全 文 ：第 4 卷第 2 期
2013 年 2 月
黑龙江科学
HEILONGJIANG SCIENCE
Vol. 4 No. 2
Feb． 2013
收稿日期:2012 － 12 － 10
基金项目:辽宁省普通高等教育本科教学改革研究项目(201203041 － 4)
作者简介:王晓旭(1987 －) ，女，辽宁朝阳人，硕士，从事植物组织培养研究。
通讯作者:姜长阳(1953 －) ，男，辽宁大连人，教授，从事植物技术研究。e － mail:changyangjiang@ 126． com。
平车前无性系建立的研究
王晓旭，夏鸿飞，李 慧，姜长阳
(辽宁师范大学生命科学学院，辽宁 大连 116081)
摘要:以平车前叶柄为材料，对其进行愈伤组织的诱导和分化，不定芽的生根，试管苗移栽和移植的研究，建立起平车
前的无性系。结果表明:MS + 6 － BA0． 2mg /L + 2，4 － D2． 0mg /L +蔗糖 30g /L是平车前叶柄愈伤组织诱导的最佳培养基，
MS + 6 － BA0． 2mg /L + NAA2． 0mg /L +蔗糖 30g /L是愈伤组织继代培养的最佳培养基;愈伤组织分化的最佳培养基为 MS
+ 6 － BA1． 0mg /L + KT1． 0mg /L + NAA0． 5mg /L +蔗糖 30g /L;诱导不定芽生根的最佳培养基是 1 /2 MS + IAA0． 2 mg /L +
蔗糖 15 g /L;试管苗移栽的理想基质为园土，移栽成活率 100%，保持了平车前的植物学性状。
关键词:平车前;组织培养;无性系
中图分类号: S567． 23 + 9 文献标志码: A 文章编号: 1674 － 8646(2013)02 － 0054 － 06
Study on the Clone Construction of Plantago depressa
WANG Xiao － Xu，XIA Hong － Fei，LI Hui，JIANG Chang － Yang
(College of Life Science，Liaoning Normal University，Dalian 116081，China)
Abstract:Stripes of Plantago depressa were used as explants to induce callus，the callus with best growth were cultivated for
differentiation． Continue to do rooting culture of differentiated seedlings，and then the clone of Plantago depressa was established．
The results indicated that MS + 6 － BA0． 2mg /L + 2，4 － D2． 0 mg /L + sucrose 30 g /L was the perfect medium for callus inducing
and MS + 6 － BA0． 2mg /L + NAA2． 0mg /L was the perfect medium for callus multiplication;MS + 6 － BA1． 0mg /L + KT1． 0mg /L
+ NAA0． 5mg /L + sucrose30g /L was the best medium for callus differentiation;the ideal medium for rooting of adventitious buds
was 1 /2MS + IAA0． 2 mg /L + sucrose 15 g /L;the best substrate for transplanting was clays from garden．
Key words:Plantago depressa;culture of tissue;clone
平车前(Plantago depressa)又名大叶车前、车轮菜、牛
