全 文 ：北马兜铃再生系建立的研究
昝　琦　杨兆菲　姜　璐　李铁松　姜长阳＊
(辽宁师范大学生命科学学院 , 辽宁 大连　116029)
[摘　要] 以北马兜铃嫩茎为材料 , 进行了愈伤组织的诱导和分化 、 不定芽的分化 、 试管苗生根 、 移栽及移植所需要条件的研
究 , 并建立起北马兜铃嫩茎的再生体系。结果证明:MS+BA0.3 mg.L-1+2, 4-D 0.8mg.L -1是诱导嫩茎形成具有分化能力愈伤组
织的理想培养基;MS + AgNO31.80mg.L-1 +BA0.6mg.L-1 +NAA 0.1mg.L-1 是诱导愈伤组织分化的理想培养基;MS+Ag-
NO30.5mg.L -1+BA0.36mg.L -1+NAA0.1mg.L-1是诱导不定芽继代分化培养的理想培养基;1/ 2MS+NAA0.2 mg.L-1 +IAA0.3mg.L-1
是试管苗生根继代培养的理想培养基;河沙和炉灰渣是试管苗移栽的理想基质 , 移栽成活率 92.3%和 93.6%;与野生植株相比 ,
移植的试管苗具有生长整齐而旺盛 , 根系发达 、 秋天落叶晚 7d左右的特点。
[关键词] 北马兜铃;愈伤组织;再生体系
　　中图分类号:Q949.742.3 文献标识码:A
基金项目:辽宁师范大学教学改革项目 (项目编号:LSJG:20090108)
＊为本文通讯作者
　　北马兜铃 (Aristolochia contorta)又称茶叶包 、
马兜铃 、 河沟精 , 属于马兜铃科马兜铃属多年生
攀援草本植物[ 1] , 生长于山沟灌丛间 、 林缘 、溪
流旁灌丛中 、 河岸柳丛间 、缠绕于其他树木上;
在我国的东北 、 华北以及陕西 、 甘肃 、 江苏 、安
徽等地有分布。马兜铃是一种有毒植物[ 2] , 全株
含马兜铃酸 、 青木香马兜铃酸 、木兰花碱等有毒
成分 。同时 , 马兜铃还是一种重要的中草药 , 果
实 、 叶和根均可入药 , 具有清热解毒 、 止咳平喘 、
行气止痛 、 消肿降压等功效 , 能治肺热咳嗽 、痔
瘘肿痛 、大便秘结 、 胸腹胀痛 、 蛇虫咬伤 、头痛
眩晕 、 无名肿毒 、 疝气 、 高血压 、 肝炎等疾
病[ 3 ～ 4] 。由于马兜铃具有多种药用价值 , 市场售
价较高 , 因此 , 近年来人们进行大肆采挖 。这使
本来数量和分布就很少的植物现在就更加稀少了 。
在大连市的郊区 , 现在已很难看到这种植物 。为
了对这种植物进行保护 , 并为转基因和基因库的
建立奠定基础 , 本文对马兜铃进行了组织培养及
无性系建立的研究。虽然目前已有马兜铃科植物
组织培养研究的报道[ 5～ 7] , 并且还有马兜铃属植
物相关研究的报道[ 8～ 9] , 但迄今未见北马兜铃组
织培养 、 植株再生和无性系建立研究的报道。本
文探讨了马兜铃愈伤组织诱导 、无性系建立的条
件。
1　材料和方法
1.1　材料及灭菌
将大连市郊区岔鞍村山坡林缘生长非常旺盛
的北马兜铃嫩茎采回来 , 作为进行研究的材料 。
将采回来的嫩茎剪成长 4.5cm 左右的茎段 , 放到
500ml的磨口广口瓶中 , 流水冲洗 30min左右 , 用
0.005%安利溶液振荡洗涤约 20min后 , 移到超净
工作台上 , 用体积分数 70 ～ 75%的乙醇灭菌 10 s ,
再用质量体积分数 0.05%的 HgCl2 溶液振荡灭菌
3min , 接着用质量体积分数 0.025%的 HgCl2 溶液
振荡灭菌 13min , 再用无菌水振荡清洗 5次 , 即可
获得无菌嫩茎 。
1.2　培养条件
培养基以 MS 、 1/2MS 、 1/3MS 、 B5 、 White 、
N6和 LS为基本培养基 , 附加不同浓度的细胞分
