全 文 ：0 引言
太行花（Taihanggia rupestris YU et LI）是蔷薇科单
种属植物，中国特有。它是蔷薇科草本仙女木族最原
始的二倍体植物，属古老的残遗种，在仙女木族进化上
占有特殊的位置，对于阐明蔷薇科一些类群的起源和
演化问题具有重要意义[1]。仅生长于海拔 1 000 m左
右的悬崖绝壁。3—4月份开花，植株较矮呈莲座状，
花冠直径3~4.5 cm左右，每株开花3到数十朵，素白色
的花冠映衬嫩黄色花药，点缀以碧绿的叶片，娇艳可
爱，被誉为岩壁奇花，是一重要野生草本花卉资源。由
于其分布区狭窄，生境独特，分布范围日益缩减，濒临
灭绝，被列为中国二级保护植物[2]。
基金项目：河南农业大学博士科研启动基金“重要植物的谱系地理学研究”（30400246）。
第一作者简介：方向民，男，1986年出生，河南南阳人，在读硕士。
通讯作者：王红卫，男，1969年出生，河南驻马店人，博士，副教授，硕士生导师，从事植物学和植物保护的教学和研究。通信地址：450002河南省郑州
市文化路95号河南农业大学植物保护学院，E-mail：whwcas@yahoo.cn。
收稿日期：2009-04-16，修回日期：2009-05-08。
太行花DNA提取的优化和适用分子标记检测
方向民，王红卫，程月琴，叶永忠，杨 程
（河南农业大学，郑州 450002）
摘 要：比较了常规 CTAB法、改良 CTAB法和 SDS法对太行花叶片总DNA的提取效果，并对改良
CTAB法提取的DNA在多种分子标记中的适用性进行了测试。结果表明：常规CTAB法提取的DNA
难以完全溶解，且有褐化现象；SDS法提取的DNA产率及纯度都很低；改良CTAB法提取的DNA产率
高且稳定，无明显降解，杂质少，OD260/OD280值在1.8左右。以改良CTAB法提取的DNA为模板，应
用叶绿体和线粒体通用引物扩增出了特异性的高效产物，ISSR和RAPD引物对总DNA的扩增也获得
理想结果。因此，改良CTAB法适用于太行花总DNA提取，其产物能满足核、叶绿体和线粒体基因组分
子实验的要求。
关键词：太行花；DNA提取；CTAB法；SDS法；分子标记
中图分类号：S58；S682.1+9 文献标识码：A 论文编号：2009-0795
Optimization of Total DNA Extraction and Test of Suitable Molecular
Markers in Taihanggia rupestris
Fang Xiangmin, Wang Hongwei, Cheng Yueqin, Ye Yongzhong, Yang Cheng
(Henan Agricultural University, Zhengzhou, Henan 450002)
Abstract: The total DNA was isolated from the leaf of Taihanggia rupestris YU et LI by the conventional
CTAB method，improved CTAB method and SDS method. The extracts by improved CTAB method were tested
as the template for several molecular marker types．The results showed the extracts by conventional CTAB
method were brown and could not dissolve completely, and those by SDS method had a low quality and yield.
As for the improved CTAB method, there was a high production rate of the extracts，that was pure with little
degradation，and A260/A280 was 1.8 or so. With these leaf DNA serving as template, PCR at two loci of
mitochondrial and chloroplast genomes was effective and special highly. Besides, these totals DNA were good
templates for SSR and RAPD molecular markers. So improved CTAB method is a good protocol by which the
total DNA was isolated from the leaf of T. rupestris, its product meet the requirement of PCR amplification for
the nuclear, chloroplast and mitochondrial genomes.
