全 文 ：第 34 卷第 5 期
2015 年 10 月
中 国 野 生 植 物 资 源
Chinese Wild Plant Ｒesources
Vol． 34 No． 5
Oct． 2015
收稿日期:2014 － 12 － 28
基金项目:广西科技攻关项目(桂科攻 0330003 － 1，0424008 － 1H)。
作者简介:苏钛(1981—) ，男(白族) ，硕士，工程师，主要从事药用植物资源与生物技术研究。E － mail:kusutai2000 @
aliyun． com
doi:10． 3969 / j． issn． 1006 － 9690． 2015． 05． 004
匙羹藤愈伤组织培养研究
苏 钛1，2，3，黄宁珍4
(1．云南省药物研究所，云南 昆明 650111;2．云南白药集团创新研发中心，云南 昆明 650111;
3．云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111;4．广西植物研究所，广西 桂林 541006)
摘 要 以匙羹藤组培苗为外植体，研究茎段、茎尖和叶片以及不同植物生长调节剂组合对愈伤组织形成的影响;
采用 4 因素 4 水平正交设计，用 SPSS软件其结果进行分析。结果显示:各种外植体诱导愈伤的能力不同，依次是茎
段、叶片。叶片诱导出非胚性愈伤组织，茎段、茎尖利于诱导胚性愈伤组织和胚状体;愈伤诱导的最佳培养基为 MS
+2，4 － D 2． 0 mg /L + 6 － BA 0． 5 mg /L，诱导率为 84． 5%，愈伤生长旺盛，分裂快，颜色为淡黄色。愈伤组织分化成
苗效果最好的条件是 MS + NAA 1． 0 mg /L + IBA 0． 1 mg /L，分化率达到 90． 6%，最佳的生根条件是 1 /2 MS + NAA
1. 6 mg /L，生根率为 100%。这为研究匙羹藤的组织的脱分化、分化以及胚状体的形成机制提供了参考。
关键词 匙羹藤;组织培养;愈伤组织;正交设计
中图分类号:Q943． 1 文献标识码:A 文章编号:1006 － 9690(2015)05 － 0014 － 06
Study on Callus Culture from Gymnema sylvestre
Su Tai1，2，3，Huang Ningzhen4
(1． Yunnan Institute of Materia Medica，Kunming 650111，China;2． Yunnan Baiyao Group Innovation
and Ｒ＆D Center，Yunnan Institute of Materia Medica，Kunming 650111，China;3． Yunnan Province
Company Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation，Yunnan Institute of Materia
Medica，Kunming 650111，China;4． Guangxi Institute of Botany，Guilin 541006，China)
Abstract Using Gymnema sylvestre as explants to study how stems，stem tips，leaves and hormone affect
callus． Using 4 factors and 4 levels orthogonal to design，using SPSS to analyze results． Ｒesults displayed
that all kinds of explants have different callus induction abilities，followed by stems and leaves． Leaves
inducedi non － embryogenic callus． Stems and stem tips induced embryogenic callus and embryoid． The
best tissue culture of callus induction is MS + 2，4 － D 2． 0 mg /L + 6 － BA 0． 5 mg /L，the induction rate
is 84． 5%，callus grown more vigorous，splinter grown faster，the color is faint yellow． The optimal medi-
