全 文 ：收稿日期:2009-08-30;　修订日期:2009-12-19
基金项目:广西科技厅项目(No.0832271);
桂林医学院基础医学院项目(JCKY200809)
作者简介:龚受基(1970-),男(汉族),广西桂平人 ,现任桂林医学院讲师 ,
硕士学位 ,主要从事天然药物化学研究工作.
＊通讯作者简介:徐　庆(1956-), 男(汉族),山东胶州人 , 现任桂林医学
院教授 ,硕士学位 ,主要从事抗病毒抗肿瘤天然药物及肿瘤生物治疗的研
究工作.
雪灵芝提取物总黄酮测定及对小鼠的镇痛作用
龚受基1 ,姜翠霞 1 ,李腾飞 1 ,周以智2 , 段小群 1 ,徐　庆1＊
(1.桂林医学院 ,广西 桂林 541004;　2.桂林阿仲嘎保生物制品有限公司 ,广西 桂林　541002)
摘要:目的 用分光光度法对雪灵芝提取物总黄酮含量进行了测定 ,探讨雪灵芝有效部位对小鼠疼痛的镇痛作用。方法
采用 Na(NO2)2 -AlCl3法测定雪灵芝有效部位总黄酮含量;用热板法 、醋酸致痛法观察药物对致痛小鼠反应的影响。结
果 C012部位总黄酮含量为 59.16%, C013部位总黄酮含量为 56.86%;C012和 C013两部位对热板法致痛具有较好的镇
痛作用 , C012部位 200 mg/kg剂量镇痛效果显著 ,其 0.5 h和 2.0 hP<0.001, 4.0 hP<0.01, 1.0 hP<0.05;100 mg/kg
在 0.5 h有很好的镇痛效果(P<0.01);C013部位 200 mg/kg在 2.0, 4.0 h镇痛效果好(P分别为 0.001和 0.01), 在 0.5
hP<0.05;剂量 100 mg/kg在 4.0h具有较好的镇痛效果(P<0.05)。 C012部位对醋酸致痛在 100mg/kg剂量时具有很
好的镇痛效果(P<0.01), 50mg/kg具有较好的镇痛作用(P<0.05)。结论 雪灵芝 C012和 C013两部位总黄酮含量较
高 , 具有显著的镇痛作用 ,其作用机制有外周和中枢参与。
关键词:雪灵芝;　镇痛;　机制
中图分类号:R962　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)05-1165-02
　　雪灵芝系石竹科蚤缀属植物(Arenaria.spp), 多年生垫状草
本 , 分布于青藏高原海拔约 5000 m左右的永久雪线附近地带。
《藏药志》记述雪灵芝性味功用 “苦寒 , 清肺中之热 , 止咳 , 降血
压 , 滋补;治肺炎 、淋病 、淋巴结核 、子宫病”。
彭宝珠等 [ 1 ～3]对雪灵芝的药理药效学进行了研究。 试验证
明 , 雪灵芝提取物有抗炎 、抗免疫 、解热镇痛 、镇咳祛痰 、抗乌头碱
引起的心律失常作用 、抗缺氧和降血压作用 , 对酒精性肝损伤具
有明显的保护作用 , 并能够增强免疫功能 , 对肿瘤具有抑制作用。
雪灵芝是一种能提高综合免疫能力的传统药物 ,其药用价值有进
一步研究的必要。
研究表明 [ 4] , 蚤缀中含有氨基酸 、糖类 、生物碱 、黄酮苷 、皂
苷及香豆素等多种成分。本研究对雪灵芝的提取物进行了分离 ,
得到了镇痛有效部位 ,利用分光光度法对两个部位进行了总黄酮
含量的测定 , 并其镇痛作用进行了研究。
1　材料
1.1　药物与试剂 阿司匹林 , 罗痛定注射液(广东省博罗先锋药
业集团有限公司 , 批号:070904), 罗痛定片(成都市湔江制药厂 ,
070603);芦丁对照品(南京替斯艾么中药技术研究所 , 批号:
TCM027-080118);亚硝酸钠 、氯化铝 、乙醇 、冰醋酸 、氢氧化钠均
为普通市售分析纯试剂;雪灵芝采自西藏自治区。
1.2　动物 昆明种小鼠 , 雌雄不论 , 体质量 18 ～ 22 g, 洁净级 ,由
广西医科大学实验动物中心提供 ,动物合格证号:2005A033号。
2　方法
2.1　分光光度法测定总黄酮含量 [ 5] 雪灵芝药材采自西藏自治
区 , 经广西植物研究所高级工程师黄定中鉴定为雪灵芝 Arenaria
kansuensisMaxim。雪灵芝全草用水提取 , 水提液上 D101大孔树
脂 , 以蒸馏水洗脱至无色;以 30%乙醇洗脱 , 收集洗脱液 , 浓缩干
燥 , 得 C012;60%乙醇洗脱 ,收集洗脱液 ,浓缩干燥 , 得 C013。
精确称取 20.0 mg芦丁对照品 , 以 60%乙醇溶液超声溶解并
定容至 100 ml, 分别移取上述芦丁储备液 0, 1.00, 2.00, 4.00,
