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甘 肃 科 学 学 报 19 9 3 年 第 2 期
上述培养基的蔗糖均为 3 % , 琼脂 0 . 5% , p H 为 5 . 8 。
(二 ) 强心普的提取 、 分离和含全浏定
1
. 强心昔的提取 21[ ①冷浸提取法 : 取愈伤组织 5 克 , 分次加入 l om l 95 %乙醇研磨后 , 浸
泡震荡 2 小时以上 , 离心除去沉渣 , 所得上清液即为强心昔提取液 。 ②温浸法 : 将愈伤组织放入
索氏 ( S o x hl e t) 提取器 , 在索氏提取器和下部烧瓶中各加入一定量的 95 % 乙醇作为提取剂 , 室温
浸泡 5一 6 小时 , 于 85 ` C的水浴中进行液一固萃取 1一 2 小时后 , 再浸泡 、 萃取 , 如此重复 2 次 , 下
部烧瓶中的清液即为强心昔提取液 。
2
. 强心昔的纯化和测定 21[ ①活性炭吸附法 : 将经过冷浸提取法所得的强心昔提取液 sm l ,
加入 0 . 5 克活性炭加热煮沸 5分钟 , 使各种杂质吸附于活性炭 , 离心弃去沉淀 。 将上清液 4 m l 加
入 2% 的 3 . 5一二硝基苯甲酸乙醇液 5m l , 同时加 l m l I N 的 N a 0 H 溶液则呈橙黄色 , 然后在分光
光度计 5 3 5n m 处比色测得 D 值 , 从强心昔的标准曲线上查得含量 。 ②碱式醋酸铅沉淀法 : 取温浸
法所得的强心昔提取液 s m l 加 l m l 碱式醋酸铅并摇匀 , 使色素等杂质沉淀 , 再加 2 . 4 m l6 . 3%
N a ZS O
。 溶液以沉淀过量铅 , 离心弃去沉淀 , 即得纯化的提取液 , 将此提取液加入显色试剂进行 比
色测定 , 求得强心昔含量 。
二 、 试验结果
( 一 ) 愈伤组织诱导及褐变抑制
1
. 不同 B A 含量愈伤组织的诱导
在不同 B A 含量的培养基上 , 愈伤组织的生长速度有明显差异 。 表 1 中的三种培养基 , 2 . 4一
D 浓度相同 , B A 浓度由小到大 , 随着 B A 浓度的增大 , 各培养基上愈伤组织的总生长量相对由少
到多 。 将已褐变的愈伤组织分别转入 M S一 2 、 M S一 3 中 , 在一周后大量细胞均重新恢复分裂能力 ,
产生新的愈伤组织 , 但 M S一 2 只有 1周的迅速生长期 , 而 M S一 3 有 2一 3 周的良好生长阶段 。 再
继续转接 , 两种培养基上的愈伤组织均在 3 天后即可进入迅速生长期 , M S一 2 为 5 天左右的良好
生长期 , M S一 3 为 10 天左右 。
裹 1 不同 B A 含 t 愈伤组织的诱导
2
·
4一 D ( m g / I ) B A (m g / I ) 愈伤组织的诱导及生长
M S一 l 1. 0 0 . 1 叶片培养 2 周 , 出现愈伤组织 . 3 周前后生长迅速 , 愈伤组
织为淡黄色 , 1 月后出现褐变 。
M S一 2 1 . 0 0 . 5 将 M S一 l 已褐变的组织转入此培养基 , l 周后生长迅速 , 2
周后生长速度明显减慢 , 再继代 , 3 夭后生长较快 , 1 周后又减
慢 。
M S一 3 1 . 0 1 . 5 将褐变组织转接此培养基 , 经一周培养生长出新愈伤组织 ,
1 月后生长变慢 . 再转接 , 3天后即进人迅速生长期 , 2 周后生
长速度又 明显减慢 .
