全 文 ：天水师专学很 (自然科学版 ) 1 9 9 2年第 2期
不同激素的培养基对毛地黄的强影响
刘永宏 、 冯教 、 潘熙春 、 李平英 、 毛学文 、 陈靠山
摘要 本文通过毛地黄叶愈伤组织的培养 , 及其对强心普的提取分离 , 测定含量的
研究 , 结果表明了不同激素含量的培养基对愈伤组织的诱导 , 褐变的抑制和总普含量的
影响是不同的 。
关键词 愈伤组织 毛地黄 强心普
毛地黄 ( D i ig at h s P u r p u er a L ) 又名洋地黄 , 玄参科植物 , 是一种常用 著 名 的
药用植物 , 有强心之效 。 国内外大量栽培 , 占地面积大 , 生产周期长 , 品种容易退化 。
药用成份的毛地黄毒普主要从该类植物的叶片中提取 , 1 0 公斤鲜叶只能生产 0 . 1克毛地
黄毒普 , 故生产成本高 。 价格昂贵。 毛地黄毒昔是强心普类药物的一种 , 不仅是治疗心
力衰竭的主选药物 , 同时也是一种重要的化学试剂 , 因此其在市场需求量及今后的发展
前景是广阔的 , 若仅靠从栽培植物中提取药用成份难以满足市场需求 。 采用植物组织培
养的方法可以克服不 良环境的影响 , 节约耕地和人力 , 在不受季节限制的条件下进行试
验研究 。 国外在此方面的研究此较早 , 最突出最成功的例子是生物转化的研究 , 以原西
德 R e in h a r d为首的实验室利用培养细胞证实了毛地黄毒普日一甲基毛地黄毒 普在 12 一日
铭尺 护, 口忆 , 、 ,各 、 李乙 ` 风与心吧 J` x知 ` 书与 , J ` 、 , 卜、 父沪 , J 忆口 J 乙心旧 J 、 , 备 ,` 尺奋 、洲与 , J 吧 J J 乙 J 乙次 沪弓火与 ` 洲卜 月 J ` 、 J吧 口 . J ` J 咎`洲与、 哭沪` 洲卜瑞洲与口心碑司洲与司洲卜铭记户J ` 心吧内 J `
五 、 用作饲料添加剂 : 天水白土含有 12 种常量及微量元素 , 这正是禽畜有机体不可
缺少的营养源及生命元素的补剂 。 其中钙的含量最高为 32 . n % (秦城区喇嘛山 ) 是形成
骨骼蛋壳主要成分 , 用 白土做添加剂 , 按 3 一 5 %的比例混入粮食饲料中饲喂 , 能调节
禽畜有机体的营养成分 , 促进新陈代谢 , 排除体内的有害物质 , 并提高饲料的利用率和
提高禽畜的产蛋 、 产肉率 , 可节省大量饲料用粮 。
六 、 用作垫圈料 : 为了增加农用肥料 , 消除或治理畜圈内所造成的污染 , 利用白土
作畜圈垫料 。 由于 白土具有碱性和较强的吸附性 、 消除圈内的气味 , 有灭菌去虫 , 保持
圈内干燥和净化环境的功能。
天水白土主要分布藉河流域 , 东起东泉阮家山 、 甘泉寺 、 扬湾和李官湾 , 中经天水
一北道公路的北侧 , 向西为上韩村 、 李家坪 、 坚家山 、 凤凰山一带 , 呈北西一南东方向
展布 , 全长 40 公里 , 天水白土矿石较软 , 易界易加工 , 交通运输便利 。
白土作为一种新兴的矿物资源 , 尚未被广大群众所认识 , 目前只有个别小厂零星应
用 , 没有形成开发利用优势 , 应加强对白土进行应用研究工作 , 兴办开发企业 , 拓宽致
富门路 , 为振兴天水经济多做贡献 。 、 - · 一 ` -
一位置的经基化完全有效的转化成为 医学上有用的强心剂有萄糖普地高辛和日一甲基 地
高辛 。 由于这一生物转化的成功 , 他们 已在工厂进行了 10 0吨级发酵堆的中间试 验 , 应
