全 文 ：应用与环境生物学报 2010，16 ( 5 ): 642~645
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X
2010-10-25
DOI: 10.3724/SP.J.1145.2010.00642
雪灵芝是石竹 科蚤缀属甘肃蚤缀植物，生长在青藏高
原海拔约4 000~5 000 m左右的高山草甸和石缝中，是一种珍
贵的野生藏药资源，具 有清热、解毒、止咳、降血压和抗缺
氧的功效，能治疗各种肺炎和肺病，被广泛记载于多部医学
典籍中[1~4]. 雪灵芝化学成分的研究表明其含有苯丙素、生物
碱、香豆素、甾体类、三萜及三萜皂苷、黄酮、糖类、环肽、
氨基酸和维生素A、D、E等多种化学成分 [5~11]. 近年来，已有
一定的药理实验研究表明雪灵芝具 有多种生物活性，主要
包括免疫调节、促 进消化、抗肿瘤、抗自由基、抗菌等生物
学活性 [12~15]. 但遗憾得是，具体是哪些成分有效，哪些无效，
对于雪灵芝来说都还不明确. 此外研究方法多集中在体内
生物活性筛选，而对体外生物活性筛选关注较少. 为有针对
性地找出有效部位，须确定每种病症筛选模型，进行有效部
位的活性跟踪. 我们选用蛋白酪氨酸磷酸酯酶（PTP1B）、二
肽基肽酶（DPP-IV）、α-葡萄糖苷酶-rat（α-glucosidase-rat）、
MCF-7/ADR肿瘤耐药细胞增敏、肿瘤细胞毒活性（HepG2肝
癌细胞）、骨髓有核细胞增殖等靶点或者模型，对雪灵芝水
提液、醇提液和市售的雪灵芝营养口服液进行免疫调节、抗
肿瘤、糖尿病等活性筛选，以便确定有效部位活性跟踪的筛
选模型，同时为雪灵芝的开发利用提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 材 料
药品和试剂：谷胱甘肽Sepharose 4B购自Pharmacia公司；
对-硝基苯基磷酸二钠（pNPP）为Sigma产品；pGEXPTP1B
表达质粒（地奥集团药物筛选中心）；胰蛋白酶、四甲基 偶
氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）为Amresco公司产品；
葡萄糖苷酶（Sigma，G-0660）；阿霉素（Adriamycin，ADM）
为浙江海正药业产品；葡萄糖检测试剂（南京建成公司）；
二肽基肽酶DPP-IV（Sigma）；HBsAg、HBeAg、ELISA检测
试剂盒为上海荣盛生物技术有限公司，批号分别为20070202
和 20070407；拉米呋啶片（国药试字2000004，葛兰素史克
制药有限公司，中国苏州，批号03010041）；HepG2肝癌细胞，
购自北京大学医学院第一附属医院病毒研究所；细胞培养
基RPMI1640为Gibco BRL产品；胎牛血清（FBS）购自杭州四
季青生物工程材料有限公司；其它试 剂均为国产分析 纯试
剂. 仪器及耗材：酶标仪（Bechmark，BIORAD公司生产）；高
速冷冻离心机（Allegra64R，Beckman公司产品）；智能双臂
系统自动工作台（Biomek FX，Beckman公司）以及操作软件
（Biomek FX），SEPBOX light 制备色谱自动工作台（MERCK
HITACHI），96 孔样品储存盒及 96 孔微量板（Beckman产
品）. 二氧化碳培养箱（MCO3/15AC，日本三洋）；倒置显微镜
雪灵芝不同提取物的生物活性*
刘笑笑1 万振江1 邓小波2 石 林1 卢晓霞1**
（1中国科学院成都生物研究所 成都 610041）
（2四川博力科技药业有限公司 成都 610036）
In Vitro Bioactivity of Different Extracts from Arenaria kansuensis Maxim*
LIU Xiaoxiao1, WAN Zhenjiang1, DENG Xiaobo2, SHI Lin1 & LU Xiaoxia1**
(1Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China)
(2Sichuan Boli Science & Technology Pharmaceutial Co. Ltd., Chengdu 610036, China)
Abstract Biological activities of aqueous extract and ethanol extract from Arenaria kansuensis Maxim, as well as the
commercial available oral nutritional liquid, were screened by a variety of in vitro models including proliferative effects on
protein tyrosine phosphatase, dipeptidyl peptidase IV, inhibition of α-glucosidase, enhancement of sensitivity of drug-resistant
MCF-7/ADR tumor cells, anti-tumor cytotoxic activities on HepG2 liver carcinoma cells and marrow cells were evaluated.