裂素 BA 和生长素 NAA 、 IBA 、 2 , 4-D和 IAA。
第 29卷　第 6期
2009年　12月
农 业 与 技 术
Agriculture&Technology
Vol.29　No.6
Dec.2009 ·40　·
以MS 为基本培养基时 , 加蔗糖 30 g.L-1;以 1/
2MS为基本培养基时 , 加蔗糖15g.L-1 。培养基胨
力强度为 180 g/cm2[ 10] 、 pH5.8 ～ 6.0 , 培养温度
18 ～ 26℃, 光照 12h/d左右 , 光照度约 3000Lx 。
1.3　培养方法
1.3.1　不同浓度的生长素对愈伤组织诱导的影响
将无菌材料用灭菌滤纸吸干表面水分 , 用解
剖刀切成长 0.2 ～ 0.3cm 的茎段后 , 接种到以 MS
+BA0.3mg·L-1为基本培养基 , 附加不同浓度的
IBA 、 2 , 4-D和 IAA的培养基上 , 进行愈伤组织
的诱导培养。试验重复了 3次 , 每种培养基接种
100个材料。培养50d观察统计愈伤组织的生长状
况。培养前 30d在暗培养条件下进行 , 然后在光
照下培养 。
1.3.2　不同浓度的生长素对愈伤组织分化的影响
把培养的颗粒状愈伤组织分散为独立的颗粒
后 , 接 种 到 以 MS + AgNO31.0 mg.L-1 +
BA0.6mg.L-1为基本培养基 , 附加不同浓度的 2 ,
4-D 、 NAA 和 IBA 的培养基上进行分化培养 ,
50d时观察统计 。试验重复了 3次 , 每种培养基
接种 100个材料 。
把分化培养的不定芽从基部剪下 , 接种到与
颗粒状愈伤组织分化培养相同的培养基上 , 进行
不定芽的分化培养和分化继代培养 。
1.3.3　不同浓度的激素对不定芽分化的影响
把分化培养的不定芽从基部剪下 , 接种到在
1/2MS+AgNO30.5mg.L-1为基本培养基 , 附加不
同浓度的 BA 和浓度为 0.1mg.L-1的NAA 和 2 , 4
-D培养基上 , 进行不定芽的分化继代培养 。试
验重复了 3次 , 每次重复试验继代培养 5代 。
1.3.4　不同浓度激素对试管苗生根培养的影响
将上述继代分化培养的高在 0.5cm 以上 、生
长旺盛的不定芽从基部剪下 , 接种到以 MS +
NAA0.2mg.L-1 、 1/2MS +NAA0.2mg.L-1 、 1/3MS
+NAA0.2mg.L-1 、 B5+NAA0.2mg.L-1 、 White +
NAA0.2mg.L-1 、 N6 +NAA0.2mg.L-1 和 LS +
NAA0.2mg.L-1为基本培养基 , 附加浓度分别为
0.1mg.L-1 、 0.3mg.L-1 、 0.5 mg.L-1的 IAA 、 2 , 4
-D和 IBA的生根培养基上进行生根培养 。试验
重复了 3次 , 每种处理接种 100个材料 。培养中
不断观察 , 30d时观察统计。
1.3.5　试管苗的继代生根培养
将生根培养的试管苗剪成至少具有 2个生长
点 (即具有 2 个叶片)、 长 1-1.5cm 的茎段后 ,
接种到 1/2MS+NAA0.2mg.L-1+IAA0.3mg.L-1培
养基上 (接种时茎段的下部切口要插入培养基中 ,
下面的叶片腹面直接接触到培养基的表面)进行
生根继代培养 。3 次重复试验 , 每次继代培养 6
代 , 每代接种培养 200个材料 。25d时观察统计。
1.3.6　试管苗的移栽
把上述继代培养 、 生长着旺盛试管苗的培养
瓶瓶塞打开 , 放到 4500Lx 左右的光照下炼苗 4d
后 , 将试管苗取出 , 在温度为 20 ～ 25℃的清水中
洗去基部的培养基 , 移栽到上面铺着 1层约 7cm
