全 文 ：文章编号:1006-1126-2009 (2) -0071-04
大叶栎组织培养再生植株的研究
作者简介:王以红 (1957—), 女 , 教授级高工 , 主要从事林木生物技术研究。
王以红 , 陈晓明 , 蔡　玲 , 吴幼媚
(广西林业科学研究院 , 南宁　530001)
摘　要:以 24 年生大叶栎优树环割萌芽条的嫩茎为外植体 , 用 0.1%HgCl2 消毒 6 min , 无菌活体得率 40%;在
BMT 基本培养基上添加 6-BA 0.3 mg/ L 和 IBA 0.25 mg/ L , 芽继代培养 25天 , 增殖系数 3.9 , 且生长健壮;单
芽在 1/2 BM T+IBA 1.0 mg/ L培养基上进行生根诱导培养 , 生根率 80%, 形成完整的组培再生植株。
关键词:大叶栎;组织培养;再生植株
中图分类号:S723.1　文献标识码:A
　　大叶栎 (Castanopsis f issa)属壳斗科栎属 ,
又称黎蒴 、蒴栲 、裂斗椎 、闽南栲等 , 自然分布于
广西 、广东 、福建 、 江西 、湖南 、 贵州等地 , 是一
种地道的乡土树种。大叶栎为常绿阔叶乔木 , 生长
快 , 根系发达 , 枝繁叶茂 , 萌芽力强 , 耐寒耐干旱
瘠薄 , 枯枝落叶多且养分含量丰富 , 有利于林地营
养元素的循环和水分涵养 , 是一种优良的生态树
种;其木材材性好 , 又是优质中 、 高密度纤维板和
纸浆的工业原料树种 , 具有极大的开发利用潜
力[ 1] 。目前生产上大多在普通林分中采集种子繁
殖实生苗造林 , 虽然遗传多样性较为丰富 , 但种源
之间 、 个体之间生长性状差异显著 , 人工林分化
大 , 导致林分生长产量低 , 而用优株萌芽条扦插 ,
穗条材料十分有限 , 繁殖系数低 , 无法满足生产造
林的需要 。为此在选择优良个体的基础上 , 研究大
叶栎组培快速繁殖技术 , 以促进大叶栎造林向良种
化和无性系化发展 , 提高林分单位面积的木材产
量 , 为速丰林工程建设提供优良种苗保障和技术支
撑均具有重要意义。
1　试验材料和方法
1.1　试验材料
组培外植体材料来自于大叶栎优株的萌芽条 ,
优株树龄 24年生。
1.2　试验方法
1.2.1　环割促萌
在雨水充足 、气温回升的春季 , 于优树树干离
地面约 30 cm 处进行环割 , 环割树干周长的 2/3 ,
宽 5 ～ 6 cm , 深至韧皮部 。待萌芽条萌动并生长至
30 ～ 40 cm 时 , 选择晴朗天气的午后采集 , 保湿保
鲜。
1.2.2　外植体消毒
将采回的枝条除去叶片 , 剪切成带 1 ～ 2个腋
芽或茎节 、长约 2.0 cm 的小段 , 按顶芽至第 4 节
与第 5—8节分为两部分。以75%的乙醇消毒 30 s ,
蒸馏水清洗后置于超净台上 , 在无菌操作下用
0.1%HgCl2 再次消毒 , 顶芽至第 4节外植体消毒
4 、 6 、 8 min , 第 5—8 节外植体消毒 8 、 10 、 12
min , 每处理 20段外植体 , 斜插式接种。基本培
养基为 MS , 附加 6 -BA 0.5 mg/ L 和 IBA 0.2
mg/L。接种后的外植体先暗培养 5天 , 再于 1 000
～ 1 500 lx培养 10天 , 统计外植体消毒效果。
1.2.3　基本培养基筛选
选择 MS 、 BMT 、 ER和 B5 为基本培养基 , 分
别加入 6-BA 0.5 mg/L 和 IBA 0.2 mg/ L。每处
理接种无菌活外植体 30 段 , 以肉眼观察到分化生
长的芽时定为外植体始芽萌动 , 连续观察 4周 , 当
培养 25天时进行统计。
1.2.4　芽增殖和生长
在芽的继代培养中 , 选择 BMT 、 6 -BA 和
IBA 为试验因子 , 以 6 -BA 0.5 、 0.3 、 0.1
mg /L和 IBA 0.5 、 0.25 、 0.05 mg/L 为试验水
平 , 共设 9 个处理 , 每处理接种芽 10 颗 , 3 次重
复 , 不定期观察芽的分化 、 增殖和生长状况 , 培养
第 38 卷　第 2 期
2009 年 6 月 　　　　　　　　　　　　　