The results indicate that all the samples tested exhibit inhibition on protein tyrosine phosphatase, whereas no obvious effects
were observed on the other models. In conclusion, the active components of A. kansuensis can be traced by the protein tyrosine
phosphatase model. Tab 6, Ref 16
Keywords Arenaria kansuensis Maxim; aqueous extract; alcohol extract; biological activities
CLC R965.1
摘 要 采用蛋白酪氨酸磷酸酯酶（PTP1B）、二肽基肽酶（DPP-IV）、α-葡萄糖苷酶-rat（α-glucosidase-rat）、MCF-7/
ADR肿瘤耐药细胞增敏、肿瘤细胞毒活性（HepG2肝癌细胞）、骨髓有核细胞增殖等模型，对雪灵芝水提物、醇提
物和市售的雪灵芝营养口服液分别进行体外免疫调节、抗肿瘤、糖尿病等活性筛选 . 结果表明：雪灵芝水提物、醇
提物和营养口服液均对蛋白酪氨酸磷酸酯酶 /PTP1B模型呈阳性，对其余5种模型呈阴性，说明蛋白酪氨酸磷酸酯酶
（PTP1B）模型可以作为雪灵芝有效部位的活性跟踪模型. 表6 参16
关键词 雪灵芝；水提物；醇提物；口服液；生物活性
CLC R965.1
收稿日期：2010-01-06 接受日期：2010-03-01
*中国科 学院知 识创 新工 程 项目资助 Suppor ted by the Knowledge
Innovation Program of the Chinese Academy of Sciences
**通讯作者 Corresponding author (E-mail: luxx@cib.ac.cn)
6435 期 刘笑笑等：雪灵芝不同提取物的生物活性
（XSB3/IA，上海）；超净工作台（天津尘埃净化设备厂）. 雪
灵芝和市售的雪灵芝营养口服液由四川博力科技药业有限公
司提供.
1.2 方 法
1.2.1 雪灵芝水提法 去土称取阴干雪灵芝全草50 g剪碎，
以6倍量蒸馏水浸泡30 min后加热回流提取1 h，过滤得第一
次 水提取物，将滤 渣用同样方 法得第二次、第三次 水提取
物，合并3次滤液，浓缩干燥得雪灵芝水提取物.
1.2.2 雪灵芝乙醇提法 去土称取阴干雪灵芝全草50 g剪
碎，以6倍量的70%乙醇加热回流提取1 h，过滤得第一次乙醇
提取物，将滤渣用同样方法回流得第二次、第三次乙醇提取
物，合并3次滤液，减压蒸馏除去乙醇，得到雪灵芝醇提物.
1.2.3 蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂筛选实验 200 μL反 应体
系中含PTP-1B（重组表达）、100 mmol/L醋酸钠缓冲液（含
1 mmol/L EDTA，0.1% Triton-X-100，15 mmol/L β-巯基乙醇，
pH 6.0）和样品，同时 设 立空白对照（不含酶和样品）和阴
性对照（不含样品），37 ℃反应10 min，加入蛋白质酪氨酸
磷酸酶底物pNPP，37 ℃再反应30 min, 加入1 mol/L NaOH终
止反应,405 nm测定OD值. 根据OD值计算抑制率，抑制率 =
[1-(OD样品-OD正常)/(OD模型-OD正常)]×100. 初筛时每个
样品单浓度设双复孔，抑制率大于70%的样品测定IC50值，
每个样品梯度稀释6个浓度，每个浓度设双复孔. 根据抑制
率，应用Xlfi t软件中的4 Parameter Logistic Model计算IC50.