舌草等，为车前科车前属多年生草本植物。平车前为临床
上的常用中药，全草和种子均可入药［1］。平车前有清热、
利尿、明目、祛痰等功效，用于治疗小便黄少、暑湿泄泻、尿
路感染、目赤涩痛、痰多咳嗽等疾病［2 － 3］。现代研究证实，
平车前除具有以上功效外，还具有止泻护肝、降压、抑菌、
降低血清胆固醇等多种药理作用［4］。在临床上平车前主
要用于治疗水肿、慢性活动性肝炎、隐匿性肾炎［5］、阴道炎
等症。此外，平车前还可作为野菜食用和畜禽的青饲料。
车前属植物多数分布于受人为干扰强烈的生境中，是理论
生态学、生理生态学、进化生物学研究的理想材料［6］。研
究者的调查发现，由于平车前具有重要的药用、食用和饲
用价值，多年来的大量采挖和生存环境的破坏，导致近年
来野生平车前资源的分布和数量都急剧减少，现在，在大
连郊区已经很难采到野生平车前。因此，寻求平车前快速
繁殖的方法显得尤为重要。此前已有许多关于车前植物
的研究报道［7 － 12］，多集中于其药用价值及成分分析方面，
迄今未见平车前无性系建立的报道。本次试验针对平车
前愈伤组织增殖和分化进行研究，筛选出适合平车前无性
系建立的最佳条件，进而建立平车前的无性系，有利于平
车前的大量繁殖，获得好的经济价值及生态意义。
1 材料与方法
1． 1 材料与灭菌及培养条件
将采自大连郊区山坡上的平车前植株用清水冲洗干
净后，根和叶柄剪成 5 cm左右的段状，叶片剪成若干 5 cm
左右的小块状后，放到磨口广口瓶中，用自来水振荡洗涤
10 min，之后用体积分数为 0． 05%安利洗涤液洗涤约 10
min，再用自来水振荡洗涤 3 ～ 5 次至材料无泡沫。将材料
置于超净工作台上，用体积分数为 70% ～ 75%的乙醇灭菌
12s左右后，迅速用无菌水振荡洗涤 3 ～ 5 次，再加入浓度
为 0． 05%的 HgCl2溶液浸泡灭菌 14 min，紧接着用无菌水
洗涤 4 ～ 5 次即获得无菌材料。MS 培养基中蔗糖含量为
30 g·L －1，1 /2MS培养基中蔗糖含量为 15 g·L －1，琼脂含
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责任编辑:姜洋 1320493872@ qq． com
量为 4． 5 g·L －1，pH 5． 8 ～ 6． 0，每日持续光照 12 h，光照强
度为 2 000Lx，培养温度为 24℃。
1． 2 方法
1． 2． 1 不同生长素对根、叶片和叶柄愈伤组织诱
导的影响
将无菌材料中的根和叶柄剪成长 0． 5 cm左右的小段，
叶片剪成边长为 0． 5 cm左右的小块。剪取材料时，尽可能
取幼嫩部位。将以上 3 种材料分别接种于添加不同生长素
的 MS培养基上进行愈伤组织的诱导培养，材料先置于暗
箱中培养 15 d，再置于恒温光照培养箱中培养 30 d。每种
培养基每种材料接种培养 30 个。
1． 2． 2 不同浓度配比的 6 － BA和 2，4 － D对平车
前叶柄愈伤组织诱导的影响
将无菌的平车前叶柄剪成 0． 5 cm左右的小段，接种到
附加不同浓度 6 － BA和 2，4 － D的 MS培养基上进行愈伤
组织的诱导培养，每种培养基接种培养 40 个材料，先置于
暗箱中培养 15 d，再置于光照培养箱中培养 30 d。试验重
复 3 次。观察平车前叶柄的出愈情况，45 d后统计结果。
1． 2． 3 不同浓度 6 － BA、2，4 － D 和 NAA 配比对
愈伤组织增殖的影响
将在 MS + 6 － BA0． 2mg /L + 2，4 － D2． 0 mg /L +蔗糖
30 g /L培养基上初代培养的愈伤组织分成 0． 4 ～ 0． 5 cm左
右的块状后，接种在附加不同浓度 6 － BA、2，4 － D 和 NAA
配比的增殖培养基上，置于恒温光照培养箱中进行平车前
愈伤组织的增殖培养。每种培养基接种 50 个材料，每种处
理重复 3 次。观察愈伤组织的生长情况，45 d 后统计愈伤
组织的增殖状况。
1． 2． 4 不同浓度 6 － BA 、KT和 NAA对愈伤组织
