全 文 ：第 5 卷 第 5 期
2 0 14 年 5 月
黑龙江科学
H E IL O N盯 IA N G S C IE N CE
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.
5 N o
.
5
m ay 2 0 14
鲜黄连叶柄愈伤组织试管苗培养的研究
王晓炜 , 宋 波 , 张成鸿
( 大连医科大学基础医学院形态实验室 辽宁 大连 116 04 4)
摘要 : 为满足栽培和保护资源的需要 ,以叶柄段为材料 进行了愈伤组织生长和分化培养 、 生长芽试管苗培养及移栽
与移植的研究 成功获得了生长旺盛的试管苗 。 结果表明 : 2/ 3 M s + 6 一 B A o . 5 m g · L 一 1 + 蔗糖 3 6 9 · L 一 1 + 2 ,4 一 D
2
.
0 m g
·
L
一 1是叶柄段愈伤组织生长培养的适宜培养基 ; 1 2/ M s + 琼脂 0 . 5 % + 蔗糖 2 6 9 · L一 1 + 6 一 B AO. s gm · L 一 1 + N A A
0
.
1 m g
·
L
一 1 +
IA Ao
.
1 m g
·
L
一 1是愈伤组织分化培养的适宜培养基 ; 1 3/ M s + 琼脂 0 . 5 % + 蔗糖 16 9 · L一 1 + IA A 0 . 4 m g · L一 1
是生长芽生根培养的适宜培养基 。 试管苗移栽成活率为 92 . 4 % 移植成活率为 97 . 4 % 。 移植的试管苗能使野生鲜黄连
的植物学性状完全得到保持 。
关键词 : 鲜黄连 ; 愈伤组织 ; 试管苗
中图分类号 : 5 6 8 8 . 4 ; Q 94 3 . I T 5 文献标志码 : A 文章编号 : 1 6 7 4一 8 6 4 6 ( 2 0 1 4 ) 0 5一 0 0 6一 3
S t u d y o n t h e c a l l u s o f t e s t魂 u b e
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t e s t生 u b e s e e d l in g . T h e er s u lt s s h o w e d : Z z 3M s + 6 一 B A O. 5 m g · L 一 1 + s u e or s e 3 6 g · L 一 1 + 2 ,4 一 D2
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一 1 w a s s u i t a b le
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a g a心 . 5 % + s u e or s e 2 6 g · L一 1 + 6 一 B AO . 8 m g · L一 1 + N AAO . 1 m g · L一 1
+ I A A o一 m g · L 一 1 w a s s u i t a b le m e d iu m fo r e a l lu s d i fe er n t ia t io n e u l t u er ; 一 z3 M s + 0 . 5 % a g a r + s u e or s e一6 9 · L 一 1 + I A A
0
.
4 m g
·
L
一 1 w a s s u i t a b l e m e d i u m fo r g r o w th or o t i n g o f b u d s ; th e s u vr i v a l ar t e o f t e s t注 u b e s e e d lin g ’ 5 tar n s p l a n t i n g w a s 9 2 . 4 %
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.
4 %
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e t e s t生 u b e s e e d li n g m a i n t a i n e d b o t a n i e a l tar i t s o f w i ld elj 沦sr o n ia d u bi a 】人 z* i m .
