全 文 :基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金(2011211A092)
作者简介:付 玲(1972-),主管中药师,研究方向:中药材质量标准研究。
通信作者:赵翡翠,女,硕士,副主任中药师,硕士生导师,研究方向:中药材资源及质量标准研究,E-mail:zzffcc@126.com。
·基础医学研究·
HPLC法测定新疆准噶尔乌头不同炮制品中
单酯型生物碱的含量
付 玲1,吴 超2,赵翡翠1
(1新疆医科大学附属中医医院药学部,乌鲁木齐 830000;2新疆医科大学中医学院,乌鲁木齐 830011)
摘要:目的 建立新疆准噶尔乌头中单酯型生物碱的高效液相色谱(high performance liquid chromatogra-
phy,HPLC)含量测定方法。方法 采用X Bridge C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),以四氢呋喃-乙腈(3∶5)
为流动相A,以0.1mol/L醋酸铵溶液(每1 000mL加冰醋酸0.5mL)为流动相B,进行梯度洗脱,检测波长为235nm。
结果 准噶尔乌头分别按药典法、高压蒸法、加辅料法炮制后双酯型生物碱水解为苯甲酰乌头碱,炮制方法不同,
单酯型生物碱的含量也有所不同,准噶尔乌头中苯甲酰乌头原碱的含量约为制川乌的2/5,准噶尔乌头药典法炮制
品中苯甲酰乌头原碱的含量与制川乌相似,准噶尔乌头高压蒸法炮制品中苯甲酰乌头原碱的含量约为制川乌的
3.4倍,准噶尔乌头加辅料法炮制品中苯甲酰乌头原碱的含量约为制川乌的1/2,3种炮制品中单酯型生物碱含量
大小依次为高压蒸法炮制品>药典法炮制品>加辅料法炮制品。结论 准噶尔乌头炮制品中单酯型生物碱的
HPLC含量测定方法简便、可行,为进一步开发和利用奠定了基础。
关键词:准噶尔乌头;炮制品;单酯型生物碱;高效液相色谱法
中图分类号:R883 文献标识码:A 文章编号:1009-5551(2013)01-0042-05
Analysis of monoester alkaloids in Aconitum soongaricum
prepared products by HPLC
FU Lin1,WU Chao2,ZHAO Fei-cui 1
(1 Department of Pharmacy,Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital,
Xinjiang Medical University,Urumqi 830000,China;2 Traditional Chinese Medical College,
Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China)
Abstract:Objective To set up high performance liquid chromatography(HPLC)method of monoester al-
kaloids in Aconitum soongaricumand prepared products.Methods We used X Bridge C18chromatographic
column(250mm×4.6mm,5μm),took tetrahydrofuran-acetonitrile(3∶5)as mobile phase A,0.1mol/L
第36卷 第1期 新 疆 医 科 大 学 学 报 Vol.36 No.1
2013年1月 Journal of Xinjiang Medical University Jan.2013
Solution of ammonium acetate(each 1 000mL added glacial acetic acid 0.5mL)as mobile phase B,gradi-
ent elute,detected wavelength for 235nm.Results Diester diterpenoid alkaloids in Aconitum soongaricum
prepared were transformed to monoester alkaloids,the contents of its were different according to different
prepareing methods.monoester alkaloids in Aconitum soongaricumwas 2/5of prepared radix aconite,mo-
noester alkaloids in pharmacopeia prepared product of Aconitum soongaricumwas similar to prepared radix
aconite,monoester alkaloids in high-pressure steamed prepared product of Aconitum soongaricumwas 3.4
times of prepared radix aconite,monoester alkaloids in adding accessories prepared product of Aconitum
soongaricumwas 1/2of prepared radix aconite,the successive order of three prepared products were high-
pressure steamed prepared product>pharmacopeia prepared product>adding accessories prepared prod-
uct.Conclusion HPLC method is simple,accurate,high sensitivity,it can be used in determination of the
monoester alkaloids fromAconitum soongaricum ,which had potential medicinal value and are worthy of
further being studied.