6.00, 8.00, 10.00ml于 7个 25ml量瓶中 ,加入 0.50 mol/L的亚
硝酸钠溶液 1.0 ml,摇匀静置 5 min后 , 加入 0.30 mol/L氯化铝
溶液 1.00ml, 摇匀静置 5min后 ,加入 1.00mol/L氢氧化钠溶液
5.0 ml,用 60%乙醇水溶液定容至刻度。取芦丁溶液在波长 360
～ 600 nm区间扫描 ,确定最大吸收波长为 505 nm。取不同浓度
芦丁溶液于波长 505 nm处比色测定吸光值 , 试剂空白参比 ,绘制
标准曲线 , 线性回归分析得标准回归方程:A=2.353 5C-
0.0371 2, 回归系数 r=0.993 3。
分别精密称取样品 C012:0.300 5 g,样品 C013:0.300 9g, 用
60%乙醇溶解并定容到 50 ml的容量瓶中 , 再各取两样品溶液 2
ml于 50 ml的容量瓶中 , 定容。参照上述方法 , 吸取标准品溶液
或样品溶液 ,进行精密度 、稳定性 、重现性和回收率实验 [ 6] 。
2.2　镇痛实验方法 [ 7]
2.2.1　热板法 雌性小鼠 , 放在(55±0.5)℃的金属热板上 , 挑选
痛阈值在 5 ～ 30 s的小鼠 ,根据痛阈值随机分生理盐水组 、阳性
药物组和测试药物高 、中 、低剂量组 ,每组 10只 , 各组均 ig给药
(0.2 ml/10 g), 1次 /d,连续 7 d。末次给药后不同时间分别再测
痛阈 , 以药后痛阈的提高值为指标 , 进行组间比较。
2.2.2　对醋酸引起的小鼠扭体镇痛实验 取昆明种小鼠 80只 ,
随机分成 8组 , 即生理盐水组 , 阿司匹林组(200 mg/kg), C012
高 、中 、低剂量组(200, 100, 50 mg/kg), C013高 、中 、低剂量组
(200, 100, 50 mg/kg), 每组 10只。连续灌胃给药 7 d, 2次 /d, 每
次 0.2ml/10g。最后一次灌胃后 1h,给各组小鼠腹腔注射 0.5%
乙酸溶液 0.2 ml/只。 然后以腹部内陷 、四肢伸展及臀部抬高为
疼痛反应指标 , 观察 15 min内出现扭体反应的次数 , 计算镇痛
率。
镇痛率(%)=[ (模型组扭体次数 -给药组扭体次数)/模型
组扭体次数 ] ×100%
药效学实验数据以 x±s表示 , 采用 SPSS统计软件进行统计
学处理 。
3　结果
3.1　精密度 准确吸取标准品溶液 1 ml, 分别置于 5只 10 ml容
量瓶中 , 按照标准曲线项下操作 , 测定吸光度 , 计算 RSD为
0.25%,精密度良好。
3.2　稳定性 准确吸取标准品溶液 1 ml置丁 10 ml容量瓶中 , 按
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.5 时珍国医国药 2010年第 21卷第 5期
照标准曲线项下操作 ,测定 10, 20, 30, 40, 50 min时吸光度 , 求得
RSD为 1.58%, 稳定性良好。
3.3　重复性 取样品 C012溶液 5份 , 在操作条件下测定各自的
总黄酮含量 , 求得 RSD为 0.71%,重复性良好。
3.4　加入回收率实验 量取样品溶液 3份 , 加入不同量的芦丁对
照品溶液 ,按实验方法进行显色 , 测定吸光度 , 计算回收率 , 回收
率在 96% ～ 101%之间。
3.5　总黄酮含量 吸取 C012和 C013溶液 ,按标准曲线项下操作
测定吸光值 , 计算总黄酮含量。结果见表 1。
3.6　热板法实验 结果见表 2, 结果表明 , 雪灵芝化合物 C012、
C013均对热板引起的疼痛有很好的抑制作用。 C012部位 200
mg/kg镇痛效果显著 , 其 0.5 h和 2.0 h, P<0.001;4.0 h, P<
0.01;1.0 h, P<0.05,对疼痛的抑制作用时间较长;100 mg/kg在
0.5 h也有很好的镇痛效果(P<0.01)。 C013部位 200 mg/kg在
2.0, 4.0h镇痛效果好(P<0.01或 P<0.001);在 0.5 h, P<
0.05;剂量 100 mg/kg在 4.0 h具有较好的镇痛效果(P<0.05)。
表 1　样品总黄酮含量测定结果
样品编号 平均吸光度 样品中总黄酮的含量(%)
C012 0.326 59.16
C013 0.285 56.86
表 2　雪灵芝提取物热板法镇痛结果( x±s)
组别 剂量C/mg· kg-1
药前痛阈
t/s
药后痛阈 t/s