Key words:Taihanggia rupestris, DNA extraction, CTAB method, SDS method, molecular marker
中国农学通报 2009,25(18):57-60
Chinese Agricultural Science Bulletin
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
以分子生物学为手段的保护遗传学研究在濒危植
物保护中发挥着重要作用。从长远上看，濒危物种保
护对策的制定必须同遗传因子和环境因子结合起来考
虑。只有在弄清物种的遗传结构和遗传多样性现状的
前提下，才能够制定出切实可行的保护策略，否则，任
何物种保护措施的实施，都不会取得实质性的成效[3]。
此外，分子育种是当前品种改良的重要手段。
基因组DNA的提取是分子生物学研究的基础，能
否得到高质量的DNA是分子群体遗传学研究和分子育
种成败的关键。植物DNA提取的方法及优化很多[4-6]，
但太行花DNA提取方法却未见有相关报道。笔者通
过比较常规CTAB法、改良CTAB法、SDS法对太行花
基因组DNA的提取效果，筛选太行花DNA提取的适
宜方法，为进一步开展太行花分子生物学方面的研究
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验时间、地点
实验于 2009年 1—4月在河南农业大学植物保护
学院中心实验室完成。
1.2 植物材料
供试材料太行花（Taihanggia rupestris YU et LI）幼
叶采集于河南辉县，硅胶干燥保存。
1.3 仪器与试剂
仪器：恒温水浴锅；低温冷冻离心机（SIGMA
3K30）；紫外分光光度计（Nanodrop ND-1000）；电泳仪
（北京六一 DYY-8B型）；UVP凝胶成像系统
试剂：2×Master Mix（TIANGEN KT201）；线粒体
引物（上海生工）；叶绿体引物（上海生工）；ISSR及
RAPD引物（上海生工）；十六烷基三甲基溴化铵
（CTAB）、十二烷基磺酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸
(EDTA)、聚乙烯吡咯烷酮 k30(PVP k30)、氯仿、异戊醇
等均为国产分析纯；三羟甲基氨基甲烷(Tris)（生化试
剂）；β-巯基乙醇（化学纯）。
1.4 方法
1.4.1 基因组DNA提取方法
（1）常规CTAB法参照邹喻苹等[7]。
（2）改良CTAB法：①称取0.12 g经硅胶干燥的太
行花幼叶于-20℃预冷的研钵中，适量PVP干粉，液氮
研磨成粉后转移到2 ml离心管。②加入700 μl CTAB
提取缓冲液（(2% CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.5 mol/L
EDTA，l00 mmol/L Tris-HCl），12 μl β-巯基乙醇，混匀。
冰浴20 min。③加入700 μl CTAB提取缓冲液，65℃水
浴 50 min，期间不时摇动。④加入 110 μ l 5 mol/l的
KAc，冰浴 30 min。4℃，10 000 r/min离心 10 min，取
上清。⑤加入等体积的氯仿 -异戊醇，轻轻颠管
10 min。4℃、10 000 r/min离心10 min。取上清，重复
步骤5。⑥取上清，加入等体积预冷的异丙醇，室温放
置 30 min，4℃、8 000 r/min离心 10 min，弃上清，75%
乙醇清洗沉淀 2~3次。⑦室温干燥，0.1×TE 100 μl溶
解备用。
（3）SDS法：除硅胶干燥太行花幼叶称取量为
0.12 g，DNA为100 μl 0.1×TE溶解外，其他试剂配方及
试验步骤参见文献[6]的改良SDS法。
1.5 DNA质量检测
取6 μl DNA原液加1 μl上样缓冲液混匀，0.8%琼
脂糖凝胶(含 0.5 μg/ml EB)电泳，用 l×TAE电泳缓冲
液，5 V/cm电泳30 min，紫外灯下观察并照相；另取5 μl
DNA原液，稀释10倍，Nanodrop ND-1000紫外分光光
度计测定OD260和OD280，检测DNA纯度和浓度。
1.6 DNA适用性检测
选用叶绿体引物 Trnlc-Trnld[8]及线粒体引物
NAD4exon1-NAD4exon2[9]进行 PCR扩增，反应体系