厚的河沙 、炉灰渣 、山皮土和珍珠岩 , 下面为肥
沃园土的温室苗床上。移栽后前 14d 要保持温度
18℃以上 、湿度 90%以上 、 无直射光的条件 。移
栽试验进行了 3次 , 每次移栽每个处理为 200株 。
移栽后 30d观察统计。
1.3.7　试管苗的移植
将移栽成活的试管苗于 5月下旬分 3次移植
到试验材料的采集地大连郊区岔鞍村的山坡林缘 。
每次移植 150株。按照野生的条件进行管理 , 30d
观察统计 。
2　结　果
2.1　不同浓度的生长素对愈伤组织诱导的影响
观察表明 , 接种后 10d左右 , 在有的培养基
上开始形成愈伤组织。由表 1可见 , 在不用激素 、
加不同浓度生长素 IBA 、 IAA 的培养基上 , 不能
诱导嫩茎形成愈伤组织;而在浓度分别为
0.2mg.L-1 、 0.4 mg.L-1、 0.6mg.L-1 、
0.8mg.L-1 、 1.0 mg.L-1和 1.2mg.L-1的 2 , 4-D
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的培养基上 , 都能够诱导嫩茎形成愈伤组织 , 但
愈伤组织的诱导率 , 诱导的愈伤组织生长速度及
外部形态差异较大。观察统计表明 , 在 2 , 4-D
浓度为 0.8mg.L-1的培养基上 , 不仅愈伤组织的
诱导率为 98%, 而且愈伤组织的生长速度较快 ,
长势较好。初期暗培养诱导形成的愈伤组织为表
面光滑淡黄色的球状 , 随着培养时间的延长和愈
伤组织的生长 , 外部逐渐形成颗粒状。转移到光
照下后 , 伴随着愈伤组织的生长 , 颗粒的不断增
加 , 浅黄色的愈伤组织颗粒逐渐变成了绿色的颗
粒状 , 并且绿色的愈伤组织颗粒间连接较疏松 ,
容易分散为单独的颗粒状 。一般认为 , 这种愈伤
组织为具有分化能力的愈伤组织[ 11～ 12] 。把在这
一培养基上诱导的颗粒状愈伤组织 , 在同一培养
基上连续继代培养 5 代 , 3次试验形成的愈伤组
织不仅仍具有分化能力 , 而且培养周期缩短为 40
d , 平均每次继代培养 1个愈伤组织颗粒的增殖系
数为 19.4。这说明 , MS +BA0.3mg.L-1+2 , 4-
D 0.8mg.L-1这一培养基是诱导北马兜铃嫩茎形成
具有分化能力愈伤组织的理想培养基 。
表1　不同浓度生长素对嫩茎愈伤组织诱导的影响
IBA
mg.L-1
2 , 4-D
mg.L-1
IAA
mg.L-1
诱导愈伤
组织数
愈伤组织
诱导率% 长势
0 0 0 0 0 -
0.2 0 0 0 0 -
0.4 0 0 0 0 -
0.6 0 0 0 0 -
0.8 0 0 0 0 -
1.0 0 0 0 0 -
1.2 0 0 0 0 -
0 0.2 0 12 12 +
0 0.4 0 31 31 ++
0 0.6 0 58 58 ++
0 0.8 0 98 98 ++
0 1.0 0 86 86 +
0 1.2 0 83 83 +
0 0 0.2 0 0 -
0 0 0.4 0 0 -
0 0 0.6 0 0 -
0 0 0.8 0 0 -
0 0 1.0 0 0 -
0 0 1.2 0 0 -
注:++为长势较好;+为长势一般;-为不生长。
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2.2　不同浓度的生长素对愈伤组织分化的影响
由表 2可见 , 在不加激素 、加不同浓度 2 , 4
-D 、 IBA的培养基上 , 愈伤组织颗粒不能分化 ,
而 在 浓 度 分 别 为 0.1mg.L-1 、 0.3mg.L-1 、