分化的影响
以 MS为基本培养基、附加不同浓度的 6 － BA 、KT 和
NAA，设计出 12 种培养基，将 MS + 6 － BA0． 2 mg /L +
NAA2． 0mg /L +蔗糖 30 g /L这一培养基上继代培养后颜色
嫩绿的愈伤组织接种到各种培养基中，每种培养基接种
100个直径约为 0． 5cm 的愈伤组织团块，置于恒温光照培
养箱中进行为期 45 d的愈伤组织分化培养并统计分化率，
此试验重复 2 次。把分化培养的平车前不定芽从基部剪
下，接种到与颗粒状愈伤组织分化培养相同的培养基上，
进行不定芽的分化继代培养。
1． 2． 5 不同生长素对平车前不定芽生根的影响
将上述继代分化培养的不定芽从基部剪下，接种到以
1 /2MS为基本培养基，分别附加 IAA 0． 2 mg /L、IBA 0． 2
mg /L、NAA 0． 2 mg /L、2，4 － D 0． 2 mg /L和蔗糖 15 g /L的
培养基上。接种时不定芽植物学下部的生长点插入培养
基，于变温光照条件下进行生根培养。每种培养基接种培
养 45 个材料，试验重复 2 次。
1． 2． 6 炼苗移栽
将培养着生长旺盛，根系发达试管苗的培养瓶打开瓶
塞，将试管苗转移到有水的烧杯中，置于阳光不能直射的
实验台上，炼苗 3d后移栽到上半层分别为干净河沙、炉灰
渣和园土，下半层为肥沃园土的温室花盆中，移栽试验重
复 2 次，共移栽 300 株。
2 结果
2． 1 不同生长素对根、叶片和叶柄愈伤组织诱导
的影响
外植体接种 10 d后，叶片边缘及叶柄、根两端切口出
现膨大，已形成白色的愈伤组织;暗箱中培养 15 d后，转到
光照培养箱中培养，在以 2，4 － D 为生长素的培养基上愈
伤组织颜色慢慢转为嫩黄色(见图 1)。45 d 后统计，结果
见表 1。由表可见以叶柄为外植体愈伤组织诱导率优于叶
片和根，叶片的诱导率要高于根。单独使用 2，4 － D 的诱
导效果最好，NAA次之，单独使用 IBA 和 IAA 两种生长素
几乎不能诱导这三种平车前材料形成愈伤组织。随着诱
导时间的延长，含有 NAA 的培养基愈伤组织会分化成根。
试验结果表明，叶柄是平车前愈伤组织诱导的最佳外植
体，2，4 － D是平车前愈伤组织诱导的最佳生长素。
图 1 诱导的平车前愈伤组织
Fig． 1 The induction of callus
表 1 不同生长素对不同材料愈伤组织诱导的影响
Tab． 1 The effects of different auxin on callus induction
of different explants
序
号
生长素(mg /L)
NAA 2，4 － D IBA IAA
接种数
(个)
出愈率(%)
叶片 叶柄 根
1 2． 0 0 0 0 30 70． 0 93． 3 53． 3
2 0 2． 0 0 0 30 80． 0 100 63． 3
3 0 0 2． 0 0 30 6． 7 16． 7 10． 0
4 0 0 0 2． 0 30 0 0 0
2． 2 不同浓度配比的 6 － BA和 2，4 － D对平车前
叶柄愈伤组织诱导的影响
由表 2 可见，接种培养的平车前叶柄在所有培养基中
55
都能诱导形成愈伤组织，每种培养基的诱导率都达到了
100%。但从愈伤组织的生长速度和愈伤组织的长势看，4
号培养基诱导形成的愈伤组织生长速度快、长势好。接种
在这种培养基上的叶柄，培养 10d 左右外植体两端切口开
始出现愈伤组织，随后愈伤组织开始迅速生长。初期形成
的愈伤组织外表光滑、浅黄色的半透明状，培养到 45d变成
直径为 0． 2cm左右黄绿色颗粒状。观察还表明，当 2，4 － D
浓度过高时，抑制愈伤组织生长。6、7 号培养基出现水浸
状愈伤组织，可能与其生长素浓度较高有关。因此，MS + 6
－ BA0． 2mg /L + 2，4 － D2． 0 mg /L +蔗糖 30 g /L是愈伤组
织诱导的最佳培养基。
表 2 不同植物生长调节剂配比对叶柄愈伤组织诱导的影响
