疏松
4 0． 0 1． 0 3． 0 0． 0 叶片 65． 5 褐色、致密
叶柄 43． 6 褐色、致密
5 1． 0 0． 0 0． 0 3． 0 叶片 78． 3 深绿、致密
叶柄 71． 6 淡黄、疏松
6 0． 0 1． 0 3． 0 0． 0 叶片 51． 7 褐色、致密
叶柄 42． 5 褐色、致密
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(19):11391 － 11393 责任编辑 罗芸 责任校对 傅真治
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.19.218
2． 3 6-BA和 IBA对诱导不定芽的影响 由于 KT和 NAA
在诱导愈伤组织的实验中，愈伤组织生长情况较差，不适于
继续诱导不定芽，故笔者只对在添加 MS + 6-BA 0． 5 mg /L +
IBA 3． 0 mg /L的培养基上诱导的愈伤组织做进一步研究。
愈伤组织转接到不定芽诱导培养基之后约 10 d，在愈伤
的表面会分化出不定芽，20 ～ 25 d后不定芽形成丛生苗，此
时统计愈伤组织的分化率见表 2。结果表明，叶柄作为外植
体诱导出的愈伤组织均未分化，叶片在不同分化培养基上的
分化效率也不同，不定芽分化率最高的培养基为 7 号，达
80． 6%;其次为 8号，不定芽分化率为 72． 6%;上述两个培养
基中不定芽的分化为鲜绿色，且分化的不定芽数量多，呈丛
生状态(图 1c)。当 6-BA浓度太高(1． 0 ～ 2． 0 mg /L)或 IBA
的浓度太低(0． 5 mg /L)时，分化率明显下降，分化的不定芽
也比较稀少。
表 2 6-BA和 IBA的不同配比对不定芽分化的影响
Table 2 Effects of different mixture ratios of 6-BA to IBA on adventi-
tious buds differentiation
培养基编号
No． of
medium
6-BA
mg /L
IBA
mg /L
不定芽
分化率∥%
Differentiation rate
of adventitious buds
不定芽状态
State of
adventitious buds
7 0． 5 1． 0 80． 6 丛生
8 0． 5 2． 0 72． 6 丛生
9 1． 0 0． 5 46． 5 稀少
10 2． 0 2． 0 18． 8 稀少
2． 4 试管苗的开花现象 把再生获得的幼苗转接到快繁
培养基后 30 d，在一些丛生芽基部还能看到分化出的花芽，
再把这些丛生芽转接到伸展培养基上约 10 d，这些花芽还能
开出黄色的小花(图 1f)。
注:a．叶片暗培养 15 d后开始形成愈伤组织;b．叶片培养 25 d后形成嫩绿、致密的愈伤组织;c．愈伤组织转入分化培养基后 5 d开始分化不定
芽;d．不定芽转入快繁培养基上培养 20 d后形成的丛生苗;e．丛生芽转入伸展培养基后 15 d后伸展开的叶片和茎段;f．丛生苗在伸展培养
基的开花现象;标尺为 0． 5 cm。
Note:a． Callus formed from the leaves after 15 d darkness culture;b． Green and compact callus formed after 25 d culture;c． Adventitious buds differentia-
ted after the transplant of callus to the differential medium for 5 d;d． The sprouts formed after the transplant of adventitious buds to the proliferation
medium for 20 d;e． The expanded leaves and shoots after the transplant of sprouts to the elongation medium;f． The flowering plant on the elongation
medium;Bar =0． 5 cm．
图 1 由蓝堇草叶片诱导的愈伤组织及不定芽的分化
Fig． 1 Callus induction and adventitious buds differentiation from the leaves of Leptopyrum fumarioides
3 结论
(1)外植体类型是决定植株再生的内在因素。不同的外
植体和活性及其对激素的响应是不同的。该研究发现，使用
蓝堇草叶片作为外植体的效果比叶柄好，因此叶片被选作为
该研究适宜的外植体。
(2)细胞分裂素是影响植株再生的关键因素。在毛茛科
其他很多物种的再生研究当中，6-BA 是最常用的细胞分裂
素［2］。该研究表明，6-BA 对蓝堇草愈伤的诱导效率要明显
好于 KT，说明 6-BA在毛莨科组织培养中是普遍适用的细胞
分裂素。
(3)生长素对植株再生也有重要作用，但不同材料对生
长素的种类和浓度要求有所不同。该研究发现，使用 IBA对
蓝堇草愈伤的诱导及植株再生的效果要好于 NAA。
(4)综合而言，以蓝堇草叶片为外植体，在 MS + 6-BA
0． 5 mg /L + IBA 3． 0 mg /L培养基上进行愈伤组织的诱导，并
将愈伤组织转接到 MS + 6-BA 0． 5 mg /L + IBA 1． 0 mg /L 培
养基上诱导不定芽的分化效果最好。
但目前为止，蓝堇草的生根仍很困难，这可能与其本身
只有一个细长的直根系的特点有关，在以后的试验中，将继
续摸索蓝堇草适宜的生根条件，并为蓝堇草的引种驯化及转
基因研究提供技术平台。
参考文献
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40 －41．
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应用潜力很大。糖蜜能满足高效絮凝剂产生菌株 J-Y1 和 J-
Y2的碳源、氮源和生长因子等多种营养需要，且不影响 J-Y1
和 J-Y2的絮凝剂活性和稳定性，可以作为 J-Y1和 J-Y2的廉
价替代培养基。
图 2 J-Y1(A)和 J-Y2(B)在不同稀释倍数糖蜜废液中的生长情况
Fig． 2 Growth status of J-Y1 (A)and J-Y2 (B)in different diluted rates of molasses waste liquids
图 3 J-Y1(A)和 J-Y2(B)在不同稀释倍数糖蜜废液中的絮凝率
Fig． 3 Flocculation rates of J-Y1 (A)and J-Y2 (B)in different diluted times of molasses waste liquids
3． 2 讨论 在单因子试验得到不同菌株最佳的絮凝率与正
交试验因子之间组合作用时不尽相同，这可能与多种因素之
间相互作用有关［4］。絮凝剂的最佳投加量大约是固体颗粒
表面吸附大分子化合物达到饱和时一般的吸附量，因为此时
大分子在固体颗粒上架桥几率最大［5］，但过多的絮凝剂分子
由于所带同种电荷相互排斥而不能与胶体颗粒充分接触，而
加入助凝剂 CaCl2 有利于两者通过架桥或中和作用来吸附
被絮凝物［6］。从反应动力学的角度来看，温度的升高使反应
速率常数增加，反应速度加快，有利于絮凝剂分子与悬浮颗
粒之间化学键的形成。温度的变化也能间接影响到 pH，而
pH影响到絮凝剂的表面电荷性质、形态结构，还能够影响水
体中悬浮物质的电荷性质，从而影响到它们的相互作用［3］。
这 4个因素是相互作用的。但这 4 个因素对该研究所采用
的 2个菌株所起的主次作用并不相同，表明对于不同的菌株
必须通过试验来确定其达到最佳絮凝效果的的培养条件。
此外，J-Y1和 J-Y2菌液处理过的焦化废水浊度和色度
都有明显降低，弥补了现有方法对焦化废水的浊度和色度等
的处理不足。这进一步说明，J-Y1 和 J-Y1 菌液对焦化废水
处理的效果明显，在焦化废水预处理中有一定的应用潜力。
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3931139卷 19期 段晓姗等 蓝堇草离体快繁和植株再生研究