全 文 ：第 26 卷 第 4 期
2014 年 12 月
塔 里 木 大 学 学 报
Journal of Tarim University
Vol． 26 No． 4
Dec． 2014
① 文章编号:1009 － 0568(2014)04 － 00096 － 09
硬枝碱蓬 HPLC指纹图谱建立及模式识别研究
马 涛 赵 宇 韩占江*
(塔里木大学植物科学学院 /新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)
摘要 为了对硬枝碱蓬样品质量进行评价，采用高效液相色谱法对 9 个不同采集地的硬枝碱蓬样品进行测定，建立指纹图谱，
并结合中药相似度软件和主成分分析法进行模式识别研究。结果表明，试验确定的最佳条件为:提取溶剂为 100%甲醇，用量
为 15 mL，流速为 1． 0 mL /min，色谱进样时间为 20 min，流动相为甲醇(A)－水(B)，采用 100%甲醇等度洗脱，检测波长为
254 nm。精密度试验、重现性试验、稳定性试验测定结果的相似度均在 0． 9 以上，本研究所建立的基于主成分分析的模式识
别方法准确可靠;中药相似度软件能够对不同地点的硬枝碱蓬材料进行区分，不同产地硬枝碱蓬的差异可清晰地显示出来。
关键词 硬枝碱蓬;高效液相色谱;指纹图谱;模式识别
中图分类号:Q945． 79 文献标识码:A DOI:10． 3969 / j． issn． 1009 － 0568． 2014． 04． 018
Ｒesearch about HPLC Fingerprint and Pattern Ｒecognition of Suaeda Ｒigida
Ma Tao Zhao Yu Han Zhanjiang*
(College of Plant Science，Tarim University /Xinjiang Production ＆ Construction Corps Key Laboratory of
Protection and Utilization of Biological Ｒesources in Tarim Basin，Alar，Xinjiang 843300)
Abstract In order to evaluate the sample quality in Suaeda rigida H． W． Kung et G． L． Chu，the fingerprints of Suaeda rigida col-
lected from nine different locations were established which determined by high performance liquid chromatography (HPLC)method，
and combined their fingerprint，the pattern recognitions were analyzed with traditional Chinese medicine similarity software and princi-
pal component analysis (PCA)． The results showed that the optimum conditions were as follows:100% methanol extraction solvent，
the amount of 15 mL，the flow rate of 1． 0 mL /min，chromatographic injection time of 20 min，mobile phase of methanol (A)－ water
(B)，with 100% methanol elution and detection wavelength of 254 nm． The similarity of experiments for precision，reproducibility and
stability were all above 0． 9，which indicated that the method was accurate and reliable． Suaeda rigida samples from different locations
were distinguished by traditional Chinese medicine similarity software while the differences were also displayed by PCA clearly．