K e y w o r d s : Je fe
r s o n i a d u b i a M肤 i m ; e a ll u s ; t e s t生 u b e s e e d li n g
鲜黄连 C I改沦r s on ia d ub ia 树“ , i m . ) 又称细辛幌子 、 毛黄 用 具有清热解毒 、 燥湿泻火 、 健胃止泻等功效 ,能治发热烦
连 、 常黄连 、 铁丝草等 ,属于小巢科 ( Be rb e ir dac ae e ) 鲜黄连 躁 、 赤白痢疾 、 食欲减退 、 恶心呕吐 、 口舌生疮 、 目赤肿疼等
属 ( eJ fe rs on i。 B a rt on ) 多年生草本植物 「1」 。 生长于 山坡灌 疾病 「3 万」; 因药用的需要 人们一 直在大量地采挖鲜黄连的
丛间 、 针阔叶混交林下或阔叶林下 ,一般生长于富含腐殖质 根和根茎 ,由此使鲜黄连的野生资源遭到严重破坏 。 现在
的湿润土壤上 。 在俄罗斯 、朝鲜及我国的黑龙江 、 吉林等地 在大连的庄河地区 ,已经很难采到野生的鲜黄连 。 有人尝
有分布 在辽宁地区的庄河 、 凤城 、 桓仁和宽甸等地也有分 试进行栽培 却难以获得种子或种苗 。 为保护资源 满足栽
布「川 。 鲜黄连的根和根茎含小巢碱 、 木兰花碱等生物碱 培的需要 研究者对鲜黄连进行了叶柄愈伤组织试管苗培
成分 全草含约 巧 % 的辣质 河提取烤胶和黄色染料 ; 嫩茎 养的研 究 。 尽 管已 有小巢 科植物 组 织培 养研 究的报
叶既可鲜食 ,又可作为家畜的饲料 ; 其根富含淀粉 ,做中药 道 「67] 但迄今未见鲜黄连属植物相关研究的报告 。
收稿日期 : 20 14一4一 14
基金项目 : 辽宁省重点实验室项 目( 2 009 50 61 ) ; 本研究在辽宁省植物工程重点实验室完成 。
作者简介 : 王晓炜 ( 19 7 一 ) 友 辽宁大连人 顽士 实验师 从事细胞生物学研究 。
责任编辑 :姜洋 1 3 20 4 93 87 2@ q .c om
1材料与方法
1
.
1材料灭菌及无菌苗的获得
21 01年 6月中旬 将大连甘井子区 山坡上麻栋林下鲜
黄连的种子采回来 胺照全叶延胡索研究「 8」的方法对其进
行灭菌后即可获得无菌种子 。 将无菌种子接种到 MS +蔗
糖 1 2 9· L一 1 +0 .6 4%琼脂培养基上 ,经过 4 o d 的光照 、
24 T 恒温培养 就能获得均有 3 一 4 片真叶的无菌苗 作为
研究用试验材料 。
1
.
2 培养条件
除了培养基琼脂含量为 0 . 48 % 光照 l h · d 一 1 光照
度 3 Z o xl 外 其他培养条件参见艾篙的研究 9[] 。
1
.
3 试验方法
1
.
3
.
1 愈伤组织培养
将无菌苗的叶片切成边长 0 . 3 一 0 . 4 e m 的叶片块 ,将
叶柄剪成长 0 . 4 c m 左右的叶柄段后 ,接种 8 种培养基上
进行不同培养基对叶片块和叶柄段愈伤组织诱导生长培养
的影响试验 。 这 8 种培养基分别是 : ( 1 ) 2 3/ M S + 6 一 B A
0
.
5 m g’ L 一 1 + 蔗糖 3 6 g’ L 一 1 + N A A2 . 0 m g’ L 一 1 ; ( 2) 2 3/ M s
+ 6 一 B AO . 5 m g’ L 一 1 + 蔗糖 36 g’ L 一 1 + IA A2 . 0 m g’ L 一 1 ;
( 3 ) 2 23 M s + 6
一 B AO . 5 m g · L 一 1 + 蔗糖 3 6 9 · L 一 1 + I B A
2
.
0 m g’ L 一 1 ; ( 4) 2/ 3 M s + 6 一 B AO . 5 m g · L 一 1 + 蔗糖
3 6 9生 一 1 + 2 井一 D2 . 0 m g · L 一 1 ; ( 5 ) L s + 6 一 B AO . 5 m g · L 一 1
+ 蔗糖 3 6 9 · L 一 1 + N A A2 . 0 m g · L 一 1 ; ( 6) Ls + 6 一 B A
0
.
