全 文 ：1级邹年第 2期 二余男椒徽杂志
, 暮章对翻赞
从抽娜` 神亩小娜一斌沁州如朴抽奋病命奋翩` 心~ 扁月一沁耘如
从毛地黄愈伤组织中提取总曹的研究 ·
_ _ _ 一 主一 、 一~ 奋户 书` 户 一 `
刘永宏 。 冯 敏
-一烈份目 -一 `叫 篇认于目一 :一`毛学文 声攀专
月 . . 氏产妇泊 . . 产碑甲“ . . 尹 ~ , 公叭` 司护~ 月 . 曰人阳 . 州 , 六月妇 . , 甘曰. ` 阳` 阳. . 声月
( 甘肃天水师专 )
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`一一 , 、 刁~ 、 甲 、 、 、 八沪、 ~ 、 、 沪曰、 、产曰 、一~ 一翁要: 本文通过毛地黄叶愈伤组织的培养及其时总芬的提取 .分离, `测 定含 量 的 、研究 , 结果表明了不碑激素含量的培养基对愈
伤担 1级的诱 手, 揭 变的抑制 .和总替含量的影
响是不夙的 。 ’ `
关健词 : 愈伤组 织 毛地耸 强心 普 ·
基本处在基础理论的研究阶段 。 术文力阁通
过毛地黄什的愈伤组织培养 , 从中提嗽毛地
茸毒普 , 为工业生产的可行性做些探讨示此
项研究仍在进行 。 :
法方和料
`材
毛地 黄 ( D i招 i at 儿: p u r或uer a L , ) 又 “ ( 一 ) 毛地黄叶片愈伤组织的培养名洋地黄 , 玄参科植物 , 是一种常那的著名 、 将毛地黄种子浅播手湿赫中 , 在2 5 ℃药用植物 , 有强心之效 。 国内外大 量栽结 , 培养室内催芽 , 当长出 4一 6 片叶时取其叶
占地面积大 , 生产周期戈品种客易退化` 药 , 片 、 先用了6酒精浸泡江。秒钟 , 再 用 。 。 1% 的用成份的毛地获毒普主要从核植物的叶一片申一升来液浸 a 一 10分钟 , 最后用无菌水冲洗数
提取 , 1 0 。斤鲜叶只能产生 9· l克毛 地 .黄 毒
称 、故生产成本高 、 价格昂贵 。 毛地黄毒背
一卜户、r、沪滋七加口.广是强心 从二关药拉的一种 , 不仅是治疗心力下
竭的主这药物 , 同时也是一科二要的化学
剂 。 因此其在市场若谈是及今后 的发展前井
是广阔的 。 若仅靠从农培桩物中提取药用成
份难以满足市场需求 。 浪用植物组织培荞的
方法可以克服不 良环境的影啊 , 节约耕 J企和
人力 , 在不受季节限制的条竹 一曰生行认验仁.
究 ` 国外对此方面研郊开始比较早 , 最突出
最成劝的例子是生物转化的研究幻似原西德
eR
i讨砷丈4为首的实验室 $lJ 用培养的细袍证实
了毛地黄毒着 刀一甲琴毛地黄毒葺在丝一 刀
一位置的羚菇化完全有效的转化成为医学上
有用的强心刘葡葡精营地高辛和 刀井 甲攀地
高辛 _。 由于这一维物转化的成功 , 他们已在
工厅进行二了 10 。吨 级发酵罐的冲介石i澎脸、 应
用 于工业牛产万国内在这方面的仙魔释少 , 、
次 , 将叶片剪开 , 接种到经高压锅灭菌并附
如有不同植物激系含量的 M S培养基上 , 一 在
23一25 ℃的培养宝中迸行培养 , 每 天 光 照
8 一 10小时 , 光强 2 0 0 0 l x 。
培养荃为:
M s一 I M s 刁 , 4 一 D I . o + B A O . l `
M S一 2 M S + 2 , 4 一 D l 。 Q十 B A o 。 5
M S一 3 M S + 趴 4 二 D l 。压+ B A I 。 5
_ 上述蜻养基的蔗 糖 均 为 3 % , 球 脂
0
。
S%
, pH为 5 0 8 。 、
_
( 二 ) 总普的提取 、 分离和含量的测定
工、 总脊的提取 ’ 一 以 一 _ ;
( l ) 冷浸提取法 ; 取愈伤组织 5 克 ,
分次加入加呱邪%的乙薛论塘后妥浸泡撰荡
么小时 以上 , 离心除去沉渣 , ’ 所得的士清液
即为总营的提取液 。 、 、
’
( ; 2 ) 湿权法 f 将愈伤组织放人象式掩
取器 , 在索氏提取器和下都放的烧瓶币各加
i 邻玻年笔 2期 , 二 …幽翻越瘫志 _ 总第教期
入一定量的邪 % 乙醇 , 一做为提取剂 。 宝温浸一溶液呈橙黄色 , 一然后在分光光 度 .计 一 波 长