Key words Suaeda rigida H． W． Kung et G． L． Chu;high performance liquid chromatography (HPLC);fingerprint;pattern rec-
ognition
盐渍土壤是制约农业生产的重要因素之一，新
疆有盐渍土约为 0． 13 亿 hm2，是我国盐渍土分布最
广、面积最大的省区［1，2］。新疆的耕地近 1 /3 盐渍
化，开发利用耐盐植物是新疆植物研究的重点之一，
① 收稿日期:2013 － 12 － 20
基金项目:国家自然科学基金项目(31360055);新疆生产建设兵团博士资金(2013BB008) ;塔里木大学校长基金项目(TDZKBS201204);国
家大学生创新创业训练计划(201310757006)。
作者简介:马涛(1991 －)，男，学士，研究方向为植物抗逆生理。 E － mail:collinm@ 163． com
* 为通讯作者 E － mail:hanzhanjiang@ 126． com
第 4 期 马 涛等:硬枝碱蓬 HPLC指纹图谱建立及模式识别研究
是合理利用盐渍土壤的重要方法。盐生植物是一个
宝贵的天然耐盐基因库，尤其是具有经济价值的材
料，可以利用它们自身的耐盐性直接引种驯化、开发
应用，也可以通过基因工程手段把耐盐基因整合到
非盐生植物中，使其成为耐盐的转基因植物。
硬枝碱蓬(Suaeda rigida H． W． Kung et G． L．
Chu)是孔宪武 1978 年发表的一个植物新种［3］，是
藜科碱蓬属中最高大的一种强木质化草本［4］，是塔
里木盆地的特有植物，真盐生植物，其植株高大，枝
叶繁茂，是一种营养丰富的野生蔬菜，又是当地优良
的牧草资源，具有重要的经济价值和生态价值［5，6］。
前人对硬枝碱蓬的地理分布、群落特征、生境土壤状
况、叶片解剖特征及种子形态等进行了一系列研究，
发现硬枝碱蓬是很好的耐盐材料［7，8］。笔者前期调
查发现，硬枝碱蓬主要分布在塔克拉玛干沙漠北缘，
大致沿库尔勒 －阿克苏 －巴楚 －喀什一线分布。
中药指纹图谱(fingerprinting)是借用 DNA指纹
图谱发展而来，应用较早较多的是中药化学成分色
谱指纹图谱，特别是高效液相色谱(HPLC)指纹图
谱。建立中药指纹图谱的目的是全面反映所含化学
成分的种类与数量，进而评价样品的质量［9，10］。中
药色谱指纹图谱相似度评价系统(中国药典 A 版)
(以下简称为中药相似度软件)可对色谱图进行对
照处理，快速检测样品物质与含量的相似性。不同
生境下，同一植物的生长特性变现可能存在差异，因
此，本文采用高效液相色谱法建立硬枝碱蓬的指纹
图谱，采用中药相似度软件对该试验的准确度、精密
度进行检测，并对不同产地的硬枝碱蓬进行主成分
分析(Principal components analysis，PCA)，为后续研
究所用材料的均一性提供保证。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 试验原料
新鲜采摘的硬枝碱蓬(采自塔里木大学东北角
虹桥路旁，阿拉尔 5 团，阿拉尔 12 团，阿拉尔 16 团，
沙雅，库车，和静，巴楚，阿拉尔至沙雅公路旁 9 个地
点)。
1． 1． 2 试验试剂
甲醇、乙腈为分析纯(天津博迪化工股份有限
公司)，无水甲醇、乙腈为色谱纯(Merck公司)。
1． 1． 3 试验仪器
所用仪器主要有 Prominence LC20A 岛津液相
色谱仪，KQ －100VDE双频数控超声波清洗器，Typc
HP －01 无油真空泵，FZ102 粉碎机等。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 样品的前处理
将新鲜采摘的硬枝碱蓬去除泥土和杂草，选取
完整的植株洗净，通风无光条件下放置 7 － 10 d，使
其充分干燥。选取植株的茎叶部分，放入粉碎机中
充分粉碎，过 80 目筛制得样品粉末。
1． 2． 2 提取溶剂的选择
称取 6 份 2． 000 g样品粉末放入 50 mL容量瓶
中，分别加入 25%乙腈、50%乙腈、100%乙腈、25%
甲醇、50%甲醇、100%甲醇作为提取剂震荡摇匀，过
滤，超声提取 40 min，抽滤，滤液经 0． 45 μm 有机滤
膜过滤，制得待测样液，于 4 ℃冰箱内保存，备用。
1． 2． 3 提取溶剂用量的选择
称取 5 份 2． 000 g样品粉末放入 50 mL容量瓶