5 m g’ L 一 1 + 蔗糖 3 6 9 · L 一 1 + IA A2 . 0 m g’ L 一 1 ; ( 7 ) Ls +
6 一 B AO . 5 m g’ L 一 1 + 蔗糖 3 6 9 · L 一 1 + 2 井一 D2 . 0 m g’ L 一 1 ;
( 8) L s + 6
一 B A o . s m g · L 一 1 + 蔗 糖 3 6 9 · L 一 1 + BI A
2
.
0 m g
·
L
一 1 ; 该试验重复 1 次 海种处理接种培养 60 个材
米斗。
1
.
3
.
2 愈伤组织分化培养
将验证试验培养的 3% 块愈伤组织 ,用手术刀切成边
长 0 . 35 c m 左右的块状后 接种到以下 6 种培养基上 : ( 9)
l z Z M s + 琼脂 0 . 5 % + 蔗糖 2 6 9 · L 一 1 、 ( 1 0 ) l zZ M s + 琼脂
0
.
5 % + 蔗糖 2 6 9 · L 一 1 + 6 一 B AO . 8 m g · L 一 1 、 ( 1 1 ) 1 zZ M s +
琼脂 0 . 5 % + 蔗糖 26 g’ L 一 1 + 6 一 B A O. 8 m g’ L 一 1 + BI A
0
.
1 m g’ L 一 1 、 ( 12 ) 12/ M s + 琼脂 0 . 5 % + 蔗糖 26 g’ L 一 1 +
6 一 B AO . 8 m g · L 一 1 + N A A O
.
1 m g
·
L
一 1 、
( 13 ) 1 2/ M s + 琼
脂 0 . 5 % + 蔗糖 26 g’ L 一 1 + 6 一 B AO . 8 m g’ L 一 1 + N A A
0
.
1 m g’ L 一 1 、 ( 14 ) 1 2/ M s + 琼脂 0 . 5 % + 蔗糖 26 9 · L 一 1 +
6 一 B AO . 8 m g’ L 一 1 + N A A O. 1 m g · L 一 1 + I A AO . 1 m g · L 一 1
放到恒温无光照 ( 下称恒温无光 ) 和变温 ( 白天 26 T 液晚
18 T ) 光照度 3 Zo xL ( 下称变温光照 ) 2 种条件下 进行不
同条件 、 不同培养基对愈伤组织分化培养的影响试验 。 该
试验重复 1 次 ,每种处理用 60 块愈伤组织进行试验 。
1
.
3
.
3 生长芽生根培养
将分化培养的生长芽从下部剪下后 ,立刻将下部切口
插入以下 5 种生根培养基中 ,进行不同培养基对生长芽生
根培养 影响的试验 。 这 5 种培 养基的组成如 下 : ( 1 5 )
1 3/ M s + 琼 脂 0 . 5 % + 蔗 糖 16 9 · L 一 1 + ABZT 号
0
.
4 m g’ L 一 1 、 ( 16 ) 1 3/ M s + 琼脂 0 . 5 % + 蔗糖 16 9 · L 一 1 +
BI A o
.
4 m g’ L 一 1 、 ( 17 ) 1 3/ M s + 琼脂 0 . 5 % + 蔗糖 1 6 9 · L 一 1
+ I A A o
.
4 m g
·
L
一 1 、
( 一8 ) 1 z 3 M s + 琼脂 0 . 5 % + 蔗 糖
16 9
·
L
一 1 + N A AO
.
4 m g
·
L
一 1 、
( 19 ) 1 z3 M s + 琼脂 0 . 5 % +
蔗糖 1 6 9 · L 一 1 + 2 井一 D o . 4 m g · L 一 1 。 此试验每种培养基
接种培养 5 0 个生长芽 。
1
.
3
.
4 试管苗移栽与移植
将由生长芽培养的试管苗移到日光温室中后 ,将试管
苗从培养瓶中取出 把根部放到没有直射光 、 底部有一层约
1 c m 厚水层的水盘中 进行水培炼苗 Z d ,再将根部的附着
物洗净 ,直接移栽到没有直射光 、 湿度为 85 % 左右的温室
苗床上 。 移栽后前 13 d 按照温室的正常环境进行管理 。
移栽试验一次性以 38 0 株试管苗进行试验 。
6 月 6 日 将移栽成活的 3 5 1 株试管苗中的 3 5 0 株 ( 其
中另 1 株因损伤死亡 ) 江次性移植到大连甘井子区的山坡
林下 。 移植后除了马上浇一次透水和移栽 s d 后再浇一 次
透水外 其他按照野生环境进行管理 。
2 结果与分析
2
.