um for differentiation was MS + IBA 0． 1 mg /L + NAA 1． 0 mg /L． The inducing rate was 90． 6%，The
optimal rooted medium was 1 /2 MS + NAA 1． 6 mg /L． The rooting rate was 100% ． This provides refer-
ence for dedifferentiation，differentiation，embryoid formation mechanism of Gymnema sylvestre organiza-
tion．
Key words Gymnema Sylvestre;tissue culture;callus ;orthogonal designing
匙羹藤［Gymnema sylvestre (Ｒetz．)Schult］，属
于萝摩科(Asclepiadaceae)匙羹藤属(Gymnema) ，别
名武靴藤、金刚藤、心服黄，在全球主要分布较于印
度、非洲、印度尼西亚等地区，我国主要分布在云南、
广西、海南、浙江、福建、台湾等地，主要攀爬生于沟
边、林缘、灌木中［1］。收载于《广西中药材标准》(第
二册) ，具祛风止痛、生肌、消肿之功效，用于风湿关
节痛、糖尿病、毒蛇咬伤［2］。还被收载于《印度药
典》(IP2010)［3］，近年来研究发现匙羹藤叶具有独
特的降血糖、降血脂、抗龋齿和抑制甜味等作用［3］。
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第 5 期 苏 钛，等:匙羹藤愈伤组织培养研究
可见，匙羹藤无论是作为药品还是保健品，均有较好
的开发前景。关于匙羹藤的研究目前主要集中在匙
羹藤的化学成分分析和药理活性等方面，结合我们
前期对匙羹藤组培快繁的研究，本文以匙羹藤无菌
苗为材料，采用正交试验设计法，旨在明确不同外植
体类型、不同植物生长物质及其不同浓度组合对匙
羹藤愈伤组织诱导的影响，期望能为匙羹藤的进一
步研究与利用提供一定的技术依据。
1 材料和方法
1． 1 材料和试剂
实验所用材料均来自广西植物研究所组培室匙
羹藤继代苗，植物生长调节 NAA (Naphthalene ace-
tic acid)、2 － ip［6 － (△ － isopenylamino)purine］、
TDZ (Thidiazuron)、6 － BA(6 － benzylaminopurine)
和 KT (Kinetin)均为分析纯，为上海 Sigma 公司
生产。
1． 2 方法
1． 2． 1 外植体及基本培养基对匙羹藤愈伤组织诱
导形成的影响
取 0． 5 ～ 1． 0 cm 左右的茎段、茎尖和 0． 5 cm2
的叶片方块，接种在 N68 附加 NAA(0，0． 5 mg /L)、
2，4 － D(0． 1，0． 5，1． 0，2． 0 mg /L)的培养基上和 MS
附加 2，4 － D(2． 0，3． 0 mg /L)、NAA(0，0． 5 mg /L)、
BA(0． 5 mg /L)的培养基上，置于培养架上培养，20
d后观察记录不同外植体及不同基本培养基对愈伤
诱导情况。
1． 2． 2 不同植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导
的影响
根据前期实验初步结论，以茎段为外植体，MS
为基本培养基，考察不同植物生长调节剂浓度及组
合(2，4 － D、NAA、BA、2 － ip) ，对匙羹藤愈伤组织诱
导的影响，每个植物生长调节剂取 4 个水平(见表
1) ，根据 L16(4
4)［4］正交表安排 16 个实验，20 d 后
观察记录。
表 1 植物生长调节剂种类和水平表
水平
因素
2，4 － D NAA BA 2 － iP
1 0 0 0 0
2 1 0． 05 0． 05 0． 1
3 2 0． 1 0． 1 0． 5
4 3 0． 5 0． 5 1． 0
1． 2． 3 愈伤组织分化研究
将淡黄色的分化能力强的愈伤组织接种于含不
同植物植物生长调节剂的分化培养基(表 2) ，40 d
后统计分化率，(分化率 =分化的愈伤组织数 /接种
的愈伤组织数)× 100%。
1． 2． 4 生根培养
将分化的 3 cm左右的嫩芽切下，转接至生根培