泡 5 一 。 ,; 、时 , 扭欢的挤钟翔伽示恤 娜哄嫩碑施碑骊 ; 现总普的标准曲 线萃 1一 2 少时后 , 再浸泡萃取 , 如此爪复 2
次 , 一卜`城渺清浓即为总瘾而忿。 一 “ :
2 总普的 纯化和测定
( 1 ) 从 )) 醉咬冷沉淀法 : 取上述 任若
提取派 sm l加工。 l减性酷酸铅摇匀以沉捉 色
素等杂厉 再加2 。 理二16 . 3戈 N在 , 5 0 ;沐液以
沉淀过量论 , 离心弃去沉淀 , `即得舀. _ {七的提
取依 。 取提取爪 4 m l加 2 5 弓石的 3 , 5二二 硝 基
苯甲酸乙截一 5 m l , 同时力} . tm l l N 的N a o H ,
上查得含量 。…{ 、 _仆 .交舞丝渺附法洲之经过冷浸提取法习谓的总普提 取液 5m l , 加入 0 . 5克 活 性
炭 , 加热煮沸 5 分钟 , 使各种杂质吸附于活
性炭拼离心舜丢沉淀 , 将上清液加人盗色试
荆 , 进行比色测定户求得总普含量 。 ’ 一牛 『
一 一 试 认验 介绍 、果 ; · ’ 一
’ 、
( 一 ) 愈伤组织的诱导及褐变的抑制
1 不同版素含量对愈伤组织的诱导
`、 l 不同激素含量对愈伤组织的诱导
~ 一一一`一~ 一~ -一 ,一 , ~ 一~ ~ 一 _ , ~ ~ 一~ 卜一一 . 口` . 尸一- . ~ ~ ` 一一一 . . . . . ` ` . ` `2 . 4一 D( m g / l ) B人, 、 {又m g / 工 ) {
-
-一一州
愈 伤 组 织 的 诱 导 及 生 长
M S一 1
一~ 一 「勺
M S一 2
M S一 3{
}
{
一
{…
{
i
{ }
叶片培华 2 周 , 出现愈伤组织 , 3 周前后 , 生长迅速 ,
愈伤川 .织为淡贵色 , 1 月后出现褐变 。
将M s一 1 已褐变的组织转入此培养基 , 1 周后生 长 ,
迅边 , 2 周后生长速度明显减慢 , 再继代 , · 3 天后愈伤组织
生 关较快 , 叉周后又明显减慢 。
将 M一 S 乙 f与变的组织转入此咭养基 , 经 l 周后褐变 抑
制 、 万三戈出新愈份组织 , l 月后生长变慢再转接 3 天后 , 即
{迸入迅速生长门 、
. . . . . . . r , .阮 口肥 . ` : 二 . 侣 . : . . . 门 . 入 , 七 “ . 。 ` 了、 , 困曰 . . . . . . . 二 J , . , “ J` , ; . . , ` 山 . . 、 , , ` , 亡启 , . 二 , . 曰吐 二` ` . .已 . `` n 一 _
在不同激索含量的培丰获上 , 愈伤组织
的生长速度有明显差异 。 表 1 中的三种结养
基 , 2 , 4一 D 浓度相同 , B A浓度由小到大 ,
随着 B IA浓度的大、大 、 各种 J音推基上法 方: 组
织分别转入M S一 ZM S一 3中 , 均在一周后 ,
大量细胞重新恢复分裂能力 , 产生新的它伤
组织 , .但 M S一 2只有一周的迅速生长期 , 而
M S一 3有 2 一 3 周的良好生长阶段 。 再继续
转接 、 两种培芥基上的愈伤组织均在 3 天后
即可进入迅速生长期 , · M s一 2为 6 天左右良
好生长期 , M S一 3为切天左右 。
1周后 `月显减 `漫。
2
、 褐变的抑制
在上述三种培养基中 , 愈伤组织均不能
维持较长期的正常生长阶段 , 原因是随着愈
伤组织的不断继代培养 , 细胞代谢产生的媲
类物质毒害培舞材料 , 使愈伤组织橱花g ,决
去产生新组织的分裂能力, 严重的甚至导致
组织死亡 。 为抑制褐变 , 加入抗氧化荆 , 改
变培养条利·等均有 , 定的防正揭变作用 。 ; 如
表 2所述 , 、 在原娇养墓中加入杭坏血酸 , 可
预防一乱类物质的形成犷晤养基加入活性炭也
对吸附醇类物质有较咖显的效果 。 ’
1 9 9 3年第 2 期 生物学 志 总第多2期
. . . . . . 暇叫目 . “ . 习. ` . ·` 占`` . 忠. . . . . ` . . 巨二. ` 二. . ` . J 因留刘翻. , I “」 . . . . . . . . . . 之 . .