1 不 同培养基对叶片块和叶栖段愈伤组 织生长培
养的影响试验
培养 58 d 时观察表明 : 以叶片块为材料在 8 种培养基
上均不能诱导生长出愈伤组织 ; 而以叶柄段为材料 在 ( 2)
号 、 ( 3) 号 、 ( 5) 号 、 ( 6) 号 、 ( 7 ) 号 、 ( 8) 号 6 种培养基上 ,也
不能诱导生长出愈伤组织 。 只有在 ( l) 号 、 ( 4) 号 2 种培养
基上才能不同程度地培养生长出愈伤组织 。 由表 1 可见
虽然在 ( l) 号培养基上叶柄段也能诱导生长出愈伤组织
但统计观察愈伤组织生长数 、 诱导生长率 、 愈伤组织块外观
长势 3 个重要指标都不如 ( 4) 号培养基 。 重复试验也得出了
基本一致的结果 。 在上述试验的基础上 ,又 1 次性将 4 50 个
叶柄段接种到 ( 4) 号培养基上 进行验证性试验 。 经过 58 d
的培养 获得 3% 块嫩绿色 、 质地较硬的愈伤组织 。 以上结
果说明 2 3/ M s + 6 一 B A o . 5 m g · L 一 1 + 蔗糖 36 9 · L 一 1 +
2 井一 D2 . 0 m g · L 一 1这种培养基是鲜黄连叶柄段愈伤组织
生长培养的理想培养基 。
表 1 不同培养基对叶柄段愈伤组织生长培养的影响
T a b
.
1 T h e e f l’e e t o f d ife r e in m e d i u m o n e a l lu s o f P e t i o l e
s e g m e n t
’ 5 e u l t u r e
培养基 接种叶柄 生长出愈伤 愈伤组织诱导 愈伤组织
段数 组织数 生 长率 % 外观长势
4 0
.
7
( 4 ) 6 0 53 88
.
3 + +
注 : + 表示长势一般 ; + + 表示长势旺盛 。
2
.
2不 同条件 、 不 同培养基对愈伤组织分化培养的影响
观察显示 在恒温无光的条件下 焙养的愈伤组织块不
分化 ;而在变温光照的条件下 ,( 9) 号 、 ( 10) 号和 ( 11) 号 3
种培养基上 焙养的愈伤组织块也不能分化 ,只有在 ( 12)
号 、 ( 13) 号和 ( 14) 号 3 种培养基上培养的愈伤组织才能不
同程度地分化出生长芽 。 结果由表 2 可见 ,从观察统计的
分化率和生长芽外观长势 2 项指标看 ,均为 ( 14) 号培养基
最好 并且重复试验的结果也几近一致 。 同时 在培养过程
中还发现 在 ( 14) 号培养基上 ,分化生长出生长芽的时间
最早 ( 培养到第 7 d 时就能分化出可见生长芽 ) ,分化的生
长芽高度最高 ( 平均高为 1 . 3 c m ) 。 为验证试验结果 ,将
8 0 0 块愈伤组织又一次性接种到 ( 14) 号培养基上 ,也获得
了基本一致的结果 。 由此证明 : 1 / Z M S + 琼脂 0 5 % + 蔗
糖 26 9 · L 一 1
I A AO
.
1 m g
·
L
宜培养基 。
表 2
T a b
。
2
+ 6 一 B AO . 8 m g · L 一 1 + N AA O
.