广 西 林 业 科 学
Guangxi Forestry Science
　　　　　　　　　　　　　　　Vol.38　No.2
Jun.2009
25天以能切割剥离且长大于 0.5 cm 的单芽为计数
标准 , 统计芽的增殖系数 。
1.2.5　生根培养
当芽继代培养扩大繁殖到一定数量并生长到 4
～ 5 cm , 进行生根培养试验 。试验因子设有 IBA
和 IAA以及基本培养基 BMT , 采用 L9 (34)正交
试验设计如表 1 , 培养第 5天开始观察 , 20天时统
计各处理的生根率。
表 1　生根试验因素及水平
A
IBA
B
IAA
C
培养基
1 0 0 BMT
2 1.0 0.3 1/ 2BMT
3 1.5 0.5 1/ 3BMT
1.2.6　培养条件
培养基均添加蔗糖 3%, 琼脂粉 0.3%, 用 1
mol/L HCI 或 1 mol/L NaH2O 调节 , pH 值为 6.8。
培养基于恒温 121℃、 恒压 1.1个大气压下消毒灭
菌15 min 。培养室温度 (25±1)℃, 光照强度 1
000 ～ 3 000 lx , 湿度 60%～ 70%。
1.2.7　练苗移栽
将生根瓶苗搬出培养室移至大棚于自然环境中
练苗 5 ～ 7天 , 移栽基质为红心土与泥炭土混合的
营养基质 , 用 0.2%～ 0.3%高锰酸钾溶液消毒基
质 12 ～ 24 h , 小苗移栽后淋水保湿。
2　结果与分析
2.1　不同处理时间对外植体消毒效果的影响
用 0.1%HgCl2 溶液对不同种类的外植体进行
不同时间的消毒处理 , 试验结果如表 2。0.1%Hg-
Cl2对顶芽至第 4 节茎段的消毒效果明显优于第
5—8节茎段 , 前者消毒无菌活外植体得率最高达
40%, 而后者只有 10%。从消毒时间分析 , 两部
分茎段外植体消毒效果相似 , 时间过长或短都影响
无菌活外植体得率 , 当随着消毒时间的延长 , 外植
体的污染数下降 , 但褐化死亡数加大 。结果显示 ,
顶芽至第 4 节茎段外植体最佳消毒时间为 6 min ,
第 5—8节茎段外植体的最佳消毒时间是 10 min。
表 2　不同处理时间对外植体消毒效果的比较
茎段外植体 消毒时间/min
接种数
(段)
污染数
(段)
褐化死亡数
(段)
无菌活外植体
(段)
得率
/ %
顶芽至第 4 节 4 20 20 0 0 0
6 20 12 0 8 40
8 20 10 4 6 30
第 5—8节 8 20 20 0 0 0
10 20 16 2 2 10
12 20 15 4 1 5
2.2　基本培养基对始芽萌动生长的影响
以 4种基本培养基对外植体始芽萌动进行诱导
培养试验 , 并将始芽诱导率进行邓肯氏新复极差法
检验 , 结果见表 3。
表 3　基本培养基对外植体始芽萌动的影响
基本培养基 接种数 (段) 诱导芽数 (段) 诱导率/ % 芽生长状况
MS 30 14 46.7b 芽伸长较缓慢 , 2～ 3 个新芽 , 培养后期芽枯死
ER 30 11 36.7c 芽伸长慢 , 芽高小于 1 cm , 无新芽萌动
B5 30 13 43.3b 芽伸长较缓慢 , 2～ 3 个新芽 , 培养后期芽枯死
BM T 30 18 60a 芽伸长较快 , 芽高约 3 cm , 2 ～ 3个新芽
字母表示经邓肯氏新复极差法检验在 P=0.05 水平上差异显著
72 广 西 林 业 科 学　　　　　　　　　　　　　　　　　第 38 卷
　　不同的 4种基本培养基均能诱导外植体始芽的
萌动 , 但诱导效果不一样 。从诱导率分析 , 在
BMT 基本培养基上 , 始芽诱导率为 60%, 显著高
于 ER 、 B5 和 MS 培养基 36.7%～ 46.7%。从芽的
生长状况看 , 外植体在 BMT 基本培养基上培养 7
天时 , 茎段外植体两端逐渐膨大形成白色愈伤组
织 , 始芽开始萌动呈浅绿色 , 培养 2周后芽伸长至
3 cm 左右 , 而在其它基本培养基上的始芽伸长不
长 , 大约为 1 cm 。随着培养时间延伸到 4周 , 芽
在4种基本培养基的生长表现出明显的差异 , 在