1.2.4 二肽基肽酶（DPP-IV）抑制剂筛选实验 200 μL反应
体系中含二肽基肽酶DPP-IV（Sigma）、25 mmol/L HEPES缓
冲液（含140 mmol/L NaCl，1% BSA，80 mmol/L MgCl2）和
样品，同时设 立空白对照（不含酶和样品）和阴性对照（不
含样品），室温反应10 min，加入二肽基肽酶底物GLY-PRO-
GLY-GLY，室温反应25~40 min，测定荧光强度F，激发波长
355 nm，发射波长460 nm. 根据荧光强度F值计算抑制率，抑
制率 = [1-(F样品-F空白)/(F阴性-F空白)]×100. 初筛时每个样
品单浓度设双复孔，抑制率大于50%的样品进行假阳性排除
实验，确证为阳性的测定IC50值，测定时每个样品梯度稀释
6个浓度，每个浓度设双复孔. 根据抑制率，应用Xlfit软件中
的4 Parameter Logistic Model计算IC50.
1.2.5 α-葡萄糖苷酶-rat（Alpha-glucosidase-rat）抑制剂筛选实
验 100 μL反应体系中含0.02 U葡萄糖苷酶（Sigma，G-0660）
或适量哺乳动物来源的葡萄糖 苷酶（由大鼠小肠组织中提
取）、67 nmol/L磷酸钠缓冲液（pH 6.8）和样品，同时设立空
白对照（不含酶和样品）和阴性对照（不含样品），37 ℃反应
10 min，加入0.1 mol/L麦芽糖，室温反应10 min，再加入200
μL的葡萄糖检测试剂，混匀后490 nm测定OD值. 根据OD值
计算抑制率，抑制率 = [1-(OD样品-OD空白)/(OD阴性-OD
空白)]×100. 初筛时每个样品单浓度设双复孔，抑制率大于
70%的样品测定 IC50值，每 个样品梯度稀释6 个浓度，每 个
浓度设双复孔. 根据抑制率，应用Xlfit软件中的4 Parameter
Logistic Model计算IC50.
1.2.6 MCF7/ADR肿瘤耐药细胞增敏筛选实验 取处于对数生
长期的K562/A02细胞和K562细胞,稀释成 3 × 105个/mL的细
胞悬液．以每孔200 μL接种到96孔培养板，分别加入浓度为
100、10 mg/L的ADM，倍比稀释8个浓度，同时设立空白（未
加药）组，置37 ℃、5% CO2的培养箱中培养48 h后，每孔加入
5g/LMTT 20 μL，继续培养4 h，弃去各孔内的液体，每孔加
入DMSO 150 μL，振荡10 min后，酶标仪540 nm处测定吸光度
A. 按公式计算细胞增殖抑制率：增殖抑制率 = (1-实验A/对
照孔A)×100. 初筛时每个样品单浓度设双复孔，样品生长抑
制率介于-10%~30%, 且增敏强度大于阳性对照verapamil增
敏强度90%的样品复筛, 复筛为阳性测定IC50值和逆转倍数.
1.2.7 肿瘤细胞毒活性(HepG2肝癌细胞)实验 HepG2肝癌
细胞接种于96孔板，培养过夜，加入样品（T），同时做不加
样品对照（C）和加药前对照（T0）. 加药前对照（T0）的细胞
加入TCA进行固定，留置待用. 加入样品（T）和不加样品对
照（C）的细胞继续培养48 h后再固定. 所有固定好的细胞以
SRB染液染色，再用醋酸溶液洗去游离的染料，空气干燥后
加入 Tris碱，振荡溶解混匀后490 nm测定OD值. 根据OD值
计算生长率，如果T ≥ T0，生长率 = (T-T0)/(C-T0)× 100；如果
T＜T0，(T-T0)/ T0×100. 初筛时每个样品单浓度设双复孔，重
复两次，生长率小于50%的样品测定GI50值，测定时每个样
品梯度稀释5个浓度，每个浓度设双复孔.