中，分别加入 100%甲醇 50 mL、30 mL、20 mL、15
mL、10 mL，震荡摇匀，过滤，超声提取 40 min，抽滤，
滤液经 0． 45 μm有机滤膜过滤，制得待测样液，于
－ 4℃冰箱内保存，备用。
1． 2． 4 色谱条件的优化
流动相:乙腈(A)－ 水(B)或甲醇(A)－ 水
(B)，采用 100%乙腈或 100%甲醇等度洗脱;流速:
1． 0 mL /min;进样体积:10 μL;色谱柱:inertsil ODS
－ SP 4． 6 mm × 250 mm × 5 μm;检测器:二极管阵
列检测器;检测波长:由于仪器在进样时是自动全波
长(190 nm － 800 nm)检测，所以进样后选择 200
nm、210 nm、220 nm、230 nm、240 nm、250 nm、260
nm、270 nm、280 nm、290 nm、300 nm处样品色谱图，
选择出峰多、峰形好的波段，进一步比较分析，选择
出最佳检测波长。
1． 2． 5 精密度试验
使用同一产地的硬枝碱蓬制备 5 个样品溶液，
每个样品连续进样 5 次，使用中药相似度软件进行
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塔 里 木 大 学 学 报 第 26 卷
对比，获得图谱之间的相似度，确定此次试验使用方
法的精密程度。
1． 2． 6 重现性试验
使用同一产地的硬枝碱蓬，制备 5 个样品溶液，
对其进样分析，使用中药相似度软件进行对比，获得
图谱之间的相似度，确定此次试验的重现性能。
1． 2． 7 稳定性试验
制备一个样品溶液，在第 1 d、3 d、5 d、7 d、9 d
进样测定，使用中药相似度软件进行对比，获得图谱
之间的相似度，确定样品溶液的稳定性。
1． 2． 8 生成对照图谱
将不同产地的硬枝碱蓬制备成样品溶液 P1 ～
P9，每一份样品溶液做两次平行试验，选取最优色
谱图，得出 P1 ～ P9 样品的指纹图谱。使用中药相
似度软件对 P1 ～ P9 样品的指纹图谱进行比较分
析，生成对照图谱，作为硬枝碱蓬的标准指纹图谱。
1． 2． 9 主成分分析
本次试验使用主成分分析法(PCA)来进行模式
识别研究，即将这些样品中的所有峰的保留时间进
行组合，进行散点作图，达到“物以类聚”的效果，很
直观的反映出各个样本之间的关系，实现模式识别
的目的。
2 结果与分析
2． 1 样品处理及色谱条件的确定
如图 1 所示，S1 ～ S6 分别为 25%乙腈、50%乙
腈、100%乙腈、25%甲醇、50%甲醇、100%甲醇做提
取溶剂的 HPLC 指纹图谱，经对比确定使用 100%
甲醇作为样品的提取溶剂处理效果较好，如图 1 中
S6。经测定，使用 15 mL100%甲醇做为提取溶剂
时，样品溶液浓度适合，出峰较多，峰形较好。流速
为 1． 0 mL /min时，色谱图中各峰分离效果明显，检
测波长选择 254 nm 处，色谱图峰形较好，进样时间
选择 20 min，流动相为甲醇(A)－ 水(B)，采用
100%甲醇等度洗脱。
表 1 样品 1 精密度试验相似度
S1 S2 S3 S4 S5 对照指纹图谱
S1 1． 000 0． 999 0． 997 0． 995 0． 997 1． 000
S2 0． 999 1． 000 0． 999 0． 990 0． 993 0． 999
S3 0． 997 0． 999 1． 000 0． 984 0． 988 0． 997
S4 0． 995 0． 990 0． 984 1． 000 1． 000 0． 995
S5 0． 997 0． 993 0． 988 1． 000 1． 000 0． 997
对照指纹图谱 1． 000 0． 999 0． 997 0． 995 0． 997 1． 000
表 2 样品 2 精密度试验相似度
S1 S2 S3 S4 S5 对照指纹图谱
S1 1． 000 0． 995 0． 997 0． 993 0． 994 0． 996
S2 0． 995 1． 000 0． 999 0． 993 0． 993 0． 996
S3 0． 997 0． 999 1． 000 0． 988 0． 985 0． 994
S4 0． 993 0． 993 0． 988 1． 000 1． 000 0． 995
S5 0． 994 0． 993 0． 985 1． 000 1． 000 0． 994
对照指纹图谱 0． 996 0． 996 0． 994 0． 995 0． 994 1． 000