0.5mg.L-1 、 0.7mg.L-1 、 0.9mg.L-1、 1.1mg.L-1
的NAA的培养基上愈伤组织可分化。但从愈伤组
织的分化率及分化不定芽的长势看 , 在 6 -
BA0.3mg.L-1+NAA0.1mg.L-1培养基上 , 愈伤组
织均可分化。但从愈伤组织的分化率 、 分化不定
芽的长势看 , 在 NAA 为 0.1mg.L-1的培养基上 ,
不仅颗粒状愈伤组织分化率达到了 95%, 分化不
定芽长势也较好。3 次重复试验的观察还表明 ,
在NAA 为 0.1mg.L-1培养基上培养 10d时 , 有的
愈伤组织颗粒就开始分化 。随后 , 伴随着培养时
间延长 , 分化数量不断增加;培养到 20d左右时 ,
在已经分化的不定芽基部 , 又会分化出数量不等
的不定芽 。培养到 50d 时 , 每个愈伤组织颗粒会
分化出 4.2个高在 0.5cm 以上的不定芽 。分化不
定芽呈嫩绿色丛生状。上述说明 , MS +AgNO31.
0mg.L-1 +BA0.6mg.L-1 +NAA0.1mg.L-1是诱导
北马兜铃愈伤组织分化的理想培养基 。
表 2　不同浓度激素对愈伤组织分化的影响
NAA
mg.L-1
2 , 4-D
mg.L-1
IBA
mg.L-1 分化数 分化率%
平均分化
芽数/颗粒 分化苗长势
0 0 0 0 0 0 -
0.1 0 0 95 95 0 ++
0.3 0 0 71 71 0 ++
0.5 0 0 51 51 0 +
0.7 0 0 23 23 0 +
0.9 0 0 23 23 0 +
1.1 0 0 8 8 0 +
0 0.1 0 0 0 0 -
0.1 0.3 0 0 0 0 -
0.5 0.5 0 0 0 0 -
0 0.7 0 0 0 0 -
0 0.9 0 0 0 0 -
0 1.1 0 0 0 0 -
0 0 0.1 0 0 0 -
注:++为长势好;+为长势一般
2.3　不同浓度激素对不定芽分化的影响
培养 40d 观察统计结果见表 3。由表可见 ,
不同浓度的 BA和 2 , 4-D配合使用 , 不定芽不
能 分 化;而 在 不 同 浓 度 的 1/2MS + Ag-
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NO30.5mg.L-1 +BA0.6mg.L-1 +NAA0.1mg.L-1这
一培养基上 , 不仅分化率达到了 99%, 而且一个
培养不定芽平均可分化培养出 6.1 个高在 0.5cm
以上 、生长旺盛的不定芽 。分化培养的不定芽呈
丛生状 。经过 5代的继代培养观察表明 , 所培养
的不定芽分化率和长势基本保持一致 , 平均每一
代每个培养不定芽的分化系数为 6.0。上述说明 ,
MS + AgNO30.5mg.L-1 + BA0.6mg.L-1 +
NAA0.1mg.L-1这一培养基是诱导北马兜铃不定芽
继代分化培养的理想培养基 。
表 3　不同激素对不定芽分化的影响
BA
(mg.L-1)
NAA
(mg.L-1)
2 , 4-D
(mg.L-1)
接种数
(个)
分化数
(个)
分化率
%
平均分化
数芽/株长　势
0 0 0 100 0 0 0-
0.4 0 0 100 0 0 0-
0.4 0.1 0 100 72 72 3.1++
0.4 0 0.1 100 0 0 0-
0.6 0 0 100 0 0 0-
0.6 0.1 0 100 99 99 6.1++
0.6 0 0.1 100 0 0 0-
0.6 0 0 100 0 0 0-
0.8 0 0 100 78 78 5.2+
0.8 0.1 0 100 0 0 0-
0.8 0 0.1 100 0 0 0-