1.2.8 骨髓有核细胞增殖实验 颈椎脱臼法处死小鼠，取出
大腿股骨，剪去两端骨垢，用冰预冷的1640培养基将骨髓细
胞从骨髓腔完全吹出，用400目尼龙网过滤，加入冰预冷的
红细胞裂解液，静置8 min后离心，1 000 g 5 min 4 ℃，用培养
基重悬细胞，再重复离心两次. 用培养基重悬细胞，接种于
24孔板，20×104个/孔，接种后即加入样品，同时做不加样品对
照. 培养5 d后以MTT染色法检测D570 nm、D630 nm吸光值. 根据OD
值计算药物促进细胞生长的增殖率，增殖率=[(D570 nm-D630 nm)样
品组/(D570 nm-D630 nm)正常对照-1]×100. 初筛时每个样品单个浓
度设双复孔，增殖率大于50%的样品复筛，复筛时每个样品
梯度稀释3个浓度，每个浓度设双复孔.
2 结果与分析
2.1 蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂筛选实验
蛋白酪氨 酸磷酸酶1B是 蛋白酪氨 酸磷酸酶（PTP）家
族中的一员，在 胰岛素信号 转导途 径中发 挥重 要 作用. 近
年来研究发现，PTP-1B与2型糖尿病的发生、发展有密切关
系. 应用大肠杆菌表达系统,采用重组表达GST-PTP1B融合
蛋白，表达得到PTP-1B重组蛋白，以对-硝基苯基磷酸二钠
（pNPP）为底物观察样品对酶的活性抑制，以评价样品的抑
制效果. 采用的阳性参照化合物为Soduim Orthorandate. 表1
结果表明，100 µg/mL浓度下雪灵芝水提物、醇提物和口服
液体外直接与蛋白酪氨酸磷酸酶1B作用，与同等剂量对照组
Soduim Orthorandate相比，对蛋白酪氨酸磷酸酶1B具有抑制
作用. 雪灵芝水提物、醇提物和口服液的IC50值（µg/mL）分
别为0.94、1.35和0.56.
2.2 二肽基肽酶（DPP-IV）抑制剂筛选实验
由Sigma购买二肽基肽酶（DPP-IV），以GLY-PRO-GLY-
GLY为底物检测DPP-IV活性. 观察样品对酶的活性抑制，以
评价样品的抑制效果. 采用的阳性参照化合物为KR-62436.
表2结果表明，100 µg/mL浓度下的雪灵芝水提物、醇提物和
口服液体外直接与二肽基肽酶作用，与0.3 µg/mL浓度下的对
644 16 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol
照组KR-62436相比，对二肽基肽酶具有一定的抑制作用，但
其抑制作用远远小于阳性参照化合物KR-62436.
2.3 α-葡萄糖苷酶-rat（Alpha-glucosidase-rat）抑制剂
筛选实验
由大鼠小肠组织中提取α-葡萄糖苷酶，以麦芽糖为底物
检测α-葡萄糖苷酶活性. 观察样品对酶的活性抑制，以评价
样品的抑制效果. 采用的阳性参照化合物为Voglibose. 表3结
果表明，100 µg/mL浓度下的Voglibose与同等剂量雪灵芝水
提物、醇提物和口服液对α-葡萄糖苷酶抑制率比较，雪灵芝
水提物、醇提物和口服液对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作
用，但是其抑制作用远远小于阳性参照化合物Voglibose.