1 m g
·
L
一 1 +
一 1的培养基是鲜黄连愈伤组织分化培养的适
不同培养基对愈伤组织块分化培养的影响
T h e e l】沁e t o f d i l l七r e in m e d i u m o n e a l lu s
d i l l论r e in i a t i o n ’ 5 e u l t u r e
培养基 培养愈伤 分化出生长芽 愈伤组织 生长芽外
代 号 组织块数 愈伤组织数 分化率 % 观长 势
( 1 2 ) 60 2 6 4 3
.
3 +
( 1 3 ) 60 1 9 3 1
.
7 +
( 1 4 ) 60 54 90
.
0 + +
注 : + 表示长势 一般 ; + + 表示长势旺盛 。
2
.
3 不 同培养基对生长芽生根培养
培养到 3O d 时观察证明 在 ( 1 5 ) 号 、 ( 1 8 ) 号 、 和 ( 1 9 )
号 3 种培养基上培养的生长芽不仅不生根 ,而且在 ( 18 )
号 、 和 ( 19) 号 2 种培养基上培养的生长芽下部切口处会生
长大小为 0 . 3 一 0 . 7 c m 的愈伤组织块 。 在 ( 16) 号培养基上
培养的生长芽虽然可以生根 ,但效果不理想 ; 在 ( 17 ) 号培
养基上生根培养的生长芽生根培养的效果较理想 。 在这一
培养基上 焙养的 50 个生长芽 ,不仅生根率达到了 92 % .
平均每株试管苗生根 6 . 1 条 ,而且培养的试管苗外观上生
长旺盛 。 对这一生根试验的研究过程观察还表明 在 ( 1 7 )
号培养基上培养到第 6 d 时可见有的生长芽发出可见根
最后成长为试管苗 。 培养到第 lZ d 时 邵 % 的培养生长芽
会成为试管苗 。 为验证以上结果 ,又 1 次性在 ( 17 ) 号培养
基上对 4 0 0 个生长芽进行生根培养的验证性试验 ,共获得
38 2 株试管苗 注根率为 95 . 5 % ,其他结果也与初次试验
几近一致 。 以上 结果说明 , 1 3/ M S + 琼脂 0 . 5 % + 蔗糖
16 9
·
L
一 1 +
IA A O
.
4 m g
·
L
一 1是鲜黄连生长芽生根培养的适
宜培养基 。
2
.
4 试管苗移栽与移植
移栽后的第 s d 可见有的试管苗发出新叶 ; 移栽后第
1 3 d 约 9 0 % 的成活试管苗发 出可见新叶 。 移栽后第 3 5 d
统计结果表明 移栽成活的试管苗为 351 株 平均成活率为
92
.
4 % 并且成活的试管苗外观上正常 。
移植后 4 O d 统计 ,成活了 342 株 ,成活率为 97 . 4 % 。
移植后 60 d 试管苗明显出现了生长旺盛 、根系非常发达等
特点 。 翌年 5 月移植的试管苗开花 野生鲜黄连的植物学
性状完全得到保持 。
3 讨论
移植的试管苗能使野生鲜黄连的植物学性状完全得到
保持的结果说明 该研究所获得的试管苗 不仅可以作为栽
培鲜黄连的种苗 也为鲜黄连的野生资源保护奠定了技术
基础 。
在进行生长芽生根培养的研究时 ,出现了在 ( 18) 号和
( 19 ) 号 2 种培养基上培养的生长芽下部切口处生长大小
为 0 . 3 一 0 . 7 c m 的愈伤组织块的现象 。 本研究进行生根培
养的 5 种培养基的差异 ,就在于培养基中加入了不同的生
长调节剂 。 在 ( 18) 号培养基中加入的生长调节剂是 N A A
而在 ( 19 ) 号培养基中加入的生长调节剂是 2 井 一 D 。 在加
入了较低浓度的 N A A 和 2 井 一 D 的生根培养基中也会使
培养的生长芽下部生长出愈伤组织的现象说明 在该研究
中所使用 的 5 种生长调节剂 ,其中的 N A A 和 2 井 一 D Z 种
生长调节剂促进生长愈伤组织的作用较强 。 这种结果与前
人的相关研究一致 「10] 。
参考文献 :
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