1.0 0 0 100 0 0 0-
1.0 0.1 0 100 54 54 5.1+
1.0 0 0.1 100 0 0 0-
注:++为长势好;+为长势一般;-为不生长。
2.4　不同浓度激素对试管苗生根的影响
观 察 统 计 结 果 表 明 , 在 1/2MS +
NAA0.2mg.L-1+IAA0.3mg.L-1培养基上生根培养
的效果做好 , 不仅试管苗生根率达到了 93%、平
均每株生根数为 4.2条 、株高约 4.5cm , 而且培
养的试管苗叶片伸展 、茎粗壮 、生长旺盛 。上述
说明 , 1/2MS +NAA0.2mg.L-1 +IAA0.3mg.L-1这
一培养基是北马兜铃试管苗生根培养的理想培养
基。
2.5　试管苗的继代生根培养
观察结果表明 , 在 1/2MS+NAA0.2mg.L-1 +
IAA0.3mg.L-1培养基上进行生根继代培养 6d可见
生根 , 12d是绝大部分培养茎段生根 , 25d时平均
生根率为 97.3%、 平均每次继代培养的繁殖系数
为3.4。继代培养的生根试管苗生长非常旺盛 。
上 述 说 明: 1/2MS + NAA0.2mg.L-1 +
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IAA0.3mg.L-1这一培养基是北马兜铃试管苗生根
继代培养的理想培养基。
2.6　试管苗的移栽
观察统计表明 , 以河沙和炉灰渣为移栽基质 ,
不仅平均成活率达到了 92.3%和 93.6%, 而且成
活的试管苗生长旺盛 。这说明河沙和炉灰渣是北
马兜铃试管苗移栽的理想基质 。
2.7　试管苗的移植
移植 30d 观察统计证明:移植的成活率为
99.2%。移植后的试管苗前 60d长势较慢 、 植株
较小。60d 后开始迅速生长。与野生植株相比 ,
试管苗具有生长整齐而旺盛 , 根系发达 、 秋天落
叶晚 7d左右的特点。
3　讨　论
以北马兜铃的嫩茎为材料 , 通过愈伤组织的
诱导与分化 、 不定芽的分化 、 试管苗的生根 、试
管苗的移栽与移植研究 , 建立起了北马兜铃嫩茎
的再生体系。北马兜铃再生体系的成功建立 , 不
仅为满足保护这种野生资源和满足人们栽培对种
苗的需要提供了可能 , 而且为该植物基因库的建
立奠定了技术基础。
采用愈伤组织继代培养的方法进行繁殖 , 40d
的增殖系数为 19.4。按照这个速度 , 每年能繁殖
出19.49个后代;采用不定芽分化继代培养的方
法进行繁殖 , 40d 的增殖系数为 6。按照这个速
度 , 每年能繁殖出 69个后代;采用生根继代培养
的方法进行繁殖 , 25d的增殖系数为 3.4。按照这
个速度 , 每年能繁殖出 3.414.6个后代;这说明采
用上述三种方法进行繁殖 , 繁殖的速度都很快 ,
都可以满足人们生产或研究的需要 。相对而言 ,
用生根继代的方法繁殖的速度较慢。但是 , 从生
产需要方面看 , 应采用生根继代的方法进行繁殖 。
这是因为 , 用生根继代方法繁殖的试管苗不仅长
势非常旺盛 , 而且没有无效苗。
以河沙和炉灰渣为移栽基质成活率高 , 主要
与这两种基质的通透性好有关 。沙河和炉灰渣的
颗粒较大 , 能够贮藏很多空气 。这有利于促进呼
吸力很弱的试管苗根系的呼吸代谢 , 从而促进了
试管苗的生长 , 提高了移栽的成活率 。
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作者简介:姜长阳 (1953-), 男 , 辽宁师范大学生命科学学院教授。研究方向:植物技术研究 。
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