Tab． 2 The effects of different hormone combinations on callus induction of stripes
序号 6 － BA /(mg /L) 2，4 － D /(mg /L) 接种数 /个 诱导率 /% 愈伤组织特征 长势
1 0． 2 1． 0 40 100 浅黄色、疏松、颗粒状 + + +
2 0． 4 1． 0 40 100 浅黄色、疏松、颗粒状 + +
3 0． 6 1． 0 40 100 黄褐色、紧密、颗粒状 + +
4 0． 2 2． 0 40 100 黄绿色、疏松、颗粒状 + + +
5 0． 4 2． 0 40 100 浅黄色、紧密、颗粒状 +
6 0． 6 2． 0 40 100 浅褐色、紧密、水浸状 +
7 0． 2 3． 0 40 100 黄褐色、疏松、水浸状 +
8 0． 4 3． 0 40 100 黄褐色、紧密、颗粒状 +
9 0． 6 3． 0 40 100 褐色、疏松、颗粒状 + +
注:+ + +为长势好，+ +为长势较好，+为长势一般。
2． 3 不同浓度 6 － BA、2，4 － D 和 NAA 配比对愈
伤组织增殖的影响
接种 10 d后可见愈伤组织开始慢慢增大。由表 3 可
看出，试验所用的培养基均能够不同程度的使愈伤组织增
殖。观察结果表明，虽然 2，4 － D 是诱导平车前愈伤组织
的最佳生长素，但却不适合愈伤组织继代培养。在 3 号培
养基即附加了浓度为 0． 2 mg /L 6 － BA和浓度为 2． 0 mg /L
NAA、基本培养基为 MS的培养基上，愈伤组织的增殖速度
最快，所培养出的颗粒状愈伤组织质地疏松，并呈有光泽
的嫩绿色(见图 2) ，生长速度较快，试验证明此种愈伤组织
具有分化能力。把在 3 号培养基上培养 45d 的愈伤组织，
在相同培养基上进行继代培养，连续培养 3 代，所形成的愈
伤组织的外观仍然保持不变。以上试验表明，MS + 6 －
BA0． 2 mg /L + NAA2． 0 mg /L 是平车前愈伤组织增殖的理
想培养基。
图 2 愈伤组织的增殖培养
Fig． 2 The proliferation of callus
表 3 不同生长调节剂配比对愈伤组织增殖的影响
Tab． 3 The effects of different hormone combination on callus proliferation
试验号 基本培养基 6 － BA /(mg·L －1)2，4 － D /(mg·L －1) NAA /(mg·L －1)接种材料数(块) 增殖倍数 增值速度 长势
1 MS 0． 2 2． 0 0 50 7． 3 + +
2 MS 0． 5 2． 0 0 50 8． 6 + +
3 MS 0． 2 0 2． 0 50 13． 7 + + + + + +
4 MS 0． 5 0 2． 0 50 11． 3 + + + +
注:+ + +为长势好，+ +为长势较好，+为长势一般。
65
2． 4 不同浓度 6 － BA 、KT和 NAA对愈伤组织分
化的影响
由表 4 可以看出，在不加激素、只单加 6 － BA、KT两种
细胞分裂素的培养基中平车前颗粒状愈伤组织均不能分
化，而在不同浓度配比的 6 － BA 和 NAA，KT 和 NAA 的培
养基中，平车前的颗粒状愈伤组织会不同程度地分化出根
(见图 3)。由此也可以看出，平车前愈伤组织可能含有较
多的内源生长素。但添加三种激素的培养基中，愈伤组织
分化出了不定芽。在添加 6 － BA 1． 0 mg /L、KT1． 0 mg /L
和 NAA0． 5 mg /L 的培养基上，分化培养到 14d 左右时，愈
伤组织颗粒即可分化出可见芽点。分化培养到 45d 时，不
仅颗粒状愈伤组织的分化率达到了 87%，每个愈伤组织颗
粒还会分化形成为有 3 ～ 7 个不定芽组成的长势较好丛生
不定芽。但在光照不强的情况下，愈伤组织会因为花青素
较多而变成紫红色(见图 4)。把上述分化培养形成的丛生
不定芽从基部剪下，接种到相同的培养基上进行不定芽的
分化培养。经过 3 次重复试验证明，不定芽经过 45d培养，