2
. 褐变的抑制
在上述三种培养基中 , 愈伤组织均不能维持较长时期的正常生长阶段 , 原因是随着愈伤组织
的不断继代培养 , 细胞代谢产生的醒类物质毒害培养材料 , 使愈伤组织褐化 , 失去产生新组织的
冯 敏等 : 从毛地黄愈伤组织中提取强心昔初报
分裂能力 , 严重的甚至导致组织死亡 。 为抑制褐变 , 加入抗氧化剂 、 改变培养条件等均有一定的
防止褐变作用 。 如表 2 所述 , 在原有培养基中加入抗坏血酸 ( V C ) 可抑制酚类物质氧化成醒类物
质的量 , 培养基中加入活性炭也对吸附酿类物质有较明显的效果 。
愈伤组织恢复细胞分裂能力 , 进入正常生长表明 , 抗坏血酸和活性炭对抑制愈伤组织的褐化
有同样的效果 。 而大量元素减半的培养基中 , 由于营养不充足生长也相对较慢 。 在黑暗条件下的
培养物 , 由于缺乏生长的重要条件 , 生长量很少 。 因此愈伤组织的褐变并不是由于过量的无机盐
及光照过强导致了酿类物质的形成 , 而是由于在细胞旺盛的代谢中产生的酿类物质及较长时期的
生长后营养缺乏所造成的 。
表 2 愈伤组织在抑制褐变培养荃上的生长状况
M S一 3 + V e 3。 将已褐变的愈伤组织转入培养基 , 5 天后褐变渐转为淡黄色 , 10
M S 一 3 + 活性炭 0 . 5% 天后所有褐变均被抑制 , 愈伤组织进入生长期 , 一月后由于营养消
耗生长较慢 , 再转接又可进行正常生长 。
l / 2 M S 一 3 转接 2 周后 , 均进入生长期 , 生长速度较慢 , 褐变也相对较慢 。
M S 一 3 (黑暗培养 ) 愈伤组织生长较慢 , 一月后仅有少量生长 。
(二 ) 愈伤组织 中强心普含量
1
. 不同培养条件下强心普含量
。 ’ 6
{
0
·
5 }
}
① 甲骨!厂①、
胃 。 ②山 l
,
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.
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0
,
3
O
,
2
八侧滋助\油日à嘲如伽今哄
图 1 不 同培养条件下愈伤组织 中强心普含童的比较
M S 一 3十 活性炭 0 . 5% ,
M S 一 3 黑暗培养 , v
l / ZM S一 3 , 址 M S 一 3 褐变死亡 ,
种子萌发一月后的幼叶
①冷浸 、 活性炭吸附法 , ②温浸 、 醋酸铅沉淀法
注 : 所试愈伤组织均为第 6 代 ; 强心普的标准品为毛地黄毒昔
甘 肃 科 学 学 报 1 9 93 年 第 2 期
在愈伤组织的培养中 , 为防止褐变进行了不同培养条件的处理 。 从图 1可以看出 . 属同一代
的愈伤组织在不同培养条件下强心昔含量差异很大 , 在加入活性炭的培养基中 , 代谢产生的有害
醒类物质可被吸收 , 故含量最高 , 而在黑暗中的培养物强心昔含量最少 。
分别用两种方法提取 、 纯化强心昔的结果表明 , 温浸提取 、 醋酞铅沉淀纯化法在五个处理中
的提取物含量均高于冷浸提取 、 活性炭吸附法 。
2
。 不同继代数的强心昔含量
表 3 不同继代数强心普含 t ( m g / g 鲜盆 )
方睿~ ~ 一~ 妙数 1 2 3 4 5 6 7
冷浸 、 活性炭吸附 0 7 1 5 0 . 7 0 2 0 . 5 8 3 0 . 5 4 4 0 . 2 9 9 0 . 5 1 1 0 . 2 5 9
温漫 、 醋酸铅沉淀 l 、 1 0 0 ` 8 7 1 0 . 9 2 7 0 . 8 2 6 0 . 7 6 4 0 . 5 6 0 0 . 3 3 5
由表 3 可见 , 随继代数的不断增加 , 强心昔含量呈渐降趋势 。 为了搞清愈伤组织的继代数与
强心昔含量之间的关系 , 对试验取得的两组 7 对数据分别进行回归分析川 :
x = 2 8
x , = 2 8
艺 y 一 3 . 6 1 3
习 y , 一 5 . : 5 3
y ~ 0
.