用于工业生产 。 国内在这方面的研究较少 , 基本处在基础理论研究阶段 。 本文力圈通过
毛地黄叶的愈伤组织培养 , 从中提取毛地黄毒普 。 为工业生产的可行性傲些探讨 , 此项
试验还在进行研究 。
材料和方法
(一 ) 毛地黄叶片愈伤组织的培养 :
将毛地黄种子钱播于湿硅石 申 , 在 25 ℃培养室内催芽 , 待长出 4 一 6 片叶时取其叶
片 , 先用 75 %酒精浸泡 10 秒 。 再用 0 . 1% 的升汞液浸 8一 10 分钟 , 最后用无菌水冲 洗 数
次 , 将叶片剪开 , 接种到经高压灭菌并附加有不 同植物激素含量的M S培养 基 上 , 在 23
一 2 5 ℃的培养室中进行培养 , 每天光照 8一 10 小时 , 光强 Z0 0 0 L x 。
培养墓为 : M S一 1 M S + .2 4 一 D : 二 十 BA 。 · :
M -S 2 M S
+ 2
.
4 一 D z . 。 + BA o . ,
M S一 3 M S + 2
.
4一 D l 二 + B A : . 。
上述培养基的蔗糖均为 3 % , 琼脂。 . 5% , p H为 5 · 8。
(二 ) 总普的提取 、 分离和含 t 的侧定 :
1
. 总昔的提取 :
( D 冷浸提取法 : 取愈伤组织 5 克 , 分次加入 10 m 195 %乙醇研磨后 , 浸泡震荡 2 小
时以上 , 离心除去沉渣 , 所得上清液既为总普的提取液 。
( 2) 温浸法 : 将愈伤组织放入索氏 ( S o x 川 e )t 提取器 , 在索氏提取器和下部烧瓶中
各加入一定量的 95 % 乙醉 , 做为提取剂 , 室温浸泡 5一 6小时 , 于 85 ℃的水浴中进行液
固萃取 1 一 2 小时后 , 再浸泡 、 萃取 , 如此重复 2 次 , 下部烧瓶中清液即为总普提取液 。
2
. 总普的纯化和测定 :
( 1) 碱式醋酸铅沉淀法 : 取上述总普提取掖 5 m l加 l m l碱式醋酸铅摇匀以沉淀色 素
等杂质 , 再加 2 . 4m 16 . 3% N a : 5 0 `溶液以沉淀过量铅 , 离心弃去沉淀 , 即得纯化的 提 取
液 。 取提取液 4 m l加 2 % 的 3 . 5一二硝基苯甲酸乙醉 液 5 m l , 同 时加 l m l N 的 N a O H ,
溶掖呈橙黄色 , 然后在分光光度计波长 5 3 5 n m处比色测定得D值 , 从总普的标准曲线 上
查得含量 。
( 2) 活性炭吸附法 : 将经过冷浸提取法所得的总普提取液 5 m l , 加入 0 . 5克活性炭
加热煮沸 5 分钟 , 使各种杂质吸附于活性炭 , 离心弃去沉淀 。 将上清液加入显色试剂 ,
进行比色侧定求得总昔的含爱 。
试验结果
(一 ) 愈伤组坎的诱导及福变的抑刹
1
.不同徽素含盘愈伤组织的诱导
在不同激素含量的培养基上 , 愈伤组织的生长速度有明显差异 。 表 1 中的三科堵养
基 , 2 . 4一 D浓度相 同 , B A浓度由小到大 。 随着 B A浓度的增大 , 各培养基上愈伤组 织 的
总生长量相对由少到多 。 将已褐变的愈伤组织分别转入 M S一 2 , M S一 3 中 , 均在一周后 ,
大量细胞重新恢复分裂能力 , 产生新的愈伤组织 , 但M S一 2 只有一周的迅速生 长期 , 而
M S一 3 有 2 一 .3 周的良好生长阶段 。 再继续转接 , 两种培养基上的愈伤组 织 均庄 3天后