平均每个培养的不定芽可分化生长出高 5 cm 以上的不定
芽 5． 7 个。以上试验表明，MS + 6 － BA1． 0 mg /L + KT1． 0
mg /L + NAA0． 5 mg /L +蔗糖 30 g /L 是愈伤组织分化的最
佳培养基。
图 3 分化出根的愈伤组织
Fig． 3 Differentiation out of the root of callus
图 4 分化后出现花青素的愈伤组织
Fig． 4 Anthocyanins in callus
表 4 不同浓度 6 － BA 、KT和 NAA对愈伤组织分化的影响
Tab． 4 The effects of different hormone combination on callus differentiation
试验号 基本培养基 6 － BA /(mg·L －1) NAA /(mg·L －1) KT /(mg·L －1) 接种材料数 /(块) 分化不定芽数 /(块) 长势
1 MS 0 0 0 100 0 －
2 MS 1． 0 0 0 100 0 －
3 MS 1． 0 0． 1 0 100 0 － －
4 MS 1． 0 0． 4 0 100 0 － －
5 MS 2． 0 0． 1 0 100 0 － －
6 MS 2． 0 0． 4 0 100 0 － －
7 MS 3． 0 0． 4 0 100 0 － －
8 MS 0 0 1． 0 100 0 － －
9 MS 0 0． 1 0． 5 100 0 － －
10 MS 0 0． 1 1． 0 100 0 － －
11 MS 1． 0 0． 5 1． 0 100 87 + + +
12 MS 2． 0 0． 5 2． 0 100 53 +
注:+ + +为长势好，+为长势一般，－为不分化，－ －为分化出根;
2． 5 不同生长素对平车前不定芽生根的影响
28 d观察统计，结果见表 5。在添加 IAA 培养基
上生根率为 100%且试管苗长势最好。观察发现，在添加
IAA培养基上，不定芽培养至第 8 d 开始生根，从平均生根
75
数、根长以及苗长势等方面看，变温条件下有利于平车前
生长芽生根的生长素依次为 IAA、NAA、IBA 和 2，4 － D。
因此，IAA是平车前生长芽生根的最佳生长素。
表 5 生长芽变温光照下生根情况
Tab． 5 The rooting situation of Plantago depressa
with poikilothermal illumination
激素配比(mg /L)
IAA IBA NAA 2，4 － D
接种数
(个)
生根率
(%)
平均每株
生根数(条)
根平均
长(cm)
苗长
势
0 0 0 0 45 100 2． 23 1． 56 +
0． 2 0 0 0 45 100 5． 67 3． 89 + + +
0 0． 2 0 0 45 86． 7 4． 47 2． 78 +
0 0 0． 2 0 45 95． 6 5． 12 3． 13 + +
0 0 0 0． 2 45 0 0 0d +
注:+ + +长势很好;+ +长势较好;+长势一般。
2． 6 移栽
移栽后 30 d统计证明:移栽的理想基质为园土，移栽
成活 300 株，成活率为 100%。
定植后 30 d 统计证明:定植成活 100 株，成活率
100%。定植成活的试管苗生长良好，当年开花结果，保持
了野生平车前的植物学性状(见图 5)。
图 5 移栽的试管苗
Fig． 5 Tube seedlings of transplanting
3 讨论
对于愈伤组织的诱导，取材部位［13］，生理状态及外植
体大小都会影响培养结果。在植物的组织培养中用于愈
伤组织诱导的外植体一般取自幼嫩部位或新生长的器官
组织，如幼嫩的叶片、根、花、茎段、块根和块茎等。本次研
究发现，叶柄是平车前愈伤组织诱导的最佳外植体，根和
叶片不适合愈伤组织诱导。将培养材料置于暗培养条件
下，培养 7d后取出进行光照培养，这样操作更有利于愈伤
组织的诱导［14］。平车前愈伤组织的诱导也需要进行暗培
养，直接进行光照培养会引起外植体的死亡。诱导愈伤组