养基中，诱导生根。40 d 后统计生根率(生根率 =
生根苗数 /接种嫩芽数 × 100%)。
1． 2． 5 炼苗及移栽
将长至 7 cm以上，有 3 条根以上的的匙羹藤小
苗打开瓶盖，在大棚中放置 5 ～ 7 d 后，取出洗净培
养基，移栽至基质中(基质组成:菜园土与蛭石，体
积比为 1 ∶ 1) ，15 d后统计成活率。
2 结果与分析
2． 1 叶片、茎段等外植体及基本培养基对愈伤组织
诱导的影响
将匙羹藤叶片、茎段外植体接种于表 2 所列不
同诱导培养基上，培养 2 周后观察，结果表明:各种
外植体诱导愈伤的能力不同，依次是茎段、叶片，形
成的愈伤组织在形态上比较一致。叶片从切口处连
续产生愈伤组织，最后整个外植体周围都形成愈伤
组织。茎段首先在切口处形成愈伤，在腋芽处也可
形成。两种外植体的愈伤组织初形成时都呈透明、
无色或淡黄绿色，随着愈伤组织不断地增殖，逐渐形
成白色、粘稠、不透明的愈伤组织。其中茎段形成的
愈伤组织增殖最快，愈伤组织的这种形态特性也最
明显;而叶片产生的愈伤组织淡黄色，表面粗糙，增
表 2 不同外植体形成愈伤的能力差异
基本培养基 2，4 － D(mg /L) BA(mg /L) 茎段诱导率(%) 茎段愈伤组织
生长状况
叶片诱导率(%) 叶片愈伤组织
生长状况
N68 0． 1 15 + 10 +
N68 0． 5 19 + 26 +
N68 1． 0 37 + 25 +
N68 2． 0 56 + + 45 + +
N68 2． 0 0． 5 67 + + + 60 + +
MS 2． 0 0． 5 100 + + + 100 + + +
MS 3． 0 0． 5 100 + 100 + +
注:“ +”表示长势一般，“ + +”表示生长较好，“ + + +”表示长势最好。
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中 国 野 生 植 物 资 源 第 34 卷
殖快，大多为非胚性愈伤组织。综合比较各个因素，
后期的实验中主要采用叶片为外植体诱导非胚性愈
伤组织，茎段作为外植体，诱导胚性愈伤组织和胚
状体。
两种材料在只含 2，4 － D 而不含 BA 的 N68 培
养基上均能诱导出愈伤组织，诱导率随 2，4 － D 浓
度的增加而增大，当 2，4 － D 为 2． 0 mg /L 时诱导率
最高，茎为 56%，叶为 45%。往培养基中添加一定
浓度的 BA(0． 5 mg /L) ，愈伤的诱导率明显提高，茎
和叶的愈伤诱导率分别提高到 67%和 60%。可见，
2，4 － D和 BA对匙羹藤愈伤的形成都非常重要，最
佳植物生长调节剂组合为 2，4 － D 2． 0 mg /L 和 BA
0． 5 mg /L。
在上述最佳的植物生长调节剂浓度和组合下，
将基本培养基由 N68 换为 MS 后发现，茎和叶愈伤
的诱导率均升高到 100%。可见，不同的基本培养
基对匙羹藤愈伤形成的频率影响很大，表现为 MS
基本培养基诱导愈伤组织效果最好，可见匙羹藤在
诱导愈伤组织时对大量元素的需求较高。这与当归
的愈伤组织诱导不同［5 － 6］，可能是不同物种对营养
的要求不同所致。
2． 2 不同植物生长调节剂种类及浓度组合对愈伤
组织诱导的影响
诱导愈伤组织的成功与否与于培养条件，尤其
是植物生长调节剂的种类和浓度最为重要，而外植
体的选择来源和种类对愈伤组织的诱导形成显得不
是那么重要［7］。在匙羹藤愈伤诱导的实验中发现，
在一定条件下，叶片和茎段在添加了 2，4 － D 的条
件下都能诱导出愈伤组织，但是加入其它植物生长
调节剂配合能获得更好的诱导效果，在上述实验基
础上，以 MS 为基本培养基，通过正交试验，系统考
察了 2，4 － D、NAA、BA、2 － iP 四种植物生长调节剂
对匙羹藤愈伤率和愈伤质量的影响(表 3)。
表 3 不同植物生长调节剂组合对愈伤诱导的影响
实验号
植物生长调节剂及水平(mg /L)
2，4 － D NAA 6 － BA 2 － ip
茎段愈伤
诱导率(%)
茎段愈
伤长势(级)
愈伤生长描述
1 0 0 0 0 0 －
2 0 0． 05 0． 05 0． 1 0 －
3 0 0． 1 0． 1 0． 5 21． 3 + 愈伤较少，水化严重，继代困难
4 0 0． 5 0． 5 1． 0 80． 0 + 轻微玻璃化，水渍状
5 1 0 0． 05 0． 5 33． 6 + 颜色暗淡，轻微褐化，愈伤长势差
6 1 0． 05 0 1． 0 10 + 在茎段表面附着一点点愈伤，不形成块状愈伤