Key words:Aconitum soongaricum;prepared products;monoester alkaloids;high performance liquid chro-
matography(HPLC)
准 噶 尔 乌 头 为 毛 茛 科 植 物 准 噶 尔 乌 头
(Aconitum soongaricumStapf)的干燥块根,块根是
入药部位,主要产于我国新疆北疆地区,民间常做草
乌的代用品使用,味辛、苦,大热,有毒,具祛风散寒、
止痛消肿、通经活络的功效[1]。新疆地域辽阔,干旱
高寒,生态环境恶劣,风湿类疾病成为新疆地区常见
病、多发病,且缠绵难愈,准噶尔乌头在治疗此类疾
病方面,有独特的优势[2]。据有关研究表明[3-4],准
噶尔乌头含有准噶尔乌头碱、12-表-欧乌碱及12-
表-脱氢欧乌碱。本课题组前期研究表明准噶尔乌
头含有大多数乌头属植物中所含的活性成分———双
酯型生物碱(乌头碱、次乌头碱、新乌头碱),毒性较
大,必须经过炮制后,双酯型生物碱水解为毒性较小
的单酯型生物碱方可用于临床内服。因此,本实验
采用高效液相色谱法(HPLC)方法测定准噶尔乌头
炮制品中的单酯型生物碱,为揭示新疆准噶尔乌头
炮制减毒机理奠定基础。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters2695高效液相色谱仪(美国
Waters公司),AG-135电子分析天平(梅特勒-托利
多仪器有限公司),SK3300LH超声清洗器(上海科
导超声仪器有限公司),Direct-QTM5超纯水仪
(Milipore公司)。
1.2 试药 制川乌样品购自安徽省亳州市双华中
药饮片厂(批号111015,产地:四川),经新疆医科大
学附属中医医院中药药学实验室李永和主任中药师
鉴定均为毛茛科植物乌头 (Aconitum carmichaeli
Debx.)干燥母根的炮制品。准噶尔乌头样品于
2011年采自新疆伊犁地区尼勒克,经李永和主任中
药师鉴定为毛茛科植物准噶尔乌头 (Aconitum
soongaricum Stapf.)的干燥块根。苯甲酰乌头原
碱、苯甲酰新乌头原碱(北京伊普瑞斯科技有限公
司,批号:110612-200901、110620-200901),其他试
剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 炮制方法
2.1.1 药典法炮制品[5] 取净准噶尔乌头,大小个
分开,用水浸泡7d至内无干心,取出,加水煮沸
5h,取大个切开内无白心、口尝微有麻舌感时,取出,
晾至六成干后切薄片,干燥,粉碎过三号筛,即得。
34 第1期 付 玲,等:HPLC法测定新疆准噶尔乌头不同炮制品中单酯型生物碱的含量
2.1.2 高压蒸法炮制品[6-7] 准噶尔乌头清洗、闷
润后,固定温度为126℃,压力为0.15MPa,蒸制
90min,70℃低温烘干,粉碎过三号筛,即得。
2.1.3 加辅料法炮制品[1] 将准噶尔乌头浸泡于
水中,每天换2次水,至15d后除去苦味,然后取甘
草汁和黑豆汁与乌头一起用水煮沸5h至内无白
心、口尝无麻或微有麻舌感为度,取出晾干后切成片
状或其他形状晒干或烘干后,粉碎过三号筛,即得。
每100kg准噶尔乌头用甘草8kg、黑豆10kg。
2.2 色谱条件与系统适用性试验[8-13]
2.2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填
充剂;以四氢呋喃-乙腈(3∶5)为流动相 A,以
0.1mol/L醋酸铵溶液(每 1 000 mL 加冰醋酸
0.5mL)为流动相B,按表1中的规定进行梯度洗
脱;检测波长为235nm。按苯甲酰乌头原碱峰计算
理论板数应不低于2 000。结果供试品及对照品色
谱分离度良好,见图1,洗脱方法见表1。
表1 梯度洗脱
时间/min 流动相A/% 流动相B/%
0~48 15→26 85→74
48~49 26→35 74→65
49~58 35 65
58~65 35→15 65→85
A:对照品 B:制川乌
C:准噶尔乌头生品 D:药典法炮制品
E:高压蒸法炮制品 F:加辅料法炮制品
1:苯甲酰新乌头原碱;2:苯甲酰乌头原碱
图1 准噶尔乌头不同炮制品中单酯型生物碱对照品和样品的色谱图
44 新 疆 医 科 大 学 学 报 第36卷
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取苯甲酰新乌
头原碱、苯甲酰乌头原碱对照品适量,置25mL量
瓶中,加三氯甲烷-异丙醇(1∶1)混合溶液制成每
1mL含苯甲酰新乌头原碱0.3mg、苯甲酰乌头原
碱0.5mg的混合对照品溶液,即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取制川乌、准噶尔乌头
生品以及其他3种炮制品粉末(粉碎后过三号筛)各
2g,精密称定,置锥形瓶中,加10%氨试液5mL,浸
润,精密加入乙酸乙酯-异丙醇(1∶1)混合溶液
50mL,称定重量,超声处理(功率300 W,频率
40kHz;水温<25℃)30min,放冷,再称定重量,用
异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液补足减失的重量,
摇匀,滤过。精密量取续滤液45mL,40℃以下减
压回收溶剂至干,残渣精密加入异丙醇-三氯甲烷
(1∶1)混合溶液5mL溶解,滤过,取续滤液,即得。