织，2，4 － D 的生长调节活性最强，NAA 次之，IAA 和 IBA
的作用较弱较差［15］。本次研究证明，平车前愈伤组织的诱
导的最佳生长素是 2，4 － D。MS + 6 － BA0． 2 mg /L + 2，4
－ D2． 0 mg /L +蔗糖 30 g /L是平车前叶柄愈伤组织诱导的
最佳培养基，MS + 6 － BA0． 2 mg /L + NAA2． 0 mg /L +蔗糖
30 g /L 是平车前愈伤组织继代增殖培养的最佳培养基。
在愈伤组织分化培养的过程中，最好是先诱导分化出芽，
因为形成芽后在其基部很容易形成根。但愈伤组织先分
化形成根则会抑制芽的形成［16］。生长素 /细胞分裂素比例
决定着芽和根的分化。一般来说，当生长素比细胞分裂素
比值高时，有利于根的生长，比值低时有利于芽的生长，中
间比值利于愈伤组织的诱导和分化［17 － 18］。本次研究发
现，在不同浓度配比的 6 － BA 和 NAA，KT 和 NAA 的培养
基中，平车前的颗粒状愈伤组织会不同程度地分化出根。
只有在添加 6 － BA、NAA和 KT三种激素的培养基中，平车
前愈伤组织分化出了不定芽，分化的最佳培养基为 MS + 6
－ BA1． 0 mg /L + KT1． 0 mg /L + NAA0． 5 mg /L +蔗糖 30 g /
L。分化培养的愈伤组织需要充足的光照，在试验过程中，
由于光照不足有的愈伤组织会因为细胞含有较多的花青
素而呈现紫红色。
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(下转第 42 页)
85
表 2 交叉验证法建立 4 批次的沼气产量在线预
报模型的性能比较
Tab． 2 Performance comparison of predictive biogas
output using cross － validation of 4 batches
每批预测误差
第一批数据 第二批数据 第三批数据 第四批数据
训练时间
s
1 0． 0176 0． 0180 0． 025 0． 0190 2． 9
2 0． 014 0． 016 0． 026 0． 025 2． 5
3 0． 022 0． 021 0． 018 0． 030 1． 8
4 0． 024 0． 021 0． 016 0． 020 2． 0
从表 2 得知虽然训练样本改变，但所建预报模型的预
测误差变化并不大，说明此方法有一定的鲁棒性，而且训
练时间都很短，可以对相关变量进行实时预报。图 3 列出
了对样本数据的在线预报沼气产量模型和实际生产数据
的比较结果。
由图 3 可知，所建立的预报模型有较高的精度，这表明
在发酵过程操作条件下，仅通过几个输入变量就可以实现
对沼气产量进行准确的在线预报。
图 3 沼气产量在线预测模型数据与实际数据对比
Fig． 3 Comparison of predictive biogas output with the actual results
需要指出的是，实际生产中一般是无法得到沼气产量
的准确估计的，必须考虑更多的过程因素。但本文所提出
的方法仍旧适用，在实际应用中，只需将输入实际工况所
要估计的相关数据，而且可以选取多个可测变量作为 LS －
SVM的输入来实现对沼气产量的估计。
3 结论
牛粪发酵过程是一个复杂的生化工程，建立其沼气产
量精确预测模型对生化过程的优化控制具有十分重要的
作用。本文采用 LS － SVM建模方法，建立了牛粪厌氧发酵
过程变量在线预报模型，在对数据的要求方面远远低于神
经网络和多元回归等传统方法。通过仿真实验获得了 LS
－ SVM参数调整策略。仿真结果表明此模型具有很强的
拟合、泛化能力和学习能力，对样本依赖程度低，可以较合
适地描述时变和非线性的特性，适合复杂的发酵预估，具
有广泛的应用前景。本研究是具有实用价值的预测方法，
进一步指导大型沼气工程的智能控制，是我们下一步研究
的工作。
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