2.4 MCF7/ADR肿瘤耐药细胞增敏筛选实验
采用无毒剂量阿霉素培养MCF-7/ADR细胞，以SRB染色
法检测细胞活力，观察细胞增殖抑制的程度，评价样品对阿
霉素处理耐药细胞株的增敏效果. 采用的阳性参照化合物为
维拉帕米（Verapamil）. 表4结果表明，100.00 µg/mL浓度下的
雪灵芝水提物、醇提物和口服液体外直接与MCF7/ADR肿瘤
耐药细胞作用，与2.45 µg/mL浓度下的对照组Voglibose相比，
雪灵芝水提物、醇提物和口服液对MCF7/ADR肿瘤耐药细胞
无明显的敏感性，且对MCF7/ADR肿瘤耐药细胞均无明显的
抑制作用.
2.5 抗肿瘤活性筛选实验
以SRB染色法检测细胞活力，观察样品对肿瘤细胞增殖
的影响，以评价样品的抗肿瘤效果. 采用的阳性参照化合物
为紫杉醇（Taxol）. 表5结果表明，100 µg/mL浓度的雪灵芝水
提物、醇提物和口服液体外直接与HepG2肝癌细胞作用，与
10 µg/mL浓度的对照组Taxol相比，雪灵芝水提物、醇提物和
口服液对HepG2肝癌细胞均无明显的抑制作用.
2.6 骨髓有核细胞增殖实验
以MTT染色法检测小鼠骨髓有核细胞活力，观察样品
对细胞增殖的影响，以评价样品的免疫调节效果. 采用的阳
性参照化合物为SX0072-3. 表6结果表明，在100 µg/mL浓度
下，雪灵芝水提物、醇提物和口服液体外直接与骨髓有核细
胞作用，与同等剂量对照组SX0072-3相比，雪灵芝水提物和
醇提物均不能促进细胞增值，对骨髓有核细胞增殖反应成
抑制作用. 雪灵芝口服液虽然对骨髓有核细胞有一定的增值
作用，但是与阳性参照化合物相比，其作用也是微乎其微.
3 结 论
雪灵芝为石竹 科蚤缀属植物，具 有重要的生理功能和
表1 雪灵芝水提物、醇提物和口服液对蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制活性的影响
Table 1 Inhibitory effects of aqueous extract, alcohol extract from A. kansuensis and the commercial available oral nutritional liquid
on protein tyrosine phosphatase
模型名称
Model
样品名称
Sample
抑制率(r/%)
Inhibition
最大抑制率(r/%)
Maximum Inhibition
IC50
(ρ/µg mL-1)
浓度(ρ/µg mL-1)
Concentration
M-PTP1B
水提物 Aqueous extract 110.68 103.64 0.94 100.00
醇提物 Alcohol extract 94.99 90.87 1.35 100.00
口服液 Oral nutritional liquid 98.70 97.07 0.56 100.00
Soduim Orthorandate 101.00 96.38 9.10 100.00
表2 雪灵芝水提物、醇提物和口服液对二肽基肽酶（DPP-IV）抑制活性的影响
Table 2 Inhibitory effects of aqueous extract, alcohol extract from A. kansuensis and the commercial available oral nutritional liquid
on dipeptidyl peptidase IV
模型名称
Model
样品名称
Sample
抑制率(r/%)
Inhibition
浓度(ρ/µg mL-1)
Concentration
M-DPPIV
水提物 Aqueous extract 20.52 100.00
醇提物 Alcohol extract 15.81 100.00
口服液 Oral nutritional liquid 34.49 100.00
KR-62436 72.25 0.3
表3 雪灵芝水提物、醇提物和口服液对α-葡萄糖苷酶-rat（Alpha-glucosidase-rat）抑制活性的影响
Table 3 Inhibitory effects of aqueous extract, alcohol extract from A. kansuensis and the commercial available oral nutritional liquid
on α-glucosidase-rat
模型名称
Model
样品名称
Sample
抑制率(r/%)
Inhibition
浓度(ρ/µg mL-1)
Concentration
M-α-Glucosidase-rat
水提物 Aqueous extract 17.43 100.00
醇提物 Alcohol extract 18.41 100.00