7 1 0． 1 0． 5 0 50 + + 轻微褐化，愈伤曾菜花状
8 1 0． 5 0． 1 0． 1 0 －
9 2 0 0． 1 1． 0 80． 0 + + + 形成愈伤多、整个茎段附着愈伤，菜花状，表面被
白霜
10 2 0． 05 0． 5 0． 5 100． 0 + + + + 茎段表面附着一层较厚愈伤，菜花状，淡绿色，形
成较好的愈伤
11 2 0． 1 0 0． 1 58． 0 + + 菜花状，致密
12 2 0． 5 0． 05 0 100． 0 + + + + 颗粒状，致密，淡黄色愈伤多
13 3 0 0． 5 0． 1 100． 0 + + + 颗粒状，致密
14 3 0． 05 0． 1 0 100． 0 + + 颗粒状，致密，有褐化
15 3 0． 1 0． 05 1． 0 100． 0 + + + 形成较大的愈伤块，淡绿色，菜花状
16 3 0． 5 0 0． 5 100． 0 + 疏松，表面光滑
注:“ + + + +”表示长势最好，其次为“ + + +”表示生长较好，“ + +”表示长势一般，“ +”表示长势不好。
方差分析表明 (表 4) ，实验的 4 种植物生长调
节剂中在设定范围内，只有 2，4 － D 对愈伤的诱导
具有显著性影响(Sig = 0． 01) ，其它的都无显著性
影响。
表 4 愈伤诱导的方差分析
因素来源 偏差平方和 自由度 均方 F值 显著性(Sig)
2，4 － D 18 922． 762 3 6 307． 587 29． 217 0． 010
NAA 781． 962 3 260． 654 1． 207 0． 440
6 － BA 3 659． 762 3 1 219． 921 5． 651 0． 094
2 － iP 1 940． 602 3 646． 867 2． 996 0． 196
Error 647． 662 3 215． 887
Total 80 346． 650 16
—61—
第 5 期 苏 钛，等:匙羹藤愈伤组织培养研究
对 2，4 － D 进行 LSD多重比较表明，当 2，4 － D
为 3． 0 mg /L 时愈伤诱导率的均值差比其它处理高
得多，但是诱导出的愈伤生长迅速，大多为白色，粘
稠状、丝状、絮状、表面光滑，水渍状愈伤，继代困难。
当 2，4 － D 2． 0 mg /L 时，均值差虽没 2，4 － D 3． 0
mg /L的大，诱导率没那么高，但是，诱导出的愈伤生
长旺盛，分裂快，颜色为淡黄色，表现出亢进分裂型
愈伤组织的特征，因此在诱导愈伤过程中，应该采用
2，4 － D 2． 0 mg /L。
对 6 － BA 进行 LSD多重比较分析表明，6 － BA
浓度 0 mg /L和 0． 5 mg /L 组间均值差较大，存在显
著性差异，而且在浓度为 0． 5 mg /L 时，愈伤诱导最
大，诱导愈伤大多为类型Ⅱ。因此在诱导培养时应
用 6 － BA 0． 5 mg /L作为优选浓度。
经 Duncan a，b 多重比较分析表明，NAA、2 － iP
的各个处理均处于同一个子集(Subset)中，说明在
所选各个浓度处理条件下，愈伤诱导率并不表现出
明显差异，为非重要因素，在诱导愈伤时，按照重要
因素取最佳值，非重要因素经济的原则，选用最
低值。
综合以上分析，愈伤诱导的最佳培养基为 MS +
2，4 － D 2． 0 mg /L + 6 － BA 0． 5 mg /L，诱导率为
84. 5%，愈伤生长旺盛，分裂快，颜色为淡黄色。
2． 3 不同植物生长调节剂对愈伤组织分化的影响
考察不同激素浓度及组合(IBA 和 BA)对匙羹
藤愈伤组织分化的影响(见表 5)发现，当 BA 的浓
度一定时，IBA 的浓度为 0． 05 ～ 0． 1 mg /L 时，能诱
导分化，分化率随着浓度的增加而增大;BA 浓度为
1． 0 mg /L时，诱导的愈伤组织诱导率高，长势最好。
因此最佳的分化培养基为 MS + IBA 0． 1 mg /L + BA
1． 0 mg /L，诱导率为 90． 6%。
表 5 不同激素组合对根分化的影响
实验号
植物生长调节剂(mg /L)
IBA BA
分化率
(100%) 生长情况
1 0． 05 0． 1 0 － －
2 0． 05 0． 5 66． 7 + + +
3 0． 05 1． 0 70 + +
4 0． 05 2． 0 17 +
5 0． 05 3． 0 5 +
6 0． 1 0． 1 0 － －
7 0． 1 0． 5 0 － －