2.2.4 线性范围的考察 分别精密吸取“2.2.2”项
下对照品溶液各0.5、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、
50.0、60.0、70.0μL,分别测定峰面积积分值。以苯
甲酰乌头原碱对照品、苯甲酰新乌头原碱对照品的
进样浓度为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,进行线
性回归,得苯甲酰乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱回
归方程分别为y=46 175 397x+248 834,y=
31 997 455x-35 0000,相关系数分别为r=0.999 9、
r=0.999 8。表明苯甲酰乌头原碱和苯甲酰新乌头
原碱进样浓度分别在 0.125~2.000、0.075~
1.200mg/mL范围内与峰面积有良好的线性关系。
2.2.5 精密度考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品
溶液10μL,连续进样5次,按上述色谱条件进行测
定,结果苯甲酰乌头原碱峰面积的 RSD 值为
1.03%,苯甲酰新乌头原碱峰面积的 RSD 值为
1.43%,表明精密度较好。
2.2.6 稳定性试验 按“2.2.3”项下方法制备供试
品溶液,精密吸取,按上述色谱条件进行测定,每隔
2h进样1次,共考察8h,结果制川乌、准噶尔乌头
生品、药典法炮制品、高压蒸法炮制品、加辅料法炮
制品中苯甲酰乌头原碱峰面积的 RSD值分别为
0.91%、0.51%、0.99%、0.29%、0.36%;苯甲酰新
乌头原碱峰面积的RSD值为1.51%,表明供试品
溶液稳定性较好。
2.2.7 重复性试验 精密称取各样品6份,按
“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件
进行测定,结果制川乌、准噶尔乌头生品、药典法炮
制品、高压蒸法炮制品、加辅料法炮制品中苯甲酰乌
头原碱峰面积的RSD值为1.29%、0.16%、0.58%、
0.97%、1.36%;苯甲酰新乌头原碱峰面积的 RSD
值为1.17%,表明供试品溶液重复性较好。
2.2.8 加样回收率试验 取已知量准噶尔乌头药
典法炮制品6份,每份2g,精密称定,每份分别加入
“2.2.2”项下苯甲酰乌头原碱对照品溶液各1mL,
按“2.2.3”项下方法制得供试品溶液。按上述色谱
条件测定,计算回收率,结果平均回收率为97.83%,
RSD=1.43%,见表2,表明本测定方法的回收率
较好。
表2 苯甲酰乌头原碱加样回收率测定结果
编号
原有量
/mg
测定量
/mg
加入量
/mg
回收率
/%
平均回收
率/%
RSD
/mg
1 0.437 5 0.931 7 0.5 98.85
2 0.437 5 0.925 3 0.5 97.56
3 0.437 5 0.933 1 0.5 99.12 97.83 1.43
4 0.437 5 0.920 3 0.5 96.58
5 0.437 5 0.930 8 0.5 98.66
6 0.437 5 0.933 6 0.5 99.21
2.2.8 样品的测定 分别取准噶尔乌头生品及其
他3种炮制品,按“2.2.3”项下方法制得供试品溶
液,进样10μL,按上述色谱条件测定,测定结果见
表3。
表3 含量测定结果(n=3)
样品
苯甲酰乌头原碱
平均含量/(mg/g)RSD/%
苯甲酰新乌头原碱
平均含量/(mg/g)RSD/%
制川乌 0.009 77 1.54 0.008 74 1.11
生品 0.005 29 1.48 - -
药典法炮制品 0.010 40 1.69 - -
高压蒸法炮制品 0.033 69 1.01 - -
加辅料法炮制品 0.006 17 1.60 - -
54 第1期 付 玲,等:HPLC法测定新疆准噶尔乌头不同炮制品中单酯型生物碱的含量
3 讨论
本实验参照《中国药典》(2010年版一部)“制川
乌”项下的 HPLC方法测定准噶尔乌头3种炮制品
中单酯型生物碱,结果样品分离效果较好,经方法学
考察表明本法简便、可行。
根据含量测定结果表明,准噶尔乌头生品中苯
甲酰乌头原碱的含量约为已有法定药材标准的制川
乌的1/2,药典法炮制品与制川乌相似,高压蒸法炮
制品约为制川乌的3.4倍,加辅料法炮制品约为制
川乌的3/5;药典法炮制品中苯甲酰乌头原碱含量
约为生品的2倍,高压蒸法炮制品约为生品的6倍,
加辅料法炮制品与生品相近。
本课题组前期对准噶尔乌头中双酯型生物碱进
行含量测定,结果表明准噶尔乌头生品中含有双酯
型生物碱,毒性较大[14-15]。本实验准噶尔乌头按药
典法、高压蒸法、加辅料法炮制后,双酯型生物碱水
解为单酯型生物碱,不同炮制方法所得炮制品中单
酯型生物碱含量不同,结合前期急性毒性和药效学
实验研究结果,表明不同炮制品中单酯型生物碱含
量越高毒性越大,但药效相对较好。因此准噶尔乌
头炮制过程中的水解机制、活性成分变化与毒效之
间的相关关系仍需进一步深入研究。
(致谢:本实验中准噶尔乌头样品采集得到了新
疆伊犁州尼勒克县草原站的大力支持与帮助。)
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[收稿日期:2012-03-01]
(责任编辑 施洋)
64 新 疆 医 科 大 学 学 报 第36卷