即可进入迅速生长期 , M S一 2 为 5 天左右良好生长期 , M S一 3 为 10 天左右 。
不同激素含 t 愈伤组织的诱导
4 一 D ( m l ) BA ( m l ) 愈伤组织的诱导及生长
刹一11川
M S
一 1
叶片培养 2周 , 出现愈伤组织 , 3周前后生
长迅速 , 愈伤组织为淡黄色 , 1月后 出 现 褐
变 。
M S
一 2
将 M S一 1 己褐变的组织转入 此培养基 1周
后生长迅速 . 2 周后生长速度 明显减慢 。 再继
代 , 3天后愈伤组织生长较快 , 1周后又减慢 。
M S
一 3
将褐变组织转接此培养基 , 经 1 周培养揭
变抑制 , 生长 出新愈伤组织 , 1 月后生长变
慢 , 再转接 3天后 , 即进入 迅速生 沃期 , 2周
后生长速度又明显减慢 。
2
. 褐变的抑制 :
在上述三种培养基中 , 愈伤组织均不能维持较长时期的正常生长阶段 , 原因是随着
愈伤组织的不断继代培养 , 细胞代谢产生的醒类物质毒害培养材料 , 使愈伤组织褐化 ,
失去产生新组织的分裂能力 , 严重的甚至导致组织死亡 。 为抑制褐变 , 加入抗氧化剂 、
改变培养基条件等 , 均有一定的防止褐变作用 。 如表 2所述 , 在原培养基中加入抗坏血
酸 , 可预防醒类物质的形成 ; 培养基中加入活性炭也对吸附醒类物质有较明显的效果 。
表 2 愈伤组织在抑制揭变的培养基上生长状况
培 养 基
}
愈 伤 组 织 生 长 状 况
_ _
_
} _
M s
一 3 + v c 3。
}
将褐变的愈伤组织转入培养基 , 5天后 由褐色渐转淡黄 ,
M s
一 3 · 活性炭 。 . 5% …翼霜鬓严互霆夏霭鹭{;盒覆翼翠粼急石星暴皇霍萝
粤M s 一 3 { 转接2周后 ,均进入生长期 ,生长迅速较慢 ,褐变 也相对
·较 J , 。
1
M S
一 3 (黑暗 ) 愈伤组织生长较慢 , 一月内仅有少量生长。
愈伤组织的恢复细胞分裂能力 , 进入正常生长表明 , 抗坏血酸和活性炭对抑制愈伤
组织的褐化有同样的效果 。 而大量元素减半的培养基中 , 在同样的培养条件下 , 由于培养
不充足 , 生长也相对较慢 。 在黑暗条件下的培养物 , 由于缺乏生长的重要条件 , 生长量
很少 。 因此愈伤组织的褐变并不是由于过量的无机盐及光照过强 , 导致了醒类物质的形
成 , 而是由于在细胞旺盛的代谢中产生的醒类物质及较长时期的生长后营养缺乏所造成
的 。
(二 ) 愈伤组织中的总曹含 t :
在毛地黄愈伤组织的培养中 , 为防止褐变进行了不同培养条件的处理 。 属同一代的
愈伤组织 , 在不 同培养条件下总普含量差异很大 ,从图 1 可以看出 , 培养基中加入活性炭
后 , 代谢产生的有害醒类物质被吸收 , 故含量最高 , 而在黑暗中的培养物总营含量最少 。
讨 论
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|司j|叫J|
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//一/7份公7/ V/夕’乞
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图 1 . 不同培养条件下总普盆含 :
1 M S 一 3 十 活性炭 c . 5% I
1 M S , 3褐变死亡 . _ _ . 万
下 二种子萌发寸月后的幼吐 一 、 … . L