MS 、 B5 和 BTM 基本培养基上 , 始芽萌动后又分
化 2 ～ 3个新芽 , 而在 ER上几乎不产生始芽以外
的新芽 , 这与其它栎类树种组培研究报道的结果基
本一致[ 2-4] 。芽经继续培养并进行观察 , 在 BMT
基本培养基上芽依然生长 , 且叶色翠绿 , 而其它基
本培养基上的芽顶部或叶尖开始出现褐化 , 严重时
芽出现枯死。分析认为 , 芽生长初期可以利用外植
体茎段自身的营养生长 , 当自身的营养消耗完后则
迫使吸收外源营养 , 如果外源营养适宜 , 芽则健康
生长 , 否则芽因得不到适宜的外源营养而导致出现
顶部或叶尖干枯死亡。比较基本培养基对外植体始
芽诱导培养的试验结果 , BMT 是大叶栎组织培养
较适宜的基本培养基。
2.3　外源激素组合对芽增殖培养的影响
将大叶栎芽转接在 9种外源激素组合上进行继
代增殖培养试验 , 结果见表 4 。
表 4　外源激素组合对芽增殖培养的影响
6-BA
/ (mg/ L)
IBA
/ (mg/ L)
增殖
系数 芽生长状况
0.5 0.5 4.0 叶卷曲 , 芽粗短玻璃化
0.5 0.25 4.3 叶卷曲 , 芽粗短密集玻璃化
0.5 0.05 3.8 叶卷曲 , 芽较粗短密集玻璃化
0.3 0.5 3.6 叶片展开 , 芽细长 , 生长较弱
0.3 0.25 3.9 叶片展开 , 芽生长健壮
0.3 0.05 3.1 叶片展开 , 芽生长健壮
0.1 0.5 1.2 叶片较小 , 叶尖卷曲 , 芽长势弱
0.1 0.25 1.4 叶片较小 , 叶尖卷曲 , 芽长势较弱
0.1 0.05 1.1 叶片小 , 叶尖卷曲 , 长势纤弱
　　6-BA与 IBA 不同浓度配比组合对大叶栎芽
的分化 、 增殖和生长所产生的效应差异较为明显 。
从 6-BA 来看 , 芽在浓度为 0.1 mg/ L 时大部分不
出现分化 , 呈单芽生长 , 且生长势弱。当随着浓度
的增加芽的增殖系数也相应提高 , 但浓度提高到
0.5 mg/ L 时 , 虽然增殖系数达 4.3 , 但芽的生长
质量却呈下降趋势 , 表现出叶卷曲 , 芽粗短呈玻璃
化。从 IBA 来看 , 在 3种与 6-BA 不同组合中 ,
浓度升高到 0.5 mg/ L 时芽的增殖系数都不是最高
的 , 只有当浓度适度地提高为 0.25 mg/L 时 , 增
殖系数才能提高 。从增殖系数和芽的生长状况综合
分析认为 , 当培养基中添加外源激素组合 6-BA
0.3 mg/ L +IBA 0.25 mg/L 时 , 芽可获得较高的
增殖系数 3.9 , 且生长健壮 , 叶色浓绿 , 是大叶栎
芽增殖培养适宜的外源激素组合 。
2.4　单芽根系诱导培养
在继代芽中切割生长健壮的单芽 , 接种于
IBA 、 IAA 与基本培养基组成的 L9 (34)正交设计
上进行根系诱导试验 , 培养 6天单芽基部开始长出
根点 , 15 天时根长 1 ～ 1.5 cm , 形成完整再生植
株 , 各处理的生根率及其分析结果如表 5 所示。
IBA 、 IAA 和基本培养基 3个因素 R值大小次序为
基本培养基>IBA>IAA , 基本培养基是影响大叶
栎生根的重要因素。在本试验中 , 以1/2 BMT为
基本培养基 , 添加 IBA 1.0 mg/L 的生长素生根率
最高达到 79%, 是大叶栎单芽根系诱导培养适宜
73第 2 期　　　　　　　　　王以红 , 陈晓明 , 蔡　玲 , 等:大叶栎组织培养再生植株的研究
的培养基 。
表 5　不同激素和基本培养基组合
正交 L9(34)试验及结果分析
处理 IBA/(mg/ L)
IAA/
(mg/ L)
基本
培养基
生根率
/ %
1 0　　 　0 BMT 0
2 0　　 0.3 1/2 BMT 26
3 0　　 0.5 1/3 BMT 37
4 1.0 　0 1/2 BMT 79
5 1.0 0.3 1/3 BMT 65
6 1.0 0.5 BMT 23
7 1.5 　0 1/3 BMT 45
8 1.5 0.3 BMT 18
9 1.5 0.5 1/2 BMT 68
T1 21 41.333 13.667