（20 μl）:模板 1 μl，引物1 1 μl引物2 1 μl，2×Master Mix
（TIANGEN KT201）10 μl，ddH2O 7 μl；反应为 35个循
环，每个循环包括94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃
延伸1 min。
选用 ISSR引物UBC842进行总DNA PCR扩增，
反应体系（20 μl）：模板 1 μl，引物 1 μl，2×Master Mix
（TIANGEN KT201）10 μl，ddH2O 8 μl；反应为 35个循
环，每个循环包括94℃变性40 s，56℃退火45 s，72℃
延伸1 min 30 s。
选用非选择性 RAPD 随机引物 S344 进行总
DNAPCR扩增，退火温度为37℃，其他参数参照上面
ISSR引物反应。
取叶绿体、线粒体扩增产物6 μl，RAPD及 ISSR扩
增产物 10 μl在 1.2%琼脂糖凝胶上电泳检测，根据电
泳图谱的清晰度、多态性进一步评价DNA质量。
2 结果与分析
试验表明，常规CTAB法提取的DNA难以完全溶
解，轻微褐化；SDS法提取的DNA溶解后较为粘稠，用
枪头不易吸取，可能有多糖及酚类污染；改良CTAB法
提取出的DNA溶液清亮，易溶解，无粘稠感。
从琼脂糖凝胶电泳（图 1）可以看出，3种方法提
取的 DNA均无明显拖尾现象，说明所得 DNA完整
性均较好，无降解；点样孔内都无杂质残留且DNA
条带清晰；在DNA产率方面，改良CTAB法最高，常
规 CTAB法次之，SDS法所得 DNA最少，DNA条带
较弱。
·· 58
根据紫外分光光度计测得的OD260/OD280比值(表
1)：常规 CTAB法OD260/OD280比值偏小，为 1.67，改良
CTAB法为 1.82，SDS法为 1.43，只有改良CTAB法测
的比值最接近 1.80，表明DNA最纯，污染小。从计算
的DNA浓度比较，与琼脂糖凝胶电泳的结果相一致，
改良 CTAB法DNA浓度最高，为 373.7 ng/ul 。经计
算，3种提取方法DNA的产率比较为：改良CTAB>常
规CTAB>SDS法。
通过琼脂糖及紫外分光光度计检测，发现改良
CTAB法提取效果明显较其他两种方法好，因此，笔者
进一步对此法提取DNA的适用性进行检测。随机选取
5个改良CTAB法提取DNA的样本，进行叶绿体和线粒
体特异引物的PCR扩增和检测（图2，图3），结果表明样
本的扩增效率高（条带亮度高）、特异性强（条带单一）。
图2 叶绿体引物(Trnlc-Trnld)扩增结果
注：M：Marker；1~5：改良CTAB法提取的5个DNA样本（以下同）。

M 1 2 3 4 5
图3 线粒体引物(NAD4exon1-NAD4exon2)扩增结果
M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5
表1 3种方法提取DNA的质量和产率
样品编号
1
2
3
提取方法
常规CTAB
改良CTAB
SDS
OD260/OD280
1.67
1.82
1.43
DNA浓度/(ng/μl)
254.3
373.7
106.4
DNA产率/(μg/g)
211.9
311.4
88.67
在总DNA中，ISSR引物共扩增出 5条条带，最长
的条带约1 200 bp，最短的约300 bp（图4，图5）；RAPD
引物扩增出了 8条条带，长度范围介于 300~2 000 bp
之间。ISSR和RAPD扩增出的条带均清晰且重复性
较好。 ISSR和 RAPD的扩增结果同时表明，改良
CTAB法提取的DNA适宜进行总DNA（主要是核基因
组）ISSR及RAPD分子标记研究。
3 讨论与结论
DNA提取方法主要有十二烷基磺酸钠(SDS)法和
十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法等，针对植物组织而
方向民等：太行花DNA提取的优化和适用分子标记检测 ·· 59
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
言，CTAB法更为常用[7]。在常规CTAB法的基础上，针
对不同材料特点及实验方法进行改进的报道很多 [4-6]。
借鉴前人的结果，太行花的改良CTAB法提取DNA主
要有以下方面的改进：水浴裂解细胞前，加CTAB提取
液冰浴 30 min，使得部分细胞破裂，且细胞内多糖、蛋
白、酚类等次生物质经冰浴后沉到离心管的底部，有利