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第 4 期 马 涛等:硬枝碱蓬 HPLC指纹图谱建立及模式识别研究
表 3 样品 3 精密度试验相似度
S1 S2 S3 S4 S5 对照指纹图谱
S1 1． 000 0． 985 0． 988 0． 993 0． 994 0． 992
S2 0． 985 1． 000 0． 994 0． 983 0． 986 0． 990
S3 0． 988 0． 994 1． 000 0． 985 0． 988 0． 991
S4 0． 996 0． 983 0． 985 1． 000 0． 998 0． 992
S5 0． 994 0． 986 0． 988 0． 998 1． 000 0． 993
对照指纹图谱 0． 993 0． 990 0． 991 0． 992 0． 993 1． 000
表 4 样品 4 精密度试验相似度
S1 S2 S3 S4 S5 对照指纹图谱
S1 1． 000 0． 995 0． 998 0． 988 0． 993 0． 995
S2 0． 995 1． 000 0． 996 0． 985 0． 990 0． 993
S3 0． 998 0． 996 1． 000 0． 989 0． 991 0． 995
S4 0． 988 0． 985 0． 989 1． 000 0． 992 0． 991
S5 0． 993 0． 990 0． 991 0． 992 1． 000 0． 993
对照指纹图谱 0． 995 0． 993 0． 995 0． 991 0． 993 1． 000
表 5 样品 5 精密度试验相似度
S1 S2 S3 S4 S5 对照指纹图谱
S1 1． 000 0． 996 0． 991 0． 999 0． 992 0． 996
S2 0． 996 1． 000 0． 994 0． 996 0． 995 0． 996
S3 0． 991 0． 994 1． 000 0． 992 0． 995 0． 994
S4 0． 999 0． 996 0． 992 1． 000 0． 993 0． 996
S5 0． 992 0． 995 0． 995 0． 993 1． 000 0． 995
对照指纹图谱 0． 996 0． 996 0． 994 0． 996 0． 995 1． 000
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图 1 不同提取溶剂的 HPLC指纹图谱
2． 2 精密度试验结果
对五个样品溶液连续重复进样 5 次后，经相似
度分析，获得各图谱之间的相似度均在 0． 99 以上，
表明该试验方法精密度好。如表 1 ～ 5。
2． 3 重现性试验结果
进样同一个产地样品制备的 5 个样品溶液，经
相似度分析，获得图谱之间的相似度在 0． 97 以上，
表明此次试验重现性良好。如表 6。
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第 4 期 马 涛等:硬枝碱蓬 HPLC指纹图谱建立及模式识别研究
表 6 重现性试验相似度
S1 S2 S3 S4 S5 对照指纹图谱
S1 1． 000 0． 992 0． 994 0． 957 0． 934 0． 986
S2 0． 992 1． 000 0． 998 0． 943 0． 915 0． 979
S3 0． 994 0． 998 1． 000 0． 963 0． 940 0． 991
S4 0． 957 0． 943 0． 963 1． 000 0． 996 0． 991
S5 0． 934 0． 915 0． 940 0． 996 1． 000 0． 977
对照指纹图谱 0． 986 0． 979 0． 991 0． 991 0． 977 1． 000
2． 4 稳定性试验结果
同一个样品溶液，在第 1 d、3 d、5 d、7 d、9 d 后
进样测定，经相似度分析，获得图谱之间的相似度均
在 0． 99 以上，表明所制得的试剂在 9 d时间内是稳
定的。如表 7。
表 7 稳定性试验相似度
S1 S2 S3 S4 S5 对照指纹图谱
S1 1． 000 0． 999 0． 997 0． 995 0． 997 1． 000
S2 0． 999 1． 000 0． 999 0． 990 0． 993 0． 999
S3 0． 997 0． 999 1． 000 0． 984 0． 988 0． 997
S4 0． 995 0． 990 0． 984 1． 000 1． 000 0． 995