表 2 愈伤组织在抑制褐变的培养基上的生长状况
妇比` 缸` ~ . ` ` ~ 鹅一 ~ 目 恙曰 ~ . ` ` . 甲 二二一~ `一~一一培养基 愈 伤 组 织 生 长 状 况欲M吕 一 3 + V e 3 0 将揭变的愈伤组织转沐培养基 , 5 天后 由祸色渐 渐 转贵, ` 1 0天后所有褐变均被抑制 , 愈伍组织进犬生长期 , 一月吕二 3 + 活性炭。 。石坏1 / ZM S一 3 后由于爵招耗蛛变慢· 又渐淞现褐 色 , 一!郁黔魂少于壑生止益一- 一一一止共一一一转接 2 周后 , 均进入生长期 , 生长速度较慢 、 揭色娜对较慢 。;`!1wel.es二.`1,叭 S一 3丈黛暗 ) 愈伤组织生长最慢 、 ` 月内仅有少 t 生长 。
I
、
M S一 3 + 活性炭 0 。 5% I 、 I / 2
挑 S尸多 获、 琴 8一 3褐变死亡 那、 M乡一 3
界瞬、飞 v 、 ·种子萌发一月后的劫叶 。 一
_ 本实雏蔡夔昔标准品为毛地黄毒讯
冲峥材,J呻志;宝飞墓
愈伤组织的雄滚细脚分科能力: 进入正常伟长表明 , 林坏典酸和活件举对抑制愈伤
辑钾的娜化有祠样的单果。 两禾禅元索减半
的培养蒸电, 一布网样的培养条件下 , 由于营养不良, 生长也相对减慢 。 在黑暗条件下的培
养物 , 由于缺乏生长的重要条件生妹里很少。
界雌愈伤组织的揭变并不是由于过像的无机
盆戈光照过弧 一 导琴了橇类物质的形成 , 而舜申于在细胞旺盛的代谢中产生帅鹅类物质
及较长时期的生长后营养缺乏所造成的 `
( 二 ) 愈伤组织中的总若含里
在毛地黄愈伤组织的培养中 , 为防止褐
变进行了不同培养条件的处理 。 属同一代的
愈伤组织 , 在不同的培养条件下 , 总昔含最
差异很大 , 从图 1 可以看出 , 培养基加入活
性幸后 , 代谢产生的有害艰类物质被吸收 ,
故含量最高而在黑暗中的培养物总普的含量
银少 ,
。呀琳 )’,
` 萄代 朴代 奋代 `俄 -
图 2 、 不 同继代数的总替含童
讨 论
从图 1 中 , 我们可以清楚地看到在培养
爸 I 和 1 .中总着的含量较高 , 证实了通过组 _
织培养获得较高含量的总普是可行的 , 同时
也可看出愈伤组织的培养中 , 随着继代的不
断增加 , 越易进入生长期 , 而生长周期也越
握了产毕这种现象白创系因首先是 随着继代的
不断堵养 , 愈伤组织逐渐适应在组织培养条
件下的外部环资 细袍的分生能力不 断 啥
甄 增长的速度逐渐加佚 , 消耗的营养 t 在
(下转 36 页 )
1 7
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例自祥”
减 · 口 甘 ` 里
图 1 、 不 同培莽条 牛下的基井含分
1 9 9 3年第 2 期 生物学杂志 总第 5毖期
教学内容难度适中 , 才能有利子学生智
力发展 。 若教学内容偏难 , 学生不易理解 ,
造成大脑皮层过度紧张 , 感受性下降 ; 若教
学内容难度太小 , 势必减少对大脑皮层的刺
激强度 , 不利于智力的发展 。 因此 , 我们要
根据大纲要求 , 认真钻研教材 , 把握教材的
逻辑结构和知识休系 , 同时 , 还要充分了解
学生 , 陇我们传授的知识与学生的知 识 基
础 、 按受能力和心理水平相适应 , 能使学生
在较短的时间内学到更多的知识 , 促进智力
发展 。
四 、 教学方法要适合学生的心理发育水
平
首先要根据学生的思维特点 , 加弧直观