8 0． 1 1． 0 90． 6 + + + +
9 0． 1 2． 0 100 + +
10 0． 1 3． 0 0 － －
注:“ + + + +”表示长势最好，其次为“ + + +”表示生长较好，“ +
+”表示长势一般，“ +”表示长势不好。
图 1 匙羹藤不同阶段生长情况
2． 4 NAA对匙羹藤生根的影响
影响生根的因素很多，如外植体、光照、温度等，
但是最重要的还是植物生长调节剂，由前期的预实
验已知，NAA对匙羹藤的生根具有重要影响，因此，
本实验添加不同浓度的 NAA，其中 1 /2 MS + NAA1．
6 mg /L的培养基生根最好，培养 40 d后生根率达到
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中 国 野 生 植 物 资 源 第 34 卷
100%，苗健壮(表 6)。
表 6 NAA对匙羹藤生根的影响
实验编号 生根培养基 生根率(100%) 健壮度
1 1 /2MS + NAA 0． 2 mg /L 20． 0 + + +
2 1 /2MS + NAA 0． 8 mg /L 46． 3 + + +
3 1 /2MS + NAA 1． 6 mg /L 100 + + + +
4 1 /2MS + NAA 3． 0 mg /L 100 + +
注:“ + + + +”表示长势最好，其次为“ + + +”表示生长较好，“ +
+”表示长势一般，“ +”表示长势不好。
2． 5 炼苗和移栽
匙羹藤在生根养基上生根后，在大棚炼苗 5 ～
7 d，移栽到基质上，约 15 d 后长出新叶。在实验过
程中发现，不同季节炼苗对成活率有很大关系。4
月份炼苗成活率最高，可达 100%，苗长得比较快。
3 讨 论
在匙羹藤诱导愈伤组织时，所有外植体在不含
有植物植物生长调节剂的 N68、Whiter和MS基本培
养基上均不能形成愈伤组织，只有在附加 2，4 － D
等植物生长调节剂时，才产生愈伤组织。可见，器官
脱分化对植物生长调节剂的需要是必不可少的，所
以对植物生长调节剂的研究也是人们进行愈伤组织
培养时关注的焦点之一。
愈伤组织是非组织化和非分化的组织，由薄壁
细胞组成，通常在分化组织和器官的伤口产生，愈伤
组织的诱导受培养基中生长调节剂的影响［7］。诱
导和培养实际上与内源激素和外源生长调节剂有
关，通过加入不同种类和浓度的外源生长调节剂结
合内源激素，实现外植体到组培苗的整个过程。细
胞分裂素促进细胞分裂，生长素可以促进细胞伸长，
愈伤组织的形成，是分化细胞脱分化以及分生组织
细胞直接分裂形成［8］。根据本研究的实验结果可
知，愈伤组织的诱导过程中，只要有适当浓度的 2，4
－ D存在，即可启动外植体的脱分化的过程、以及分
生细胞的直接分裂，导致匙羹藤愈伤组织的产生和
增殖，说明 2，4 － D 是诱导匙羹藤愈伤组织形成的
有效物质，且相对较高浓度的 2，4 － D 对愈伤组织
的增殖更为有利。其根本原因可能是 2，4 － D 具有
生长素的活性，一方面活化匙羹藤质膜上的 ATP
酶，促使细胞壁环境酸化，增加细胞壁的可塑性，另
一方面，生长素促进核的有丝分裂，有利于 ＲNA 和
蛋白质的合成，为原生质体和细胞壁的合成提供原
料，最终表现为加快细胞的生长，形成愈伤组织［5］，
2，4 － D 是具有苯环的区别于吲哚乙酸等具有吲哚
环和具有萘环的萘乙酸等具有生长素活性的生长
素，这可能是 2，4 － D 优于其余生长素类在诱导愈
伤组织方面表现较好的因素。这是其他种类生长素
所不具备的特异性;6 － BA 对匙羹藤愈伤组织的诱
导、增殖有独特的作用，这可能因为细胞分裂素 6 －
BA调控细胞质分裂，它与受体蛋白结合后，调节基
因活性，促进 ＲNA 合成，加强了转录和翻译。因为
6 － BA存在于核糖体上，促进核糖体与 mＲNA 的结
合，形成多核糖体，加速翻译进度，形成新的蛋白质，
最终表现为细胞的扩大，组织增大，产生愈伤组
织［6］。因此，相对低浓度的 6 － BA 与 2，4 － D 协同
作用，能明显地促进细胞分裂，使愈伤组织快速增
殖。因此，可以得出如下结论:在一定的浓度范围
内，高浓度的 2，4 － D 与低浓度的 6 － BA 协同作
用，能有效的促进匙羹体愈伤组织的诱导及增殖。
而其余的生长素和细胞分裂素组合则不能有效的诱
导匙羹藤愈伤组织的形成与增殖。这可能与 2，4 －
D和 6 － BA的结构特异性有关。
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