5 1 6
n ` = 7 x y
`
= 0
.
7 6 9
艺习
通过计算分别得回归方程为 :
Y = 0
.
8 0 4一 0 . O7 2 X Y , = 1 . 2 0 9一 0 . 1 1 X ,
相关系数 :
r = 一 0 . 8 6 9 r ` = 一 0 . 9 4 4
查表可知 , 计算所得的 r 值达到了 5%一 1% 之间的显著水平 ; r ,值达到 1%的显著水平 。
回归线的估计标准误 :
S
二 . y
= 0
.
0 9 7 5
` 二 , . , ,
= 0
.
0 9 1
回归线 95 写的置倍限 :
Y = ( 0
.
8 0 4士 0 . 2 4 9 ) 一 0 . 0 7 2 X Y ` = ( 1 . 2 0 9士 0 . 2 3 4 ) 一 0 . l l X `
三 、 讨论
从图 1 可见 , 第 6 代愈伤组织在培养基 I 和 l 中 , 强心昔含量近似于栽培种萌发一月后幼叶
中的含量 , 证实了通过组织培养获取较高含量的强心昔是可行的 。 从表 1 可看出 , 在愈伤组织的
培养中 , 随着继代数的不断增加 , 越易进入迅速生长期 , 而生长周期也越短 。 产生这种现象的原
因首先是由于随着不断的继代培养 , 愈伤组织逐渐适应在组培条件下的外部环境 , 细胞的分生能
力不断增加 , 生长速度逐渐加快 , 消耗的营养量在相同时间内相对不断增多 , 越易造成营养缺乏 ;
其次可能是随着继代数的增加 , 细胞逐渐失去原始亲本在自然状况下的抗性 , 而使有害物质干扰
了正常的物质代谢 , 引起愈伤组织细胞的广泛的生理损伤 , 降低了细胞的存活率 , 使生长期缩短
并发生褐变 , 因此控制愈伤组织细胞的分生能力 , 增加营养 , 排除有害物质的干扰 , 提高细胞的
存活率使生长期延长是值得注意研究解决的问题 。
冯 敏等 : 从毛地黄愈伤组织中提取强心昔初报
y ~ 0
.
8 04 一 0 .07 2 x
r =一 0 .8 6 9
y
,
= 1
.
2 0 9一 0 . 11 x ,
r ` = 一 0 . 9 4 4
n , 一 7
11
,几`
0
.
9
0
.
8
派澳卜、①月了八Ou口月任qd乃`11.0乐.0.0
ǎ侧兹.\灿已à喇如伽令票
1 2 3 4 5 6 7
继代数
8 9 1 0 1 1
图 2 不 同继代数与强心普含童的回 归直线
· 冷浸 、 活性炭法 。 温浸 、
① Y = 0 . 8 0 4一 0 . 0 7 2X ② Y `
醋酸铅法
~ 1
.