教学 。 高中学生虽然抽象思维 日益发展 , 具
有一定的判断推理 、 分析综合能力 。 但对于
一些过于深奥 、 抽象的学习内容 , 与学生的
认知水平和接受能力相差甚远 , 若不借助直
观形象 , 是难以理解和记忆的 。 因此 , 我们
要充 分运用电教媒体 、 实 ! }勿标本 、 显微观
察 、 挂图等多种直观手段 , 使抽象内容与具
体形巍结台 , 半习使内赓变抽象为具休 ,
突破难点 , 帮助学生理解和掌握知识 。
其次 , 要根据学生往意稳定性 , 充分利
用有效时 lbj 。 经观察表明 , 高中学生注意稳
定性约为15 一 20 分钟 。 在这段时间内 , 学生
注意力最集中 , 在大脑皮层容易形成优势兴
奋灶 , 因而对刺激反应最灵敏 , 大大提高了
思维的流畅性 , 这是接受知识的 “ 黄金时
间 ” 。 所以 , 我们甸隔 15 分钟左右就要转换
活动方式 , 如看书 、 讨论 、 提问 、 练习等 ,
争取在 “ 费金时间 ” 内完成新知识的传授 。
再次 , 要根据学生的认识水平 , , 进行启
发式教学 。 在一堂课中 , 要采斤! “ 讲 、 终 、
读 、 议” 四位一体的教学结构 , 使教师托课
方式与学生的思维方式和认知水平帜适应 ,
做到知识的融会贯通 、 举一反三 , 充分发挥
学生的主体作川, 「 :激发学生去思考问题和发
现问题 , 提高李生的思雏能力和知识水耳 。
在教学过程中 , 注意学生的生理和、乙理
卫生 , 对于培养学生的 良好的心理素质 、 提
高学 习效果 、 促进钾能发展都有重要 作月: 。
一剖一 、 厂、 ~ ~ 声 _ ~ ~ ~~
~ ~ 、 J、 J, 、韶 ~ ` ~ 、 `产 、 . 气、 ~ 、 ~ 、 子 、 产、 “ . 、 产、 r 、 、 产、 厂、 、尸 、扩 、 了 `、 J月 , 吕 、 ~ 、 , 勺、 ` 夕、 目声、 曰 、 、 ~ ~ 、 一 ~ 、 、 、 、 召、
、
~ 、 夕~ ` ` 、 ~ 、 ~ 、 “ 了
( 上接第 17 页 )
相同时间内相对不断增多越易造成营 养 缺
乏 ; 其次可能随 音继代数的增加 , 细胞逐渐
失去原始亲木的自然状况下的抗性 , 而使有
害物质干扰了正常的物质代谢 , 引起愈伤组
织的户泛的生卫损场 , 大大降低细胞的存汗
率 , 使生长期缩短并友生揭化 。 囚此控制愈
伤组织的细胞分生能力 , 增加营养 , 排除有
害物质的干扰 , 升高细胞的存活率 , 使生长
期延长是值得注意研究解决的问题 。
从图 2 中 , 我们可以得知前三代总普的
含量较高 , 高于 50 % , 从第四 代 起 低 于
50 %
, 总普的含量随着继代数的增多而逐渐
降低 , 这是 山于生长周期不断缩短 , 细加主
要进行分生代谢 , 而次生代谢相对逐 渐 减
少 , 产物也才{_ {应减少 , 总苍的含量也自然下
降 。 因此随价继代数的增多 , 促进次生代谢
产物的增多 , 是需要认真解决的又一问题 。
另外 , 本试验的结果还可看出培养温度
也与愈伤组织的生长有一定的关系 , 在 20 一
23 ℃生长状况良好 , 高于 25 ℃生长减慢 , 而
且极易褐变 , 温度过高 , 可使组织中的多酚
氧化酶活性提高 , 酚类物质被氧化尼产生的
醒类物质会逐渐扩散到培养基中 , 抑制其他
酶的活性 , 毒害愈伤`组织 , 因此控制培养温
度对愈伤组织的生长状况十分重要 。