T2 55.667 36.333 57.667
T3 43.667 42.667 49 　
R 34.667 6.334 44 　
较优水平 1 0　 1/2 BMT
因素主次 2 3　 1
　　从主次因素看 , 除第 4号培养基处理外 , 适宜
根系诱导培养的培养基还可选择第 5 号 、 9号培养
基 , 对这 3种培养基进行重复试验 , 大叶栎在 3种
培养基上生根率 74%～ 80%, 仍然以 1/2 BMT +
IBA 1.0 mg/L 组合最高为 80%, 且根系较多 , 再
生植株生长健壮 。
3　小结与讨论
大叶栎组培较适宜基本培养基是 BMT , 与
MS 、 B5和 ER培养基相比较 , 主要区别在于BMT
含有 640 mg/ L的 Ca (NO3)2·4H2O , Ca++能促进
植物体内糖分的运输[ 5] , 因此初步认为 , 大叶栎
芽诱导和增殖培养均需要较高水平的钙元素 , 但其
机理有待进一步探索研究。外源激素组合 6-BA
0.3 mg/L +IBA 0.25 mg/L 适宜大叶栎芽的分化
与生长 , 增殖系数 3.9/25 d , 且芽生长健壮 。单芽
在 1/2 BMT +IBA 1.0 mg/L 培养基上生根率达到
80%, 而形成产业化育苗仍需进一步提高生根诱导
技术 , 降低大叶栎组培再生植株的培养成本。
参考文献
[ 1]卢斌 , 陈一波 ,梁凯芹.大叶栎速丰林营造技术[ J].中国
林业 , 2008(11):56.
[ 2]吴幼媚 , 陈晓明 ,王以红 , 等.大叶栎组织培养技术[ J].植
物生理通讯 , 2008(1).
[ 3] 佐藤亨 , 陈佩钦.用麻栎萌芽的上胚轴片再生幼小植株
[ J].江苏林业科技 , 1992 , 19(3):47-49.
[ 4]张存旭 ,宋敏 ,赵忠.栓皮栎茎段离体培养的研究[ J].西
北植报 , 2004 , 24(7):1260-1265.
[ 5]高桥英一.植物营养元素缺乏与过剩诊断原色图谱[ M].
长春:吉林科学技术出版社 , 2002.
Studies on Tissue Culture and Plantlet Regeneration of Castanopsis fissa
WANGYi-hong , CHEN Xiao-ming , WUYou-mei , CAI Ling
(Guangxi Fo restry Research Institute , Nanning 530001 , China)
Abstract:24-year old superior t rees are girdled to promote sprouting , and the tender stems are used as explants
to study the tissue culture and plant let regeneration of Castanopsis f issa.The results are as follow s:The best ef-
fects are achieved when the explants are treated w ith 0.1%HgCl2 fo r 6 minutes , and the yield rate of aseptic in
vi tro is 40%.The optimal subculture medium is BMT +6-BA 0.3 mg/L +IBA 0.25 mg/L.The propagation
coeff icient could be up to 3.9/25d.The roo ting medium for test-tube plantlets is 1/2BMT + IBA 1.0 mg/L ,
and the rooting rate reaches 80%.
Key words:Castanopsis f issa;tissue culture;regeneration plant
74 广 西 林 业 科 学　　　　　　　　　　　　　　　　　第 38 卷