全 文 ：文章编号:1001-4829(2008)01-0142-05
　　收稿日期:2007-09-11
　　作者简介:何　建(1980-),男 ,重庆綦江人 ,硕士 ,主要从事园
艺育种研究 , E-mail:emailhejian@126.com.
长穗桑组织培养和四倍体新种质诱导
何　建 1 ,冯　焱 2 ,王建辉 1 ,陈克玲1 ,梁国鲁3
(1.四川省农业科学院园艺研究所 ,四川 成都　610066;2.成都市第二农业科学研究所 ,四川 成都　611130;3.西南大学 , 重庆北
碚　 400716)
摘　要:以长穗桑枝条为外植体 ,建立其无菌离体快繁体系 ,综合利用组织培养技术和秋水仙素诱变技术 ,进行四倍体诱变处理 ,
试验结果表明:长穗桑最佳的增殖培养基为MS+BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖 30g/L,最佳的生根培养基为 1/2MS+
BA0.1mg/L+NAA 0.05mg/L+30g/L蔗糖 ,四倍体诱导的最佳处理条件为 0.2 %浓度的秋水仙素浸泡茎段 3d, 诱导率最高为
16.7 %。
关键词:长穗桑;组织培养;秋水仙素;四倍体
中图分类号:S883.7+4　　　文献标识码:A
Studiesontissuecultureandtetraploid
inductionofMoruswitiorumHand-Mazz.
HEJian1 , FENGYan2 , WANGJian-hui1 , CHENKe-ling1 , LIANGGuo-lu3
(1.HorticultureResearchInstitute, SichuanAcademyofAgriculturalSciences, SichuanChengdu610066, China;2.ChengduSeoendRe-
searchInstituteofAgriculturalSciences, SichuanChengdu611130, China;3.SouthwestUniversity, Chongqing400716, China)
Abstract:AstudyofinducingtetraploidbytreatinginvitrostemsegmentofMoruswitiorumHand-Mazz.wascariedoutwithdiferentcon-
centrationsofcolchicinessolutionanddiferenttreateddurations.TheresultsindicatedthatMS+BA2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+su-
crose30g/Lwastheoptimummediumforbudproliferation, and1 /2MS+BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L+sucrose30g/Lisoptimalfor
rooting.ThehighestinductionrateofMoruswittiorumHand-Mazz.was16.7% bytreatmentwith0.2% colchicinessolutionfor3days.
Keywords:MoruswitiorumHand-Mazz.;tissueculture;colchicine;tetraploid
　　长穗桑(MoruswitiorumHand-Mazz.),是桑科
(Moraceae)桑属(Morus)植物 。长穗桑原产我国 [ 1] ,
果可食用 ,叶可养蚕 ,且果实和鲜叶产量都很高 ,是
难得的果叶两用桑树 ,有较大的经济实用价值 。桑
果(又称桑椹)具营养丰富 、防病治病和延缓衰老等
功能特点 ,在食品和药品上的应用极为广泛 。特别
是桑果中含有一种叫 “白黎芦醇 ”(RES)的物质 ,能
刺激人体内某些基因抑制癌细胞生长 ,并能阻止血
液细胞中栓塞的形成[ 2] 。因此 ,无论是传统医学还
是现代医学都视桑椹为防病保健之佳品。
目前 ,果用桑栽培品种以二倍体为主 ,也有一定
数量的三倍体 ,天然四倍体种质很罕见。生产上应
用的多倍体桑大多具有优质 、高产 、果个大 、肉质厚
等优良性状 ,因此 ,本试验采用组织培养技术和多倍
体育种技术相结合的方法 ,诱导培育长穗桑四倍体
新种质资源 ,以期从中选育出产量高品质好的四倍