0.5h 1.0h 2.0h 4.0h
NS - 20.0±5.0 12.6±2.6 14.8±4.7 14.1±2.9 14.7±5.3
罗通定口服 150 21.2±4.8 34.7±14.8＊＊＊ 26.2±12.9＊ 23.8±14.2＊ 26.3±14.6＊
罗通定腹注 25 21.1±4.1 35.3±16.0＊＊＊ 29.0±13.7＊＊ 32.2±11.0＊＊＊ 34.0±13.8＊＊＊
C012高剂量 200 21.9±4.3 18.3±3.2＊＊＊ 19.0±4.2＊ 21.2±3.7＊＊＊ 22.0±5.0＊＊
C012中剂量 100 21.9±5.4 17.6±3.3＊＊ 16.9±5.3 16.2±3.6 18.0±3.1
C012低剂量 50 22.2±4.0 14.3±4.0 16.8±9.5 23.0±13.7 29.3±13.2＊＊
C013高剂量 200 19.5±6.0 18.7±7.3＊ 19.7±8.7 25.3±7.7＊＊＊ 30.3±11.3＊＊
C013中剂量 100 20.3±4.2 14.8±4.5 14.2±2.2 14.9±4.1 20.6±5.0＊
C013低剂量 50 17.9±2.2 15.5±5.6 14.4±6.4 19.8±7.2＊ 20.6±7.1
　　与 NS组对照 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01, ＊＊＊P<0.001;n=10
3.7　扭体法实验结果 见表 3。由表 3可见 , C012部位 100 mg/
kg具有很好的镇痛效果(P<0.01), 50 mg/kg具有较好的镇痛作
用(P<0.05), 但是高剂量组对醋酸引起的疼痛没有抑制作用。
表 3　雪灵芝提取物扭体法镇痛结果( x±s)
组别 剂量 C/mg· kg-1 扭体次数 抑制率(%)
NS - 26.1±17.2 -
阿斯匹林 200 2.3±7.3＊＊＊ 90.5
C012高剂量 200 29.8±15.1 -14.2
C012中剂量 100 6.6±8.7＊＊ 74.1
C012低剂量 50 10.3±10.2＊ 62.5
C013高剂量 200 28.3±12.7 -8.4
C013中剂量 100 19.2±13.7 26.4
C013低剂量 50 26.7±19.3 -2.3
　　与 NS组对照 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01, ＊＊＊P<0.001;n=10
4　讨论
NaNO2 -A1(N03)3法源于芦丁含量测定法 , 并逐步用于黄
酮类化合物的测定。后来发现这并不是黄酮类化合物的专属反
应 , 因为凡具有邻苯二羟基的物质均能用此法进行显色测量 [ 8] 。
多酚类物质具有邻苯二羟基结构 , 显色反应后在 504 nm有很强
吸收 , 会对黄酮的测定造成干扰 , 测定结果偏高。 AlC13法测定
时 , 芦丁 、桑色素等黄酮类物质反应强烈 ,而对酚酸类 、原花色素
的反应很小 [ 9] , 该法对黄酮类化合物的专属性较强 , 因此 ,本实验
确定选用 AlCl3法对雪灵芝提取物中的总黄酮进行定量测定。
药物治疗是缓解疼痛的主要措施之一 ,根据药物作用部位的
不同 , 将镇痛药分为外周性镇痛药和中枢性镇痛药。热板法利用
小鼠爪趾对热刺激非常敏感的特性 ,考察中枢性镇痛药的镇痛作
用 , 小鼠主要表现为跳跃 、缩足 、舔足;扭体法将刺激剂注入小鼠
腹腔 , 引起炎性介质前列腺素的释放 ,诱导产生疼痛 ,常用作外周
镇痛药的筛选。我们分别用热板法和扭体法对从雪灵芝水提物
分离得到的 C012和 C013两个部位进行了比较研究。
C012和 C013两个部位对热板产生的小鼠足趾疼痛都有很
好的防护作用 , 能够提高药后痛阈值 , 且作用时间较长。 C012中
剂量和低剂量对醋酸致痛具有较好的镇痛作用 , 高剂量则没有镇
痛作用;C013各个剂量则没有作用。 C012成分具有中枢镇痛作
用 ,对快痛 、化学刺激引起的持续性疼痛都有很好的镇痛作用 , 其
具体作用机理和作用方式有待进一步研究。镇痛有效部位总黄
酮含量较高 , 可以认为镇痛的有效成分是总黄酮 , 具体黄酮成分
有待进一步研究。
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 5期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.5