2 0 9 一 0 . l l X `
从图 2 回归方程直线可明显的看出 , 强心普含量随继代数的增多而逐渐降低 , 这是 由于生长
周期的不断缩短 , 细胞主要进行分生代谢 , 而次生代谢强度较弱 , 次生产物也相应逐渐减少 , 强
心昔含量 自然下降 , 因此随着继代数的增多促进次生代谢产物含量的提高 , 是需认真解决的又一
间题 。 实验结果还表明 , 提取强心昔的两种方法相比较 , 温浸 、 醋酸铅沉淀法提取率较高 , 这是
由于利用冷浸 、 活性炭吸附法纯化强心昔时 , 活性炭吸附杂质的同时也将一定量的强心昔吸附 , 故
同一材料用活性炭纯化后所测得的含量总比醋酸铅纯化的含量低 , 因此醋酸铅法适宜在以后的实
验中应用 , 而活性炭法应淘汰不用 。
本试验的结果还表明 , 培养温度与愈伤组织的生长也有一定关系 , 在 20 一 23 ’ C 生长状况良好 ,
高于 25 ’℃生长减慢 , 且极易褐变 。 温度过高可使组织中的多酚氧化酶活性提高 , 酸类物质被氧化
后产生的醒类物质会逐斩扩散到培养基中 , 抑制其它酶的活性 , 毒害愈伤组织 , 因此控制培养温
度对愈伤组织的正常生长十分重要 。
附 : 图 1数据
不同培养条件下愈伤组织中强心普含 t 比较 (m g / g 鲜 , )
M S一 3+ 活性炭 l / ZM S一 3 M S一 3褐变死亡 M S一 3黑暗培养 叶片
冷浸 、 . 活性炭法① 0 . 5 1 1 0 . 4 3 0 0 . 3 7 6 0 . 1 4 3 0 . 5 3 5
温浸 、 醋酸铅法② 0 . 5 6 0 0 . 4 82 0 . 3 9 7 0 . 1 9 8 0 . 55 1
I l . W V
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参 考 文 献
郑光植 , 药用植物组织培养及其在工业生产上应用研究的进展 经济植物组织培养 , 1 1 7 . 科学 出
版社 , 1 9 8 8 。
中国医学科学院药物研 究所 , 中草药有效成分的研究 ( 第一分册 ) , 3 25 一 3 26 . 人民 I几生出版社 ·
1 9 7 2
。
南京农学院 , 田间试验和统计方法 , 19 7一 2 0 0 . 农业出版社 . 1 9 7 9 。
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R E L IM I N A R Y S T U D I E S O N E X T R A C T I O N O F T O T A I
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C A R D I A C G L Y C O S ID E F R O M T H E C A L L O S I T Y
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A B S T R A C T
T h e a r t i e l e d e a l s w i t h p r e l im in a r y s t u d i e s o n e x t
r a e t i o n a n d m
e a s u r e m
e n t ( ) f t o t a l
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e o s i d e f r o m t h e e a l l o s衡 o f D i g i t a l i s P u ,沪 u ,二 a L . b y t i s s u e e u l t u r e . T h e r e s o l l t 、 s h o w r l: : 、 t t l飞 e 以 ) r卜
t e n t s o f t o t a l e a r d i a e g l y e o s id e a r e a f f e e t e d b y e u l t
u r e m e d i u m w i t h
v : . r i ( ) u s l e
v e l s ( ) f 一) 11 y r 。) l: ( ) r -
m o n e
, v a r i o u s e o n d i t i o n s a n d n u m b e r
s o f e
u l t u r e g e n e r a t io n
, e t e
.
T h e f in d i n g s nr
a y b。 : 、 p )[ l i e d b e r卜
e f i e ia l l y t o e a r d ia e
一
g l y e o
s i d e p r o d u e t io n i n t h e f o
r
m o f i n d u o t
r i a l f l u 记 。 u s p e n 、 io n e u l t u r e .
K e y w o r d s : C a l l o s i t y
,
d i g i z a l i s P u , ,P u ; e a L
. , e a r d ia e g l y e o 、 i d e
.
〔作者简介〕
冯 敏 女 , 1 9 6 3 年 8 月 1 6 日生 , 1 9 8 2 年毕业 于庆阳师专 生物系 . 曾在平凉农业学校任教 5 年 . 现在天水
师专生物系工作 , 任实验师 。
毛学文 男 , 1 9 4 6 年 6 月 7 日生 , 19 6 9 年毕业于甘肃师范大学生物系 , 现在天水师 专生物系从 ’ 11执物学 教
学工作 , 任副教授 、 系副主任 。
刘永宏 男 , 1 9 6 5 年 12 月 ” 日生 , 1 9 8 7 年毕业于西北师大化学系 , 获学士学位 . 现在天水师 专化学 系任
助教 。
潘熙春 男 , 1 9 7 1年 5 月 25 日生 , 现在天水师专生物系生化专业就读 。
陈靠山 男 , 1 9 6 4年 5 月 16 日 , 1 9 8 4 年毕业于陕西师大生物系 ; 在天水师专 任教两年后考入 `全州大学生物
系攻读硕士学位 , 获硕士学位 后继续从事教学工作 ; 1 9 9 2 年考入南京农业大学农学系攻读博 {:学
位 。