体新品种 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
以云南省热带作物研究所提供的优良长穗桑枝
条为试验材料 。
1.2　试验方法
1.2.1　外植体材料灭菌及培养条件　取长穗桑枝
条 ,剪断成带芽的小段 ,洗涤剂浸泡 10 min,自来水
冲洗 30min, 75%乙醇处理 40s, 0.1%升汞消毒 12
min(升汞中加 1 ～ 2滴 2 %吐温-20),无菌水洗 4 ～
6次。采用基本培养基 MS,并依试验目的的需要添
加不同浓度配比的激素和蔗糖 ,每种培养加琼脂
142
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2008年 21卷 1期
Vol.21　　No.1
表 1　增殖培养基的 L9(34)正交试验设计表(供试因子和
水平)
Table1　Orthogonaltableofmediumformultiplication(factorsand
levels)
因子水平
Leveloffactors
因子种类 Factor
A
BA/(mg· L-1)
B
BA/(mg· L-1)
C
蔗糖 /(g·L-1)
1 0.5 0.05 20
2 1.0 0.1 30
3 2.0 0.2 40
6 g/L, pH调至 5.8。培养温度为 25 ℃,每天光照
12 ～ 14 h,光照强度为 1500 ～ 2000 lx。
1.2.2　离体再生体系的建立　采用 L9 (34)正交
表 [ 3] ,考察不同成分的培养基对长穗桑增殖率的影
响 。待初代培养的外植体抽出侧芽后 ,切取侧芽转
入表 1中按正交试验 L9(34)设计的不同的继代增
殖培养基中 。每处理 10瓶 ,每瓶 3 ～ 4个芽。 30d
后统计增殖率 ,因子水平安排(表 1)。
1.2.3　多倍体的诱导方法　将获得的无菌试管苗
茎尖转移到已过滤灭菌的浓度分别为 0.05 %、0.1
%、0.2 %、0.4 %的秋水仙素溶液中 ,处理时间有
1、2、3、4、5d5个梯度 ,对照用无菌水处理 3 d。共
计 21个处理组合 ,每种组合处理 30株 ,放于摇床上
轻轻摇动使其与秋水仙素溶液充分接触 ,处理完毕
用无菌水冲洗 4 ～ 5次 ,转入到不含有秋水仙素的继
代培养基上继续培养 ,待长势恢复良好 ,得到完整植
株后 ,用茎尖进行染色体倍性鉴定。确定为四倍体
的株系予以保留并繁殖。
1.2.4　四倍体的鉴定　采用去壁低渗火焰干燥
法 [ 4]检测长穗桑染色体数目 。每株分别取 1 ～ 2个
茎尖或刚发出来的幼叶作为实验材料。其流程为:
切取分裂旺盛的茎尖或刚发出来的幼叶 ※0.002
mol/L8-羟基喹啉预处理 2.5 ～ 3.5 h※用固定液
(甲醇∶冰醋酸 =3∶1)固定 2 ～ 24 h※纯净水洗净固
定液※酶解(3 %纤维素酶∶3 %果胶酶 =1∶1)2 ～
4h※用纯净水后低渗 10 min※固定 30 min以上※
涂片 ,风干※5 % Giemsa染料(pH=7.0)染色 6 ～
10 min※自来水洗净玻片上多余的染料※镜检 、计
数 、显微摄影。
2　结果与分析
2.1　BA、NAA及蔗糖不同配比对长穗桑增殖效果
的影响
　　从表 2中可以看出 ,随着 BA浓度的增加 ,增殖
率也相应的提高 ,而 NAA、蔗糖的浓度和增殖率的
提高 ,并没有明显的线性关系 。从表 3各因子的水
平来看 ,最优组合是 A3B1C2 ,即 BA浓度为 2 mg/L,
NAA浓度为 0.05 mg/L和蔗糖 30 g/L,但未在本试
验中反映出来 。而从实际结果(表 2)看出 ,最优组
合是 A3B3C2 ,即 MS+BA2.0 mg/L+NAA0.2
mg/L+蔗糖 30 g/L,其最高的增殖率为 320 %。
这是因为正交试验是一种均一性试验设计 ,不可能
包含所有处理组合 ,但仍可以选择较好的处理组合。
从极差值来看 ,由于极差值越大 ,表示该因子越重
要 ,因此从表 3可看出 3种因子中 ,对长穗桑增殖率
影响最大的是 BA,而 NAA和蔗糖的影响作用较小。
而且 ,通过多重比较 ,在 0.05的显著水平上 , 3个水
平的 BA浓度使长穗桑的增殖率有显著差异 ,随浓
度增加 ,增殖率显著增加 。
表 2　增殖培养基正交试验表配比及增殖结果
Table2　Orthogonaltableofmediumformulationandtheresultsofmultiplication
试验代号
No.