于提纯；加入5 moL/l KAc冰浴30 min的步骤，有效的
去除了蛋白质[9]和多糖[10]；提取过程适当加大β-巯基乙
醇、PVP等防氧化剂用量，有效地防止组织褐化现象发
生 [11]，PVP同时能有效去除多糖 [12]，且β-巯基乙醇和
PVP配合使用，能够有效地防止多酚污染[13]；在加入预冷
异丙醇沉淀DNA过程中，由-20℃下30 min改为室温
30 min，提高了沉淀温度，减少了部分杂质的沉淀；另
外，在沉淀结束后离心过程中，离心力由 12 000 r/min
改为8 000 r/min，降低离心速度，也能防止酚类、多糖、
单宁等次生代谢物质与DNA一起被沉淀。上述步骤
在减少杂质沉淀的同时，虽然也降低了DNA的产量，
但与另外两种方法相比，其可利用得率更高。因为常
规CTAB法所提DNA不能完全溶解，一部分DNA会
包裹在沉淀中，SDS法提取的DNA与多糖、单宁等结
合成粘稠的胶状物，这些因素都降低了DNA利用率，
相对提高了改良CTAB法DNA的得率。
PCR扩增检测显示，用 ISSR及RAPD非特异性引
物对样本扩增时，效率稳定且重复性好。用特异性引
物（叶绿体及线粒体引物）进行扩增时，都扩增出了目
的条带，且扩增产物亮度相差不大，说明所提DNA的
纯度高且稳定性好。
通过综合比较，改良CTAB法提取DNA效果最
佳，其产率高且稳定，杂质去除较干净，无褐化现象，能
够获取高质量太行花DNA。可以为核、叶绿体和线粒
体基因组的后续研究提供模板，也适用于特异性
（Trnlc-Trnld、NAD4exon1-NAD4exon2）和非特异性
（ISSR、RAPD）分子标记。
参考文献
[1] 余德浚,李朝銮.蔷薇科太行花属系统位置的研究[J].植物分类学
报,1983,21(3): 229-235.
[2] 傅立国,金鉴明,冯国楣,等.中国植物红皮书:第一册[M].北京:科学
出版社,1992.
[3] 时明芝,肖宜安,李晓红.保护遗传学及其在濒危植物研究中的应
用[J].世界林业研究,2003,16(4):13-16.
[4] 邹喻苹,汪小全,雷一丁,等.几种濒危植物及其近缘类群总DNA的
提取与鉴定[J].植物学报,1994,36(7):528-533.
[5] 汤文开,谭新,张辉,等.一种快速简单高效提取植物DNA的方法
[J].华中师范大学学报,2007,41(3):447-449.
[6] 蒋细旺,包满珠,李智崎,等.菊花DNA提纯方法的优化[J].江汉大
学学报,2002,19(3):42-44.
[7] 邹喻苹,葛颂,王晓东.系统与进化植物学中的分子标记[M].北京:
科学技术出版社,2000:1-50.
[8] Taberlet P, Gielly L, Pautou G. et al. Universal primers for
amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA[J].
Plant Molecular Biology, 1991, 17(5):1105-1109.
[9] Demesure B, Sodzi N, Petit R J. A set of universal primers for
amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial
and chloroplast DNA in plants[J]. Molecular Ecology, 1995, 4(1):
129-134.
[l0] Dellaporta S L, Wood J, Hicks J B. A plant DNA mini preparation：
version II[J]. Plant Biol Rep, 1983,1(4):19-21.
[11] 彭建营,束怀瑞,彭士琪.一种适合枣和酸枣基因组DNA的提取方
法[J].河北农业大学学报,2000,23(4):46-48.
[12] 王卓伟,余茂德,鲁成.PVP在桑叶总DNA提取中的应用[J].西南农
业大学学报,200l,23(1):61-65.
[13] 刘玉皎,李萍,张小田.β-巯基乙醇和PVP对蚕豆DNA质量的影响
[J].湖北农业科学,2008.47(3):248-250.
图4 ISSR引物UBC889扩增结果 图5 RAPD引物S344扩增结果


M 1 2 3 4 5M 1 2 3 4 5
·· 60