口服液 Oral nutritional liquid 16.38 100.00
Voglibose 101.87 100.00
表4 雪灵芝水提物、醇提物和口服液对MCF7/ADR肿瘤耐药细胞增敏的影响
Table 4 Effects of aqueous extract and alcohol extract from A. kansuensis and the commercial available oral nutritional liquid on
enhancement of sensitivity of drug-resistant MCF-7/ADR tumor cells
模型名称
Model
样品名称
Sample
相对增敏率(r/%)
Relative Sensitization Rate
样品生长抑制率(r/%)
Growth Inhibition
浓度(ρ/µg mL-1)
Concentration
T-MCF7-ADR
水提物 Aqueous extract -41.61 -93.17 100.00
醇提物 Alcohol extract -67.83 -163.43 100.00
口服液 Oral nutritional liquid -3.86 -85.28 100.00
Verapamil 12.77 22.26 2.45
6455 期 刘笑笑等：雪灵芝不同提取物的生物活性
生物学活性. 化学研究表明，雪灵芝含有三萜及其皂甙、生
物碱（B-咔波啉）、多糖、黄酮、苯丙素、甾体及丰富的氨基
酸、维生素和微量元素. 近年来，三萜皂苷在抑制肿瘤、免
疫调节、抗病毒、抗菌等方面的生物活性引起了研究人员的
广泛关注，在石竹科蚤缀属植物中发现了21个三萜皂苷化合
物，其中19个为新化合物 [16]. 环肽类化合物也因其诸如抗肿
瘤、抗病毒、抗菌、免疫调节等多样生理活性逐渐成为石竹
科蚤缀属药用植物的一个研究热点[12]. 目前对雪灵芝药理作
用的研究还多停留在粗提物上，深入探讨其 有效的化学成
分及药理作用机制，对进一步开发和利用雪灵芝具 有重要
的意义. 我们采用蛋白酪氨酸磷酸酯酶（PTP1B）、二肽基肽
酶（DPP-IV）、MCF-7/ADR肿瘤耐药细胞增敏、α-葡萄糖苷
酶 -rat（α-glucosidase-rat）、肿瘤细胞毒活性（HepG2肝癌细
胞）和骨髓有核细胞增殖模型，对雪灵芝水提物、醇提物和
市售的雪灵芝营养口服液分别进行体外免疫调节、抗肿瘤、
糖尿病等活性筛选. 研究发现雪灵芝水提物、醇提物和口服
液均对蛋白酪氨酸磷酸酯酶（PTP1B）模型呈阳性，说明蛋白
酪氨酸磷酸酯酶（PTP1B）模型可以作为有效部位的活性跟
踪模型. 利用体外筛选模型的快速和方便，通过活性追踪目
标分子，指导有效部位的分离纯化工作，减少盲目性.
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表5 雪灵芝水提物、醇提物和口服液对肿瘤细胞毒活性（HepG2肝癌细胞）的影响
Table 5 Anti-tumor cytotoxic activities of aqueous extract and alcohol extract from A. kansuensis and the commercial available oral
nutritional liquid on HepG2 liver carcinoma cells
模型名称
Model
样品名称
Sample
生长率(r/%)
Growth Rate
浓度(ρ/µg mL-1)
Concentration
T-Cytoxity
水提物 Aqueous extract 120.29 100.00
醇提物 Alcohol extract 105.64 100.00
口服液 Oral nutritional liquid 105.79 100.00
Taxol 17.84 10.00
表6 雪灵芝水提物、醇提物和口服液对骨髓有核细胞增殖反应的影响
Table 6 Effects of aqueous extract and alcohol from A. kansuensis and the commercial available oral liquid suspension oral nutritional
liquid on α-glucosidase-rat
模型名称
Model
样品名称
Sample
抑制率(r/%)
Inhibition
浓度(ρ/µg mL-1)
Concentration
骨髓有核细胞增殖
水提物 Aqueous extract -15.65 100.00
醇提物 Alcohol extract -22.39 100.00
口服液 Oral nutritional liquid 13.30 100.00
SX0072-3 91.31 100.00