因子 Factor
ABA BNAA C蔗糖
接种数
No.ofinoculation
增殖芽数(30 d)/个
No.ofshoots
增殖率(%)
P.C.ofmultiplication
1 0.5 0.05 20 39 58 148
2 0.5 0.1 30 40 68 170
3 0.5 0.2 40 40 50 125
4 1.0 0.05 30 32 86 269
5 1.0 0.1 40 40 89 223
6 1.0 0.2 20 38 84 221
7 2.0 0.05 40 32 98 306
8 2.0 0.1 20 36 94 261
9 2.0 0.2 30 30 96 320
　　注:表中字母 A, B, C分别代表 BA, NAA和蔗糖 ,下同。
Note:TheletersA, B, CinthetablerepresentBA, NAAandsucroserespectively.Thesameasbelow.
1431期 　　　　　　何　建等:长穗桑组织培养和四倍体新种质诱导
表 3　增殖率的最小显著极差法的分析结果
Table3　TheanalyticalresultsofLSR
因子
Factor
水平 1(%)
Level1
水平 2(%)
Level2
水平 3(%)
Level3
极大值 (%)
Max
极小值 (%)
Min
极差 R(%)
Range
A 148 238 296 296 148 148
B 241 218 222 241 218 23
C 210 253 218 253 210 43
2.2　长穗桑四倍体诱导的结果与分析
随着秋水仙素处理浓度的提高 ,对茎尖的伤害
程度相应加重;同一秋水仙素处理浓度其处理时间
的增加与茎尖受伤害程度也呈正相关 。同时 ,用高
浓度的秋水仙素处理发现 ,随着处理时间的延长 ,其
诱导率反而下降 ,多数茎尖由于秋水仙素的毒害作
用 ,虽被转入无秋水仙素的培养基中 ,仍慢慢萎蔫失
去生活力。由表 4可见 ,高浓度的秋水仙素使多倍
体诱导率升高 ,但浓度太高会导致叶片萎蔫或严重
抑制愈伤组织再生能力;而低浓度 、短时间处理 ,则
不易获得加倍材料 。在对秋水仙素处理浓度和处理
时间的最佳组合研究中 ,以 0.2 %秋水仙素处理 3d
效果好 ,四倍体诱导率最高 ,为 16.7 %。从表 4也
可以看出 ,所有处理组合共得到 21株纯合四倍体 ,
26株嵌合体 。具体结果(表 4)。
　　试验采用了染色体计数法鉴定多倍体 ,此法是
鉴定多倍体最为直接准确的鉴别方法。另外 ,人工
诱导多倍体往往会出现生长点细胞染色体加倍 ,而
根尖仍然为原来倍性 ,为了避免该现象对细胞染色
体倍性的鉴定结果的影响 ,本试验采取茎尖为鉴定
表 4　秋水仙素溶液浸泡长穗桑对诱导多倍体的影响
Table4　Theefectsofimmersingshoot-tipincolchicinessolutiononinducingtetraploidsoftheM.witiorumHand-Mazz
秋水仙素浓度(%)
Concentration
ofcolchicines
浸泡时间(d)
Timeof
immersing
处理数(个)
Treated
numbers
死亡数(个)
Dead
numbers
死亡率(%)
Dead
percentage
获得多倍体数(个)
Obtainedpolyploids
四倍体
Tetraploid
嵌合体
Chimera
四倍体诱导率(%)
Inducing
ratio
0.00 3 30 0 0.0 0 0 0
0.05 1 30 0 0.0 0 0 0
2 30 0 0.0 0 0 0
3 30 0 0.0 0 0 0
4 30 0 0.0 0 0 0
5 30 0 0.0 0 1 0
0.1 1 30 0 0.0 0 2 0
2 30 0 0.0 0 1 0
3 30 0 0.0 1 1 3.3
4 30 2 6.7 0 2 0
5 30 5 16.7 2 2 6.7
0.2 1 30 1 3.3 1 2 3.3
2 30 3 10.0 2 4 6.7
3 30 8 26.7 5 3 16.7
4 30 15 50.0 2 2 6.6
5 30 21 70.0 3 1 10.0
0.4 1 30 6 20.0 2 3 6.7
2 30 10 33.3 3 1 10.0
3 30 15 50.0 1 3 3.3
4 30 23 76.7 0 0 0
5 30 27 90.0 0 0 0