S5 0． 997 0． 993 0． 988 1． 000 1． 000 0． 997
对照指纹图谱 1． 000 0． 999 0． 997 0． 995 0． 997 1． 000
2． 5 对照图谱
重新配制 9 个不同产地的样品溶液进样测定，
每个样品做两次平行测定，选取最优色谱图作为样
品模版，使用中药相似度软件对 9 个色谱图进行处
理，生成样品的对照图谱，这个对照图谱便可作为硬
枝碱蓬的指纹图谱。如图 2，Ｒ为生成的对照图谱。
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塔 里 木 大 学 学 报 第 26 卷
图 2 硬枝碱蓬对照图谱
运用中药相似度软件，对 P1 ～ P9 进行相似度
评价。如表 8。9 个样品的相似度均大于 0． 9，说明
这 9 个样品属于同一种物质。
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第 4 期 马 涛等:硬枝碱蓬 HPLC指纹图谱建立及模式识别研究
表 8 硬枝碱蓬相似度评价
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 对照指纹图谱
P1 1． 000 0． 940 1． 000 0． 996 1． 000 0． 999 1． 000 0． 982 0． 987 0． 989
P2 0． 940 1． 000 0． 935 0． 894 0． 939 0． 911 0． 933 0． 850 0． 871 0． 919
P3 1． 000 0． 935 1． 000 0． 996 1． 000 0． 999 1． 000 0． 983 0． 988 0． 989
P4 0． 996 0． 894 0． 996 1． 000 0． 996 0． 999 0． 997 0． 995 0． 997 0． 986
P5 1． 000 0． 939 1． 000 0． 996 1． 000 0． 999 1． 000 0． 982 0． 987 0． 989
P6 0． 999 0． 911 0． 999 0． 999 0． 999 1． 000 0． 999 0． 989 0． 993 0． 988
P7 1． 000 0． 933 1． 000 0． 997 1． 000 0． 999 1． 000 0． 984 0． 988 0． 989
P8 0． 982 0． 850 0． 983 0． 995 0． 982 0． 989 0． 984 1． 000 1． 000 0． 974
P9 0． 987 0． 871 0． 988 0． 997 0． 987 0． 993 0． 988 1． 000 1． 000 0． 979
对照指纹图谱 0． 989 0． 919 0． 989 0． 986 0． 989 0． 988 0． 989 0． 974 0． 979 1． 000
2． 6 主成分分析
使用 simca － p 11． 5 软件对 P1 ～ P9 样品的色谱图数据进行拟合模型处理并识别特异点，获得 9 个样品
主成分的散点图。如图 3 所示，P1、P6 和 P8 相似，P4 和 P5 较为相似，其余样本均有不同，由此可以看出不
同产地的硬枝碱蓬有一定的差异性。
图 3 PCA散点图
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塔 里 木 大 学 学 报 第 26 卷
3 结论
3． 1 选取检测方法
此次试验选用 HPLC 法测定样品指纹图谱，与
经典液相色谱法相比，具有分离效率高、分析速度
快、定量精密度高、检测器种类多、灵敏度高、稳定性
和重现性好等特点。
3． 2 色谱条件的优化
试验确定的最佳条件为用 100%甲醇作为样品
的提取溶剂，用量为 15 mL，流速为 1． 0 mL /min，色
谱进样时间为 20 min，流动相为甲醇(A)－水(B)，
采用 100%甲醇等度洗脱，检测波长为 254 nm。
3． 3 模式识别
在 PCA分析中，相同地区的样品被归为一类，
有差异的样品会明显地与其他样品区分开来，可以
直观的反映各个样本之间的聚类关系。通过 PCA
分析，得到的样品的归类与实际情况相符，说明基于
PCA的模式识别方法有效、可靠，为硬枝碱蓬的质
量控制和综合评价奠定了基础。
参考文献
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