144 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　21卷
图 1　长穗桑二倍体细胞染色体 2n=2x=28
Fig.1　Thechromosomeofdiploid
图 2　长穗桑四倍体细胞染色体 2n=4x=56
Fig.2　Thechromosomeoftetraploid
材料。根据幼嫩茎尖细胞染色体的观察结果 ,未经
处理的对照二倍体植株中的细胞染色体数为 2n=
2x=28(图 1)。而经秋水仙素溶液处理后的材料 ,
虽存在较高比例的嵌合体 ,但同时也获得了部分纯
合的四倍体植株 。所得到的四倍体染色体数目为
2n=4x=56(图 2)。
2.3　二倍体与四倍体的形态学观察
与二倍体植株相比 ,四倍体长穗桑具有以下特
征:株型矮化 ,芽粗壮多毛状 ,叶色浓绿 ,叶形较大 、
较厚 ,叶边卷翘 、皱缩 ,叶缘锯齿特别粗大或不规则 ,
叶柄较粗长 ,叶脉粗。 (图 3,图 4)
2.4　嵌合体的分离与利用
实验中 ,经秋水仙素溶液诱导后的植株 ,发现有
嵌合体现象的存在 ,其所占的比例较高。由于嵌合
体在培养过程中 ,各种倍性的细胞增殖速度有异 ,所
以 ,为避免多倍体细胞发生 “回复突变 ”,应尽早采
取嵌合体分离方法来获得纯合的多倍体植株以稳定
其倍性 。即将鉴定确认的嵌合体植株转接到增殖培
养基中诱导其产生不定芽 ,再检测不定芽的倍性 ,如
此反复 ,从中分离得到纯合的多倍体植株 。
3　讨论与结论
3.1　秋水仙素溶液的处理浓度与时间
由于秋水仙素对不同的植物细胞会产生不同程
度的影响 ,处理时应根据不同的植物 、组织 、器官来
灵活掌握处理时间 。至于处理的适宜时间 ,亦以处
理材料完全被浸透 ,并有足够的药量进入生长点细
胞为准 ,而且处理所持续的时间还受到诱变剂的水
图 3　长穗桑二倍体的组培苗
Fig.3　Tubeplantofdiploid
图 4　长穗桑四倍体的组培苗
Fig.4　Tubeplantoftetraploid
解半衰期而定[ 5] 。一般来说 ,处理幼嫩的组织 ,如
萌动的种子及幼苗 ,处理的浓度要低 ,处理的时间不
少于 24h。在研究中 ,认为中等浓度与长时间处理
对长穗桑的诱变效果较好 ,秋水仙素的有效浓度为
0.2 %,由于品种及其生理状态的差异有关因为各
种植物和不同组织中微管蛋白与秋水仙素的结合能
力不同[ 6] ,因此在对不同品种或细胞进行处理时 ,
不同的浓度与处理时间会对细胞产生不同程度的影
响 ,所以掌握好秋水仙素的诱变处理的浓度与时间
问题是尤其关键的 。
3.2　关于出现嵌合体现象的讨论
对于出现嵌合体芽较多 ,而纯合四倍体较少的
现象 ,根据乔永刚等人的论述 [ 7] ,这可能是因为 ,一
个芽中所有细胞分裂的时间不同步 ,当幼芽附着有
秋水仙素溶液时 ,正在分裂的细胞就发生了加倍 ,变
成四倍体细胞 ,而此期间该组织中一直处于 G0期的
细胞没有发生分裂 ,继续保持着原来的二倍体形式。
一旦解除了秋水仙素的抑制作用 ,诱导后的芽中各
种倍性的细胞(包括尚未加倍的二倍体细胞)就保
持竞争性分裂状态。由于倍性高的细胞自身 DNA
复制和蛋白质合成速度永远不及二倍体细胞快 ,因
此加倍了的细胞分裂速度就放慢 ,特别是八倍体等
倍性高的细胞分裂速度更慢 。尽管延长时间对正生
长的芽处理 ,大大提高了多倍体细胞在所处理组织
中占有的比率 ,但是几乎不可能完全消除二倍体细
胞在所处理组织中的存在。所以 ,一般说来 ,经过处
理后的材料为多倍体细胞占绝大多数的嵌合体芽 ,
若不及时分离 ,就会使组织中的多倍体细胞逐渐被
1451期 　　　　　　何　建等:长穗桑组织培养和四倍体新种质诱导
二倍体细胞排挤或 “淹没” ,最后恢复成二倍体芽。
3.3　二倍体和四倍体田间表现的比较
要想培育出长穗桑多倍体新品种 ,还须经过田
间试验 、经济性状选择等大量研究工作 ,四倍体长穗
桑新种质的获得已经奠定了前期基础 ,而对四倍体
长穗桑田间表现尤其是结果性状表现有待进一步研
究 。
参考文献:
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bulin[ J].Planta, 1987a, 170:230-241.
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(责任编辑　陈　虹)
146 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　21卷