`八 M S一 3
M s
一 3 要暗
从图 1中, . 我们可以清荤鸿寮到套境养摹天积 l中鸽背的食量摧膏, 近 似 于 栽 垮
种子萌发一月后幼叶的总普含量 , 证实了通过组织培养获取较高含量的总普是可行的 ,
同时也看到在愈伤组织的培养申 , 随着继代的不断增加 , 越易进入迅速生长期 , 而生长
周期也越短 。 产生这种现象的原因首先是由于随着不断的继代培养 , 愈沉组织逐渐适应
在组织培养条件下的外部环境 , 细胞的分生能力不断增强 , 增长的过艾述渐加快 , 消耗
的营养量在相同时间内相对不断增多 , 越易造成营养缺乏 ; 其次可能是随着继代数的增
加 , 细胞逐渐失去原始亲本在 自然状况下的抗性 , )万使有害物质干扰了正常 的 物 质 代
谢 , 引起愈伤组织细胞的广泛的生理损伤 , 大 尤降低细胞的存活率 , 使生长期缩短并发生
褐化 。 因此控制愈伤组织细胞的分生能力 , 增加营养 , 排除有害物质的干扰 , 升 .巧细胞
的存活率 , 使生长期延长是值得注意研究解决的问题 。
从图 2 中 ,我们可得知前三代总普的含量较高 。 高于 5 编 ,从芽四代起低于 5 %。 , 总
普的含量随着继代数的增多而逐渐降低 , 这是 由于生长周期的不断缩短 。 细胞主要进行
分生代谢 , 而次生代谢相对逐渐减少 , 产韧址相应减少 , 总普的含量自然下降 , 因此随
(下转第 7 5页 )
交
环
么一习匕公址议匕一一一一日乙以 ` 目多 犷田 2 : 不同绝代胜的总昔含 t
本炙脸的总葺标准品为毛地黄毒奋 。
` 最低液量线 :
玩 , 二 6 . 0 火 1 0一 3 ( m )
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(气产)’ ` ·
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,簇 A , H二 = 0 . 0 4 9 x 0 . 2一~ 竺匕= 二二 二 0 . 0 0 19 6 ( m “ / s )5 5 - - - -一 、 ` 一 。 ,五 、 附助设备设计 。 (略 )
六 、 小结
斜孔多溢流边缘气密封塔板 , 由于有斜孔与多溢流两个方面的效果 , 使塔板上泡沫
层高度低而均匀 , 气液接触 良好 , 所 以塔板间距可以较小 , 而且在低板间距下可 以允许
比较高的空塔气速 。 由于气液接触 良好 , 板效率较高 , 加上板间距小 , 所以 当 量 高 度
小 。
与填料塔 、 包括高效填料塔比较 , 斜孔多溢流边缘气密封塔板的各项指标和性能 :
诸如放大特性 、 处理能力 、 当量高度 、 价格 、 制造安装与检修 , 不易堵塞等等 , 一般说
比填料都要好一些 , 因此 , 这种塔板可以在工业上推广使用 , 并可能取得 良好的效果 。
参 考 文 献
〔 1 〕 斜孔塔设备设计 清华大学化工系 1 9 8 7年 5 月
〔 2 〕 斜孔多溢流边缘气密封塔板清华大学化工 系 1 9 8 7年 5 月
〔 3 〕 化工原理 : 清华大学化工系 1 9 8 6年 7 月
心 , 豁 、 刀心` ( 沪 、 刀 e 户 , J 口 , J 之, 刁 e护 、 二告 J 屯 、夕么 , ` 甩口心弋 . , J e 沪` 眨 沪 , J 忆团口吧碑 ,口亡沪 `吧 碑心吧碑 、 二忆 碑 、 J 乙 、二e J心沁奋心戈与弓火与 ,口吸沪` 戈与` 洲乙 .山吧八口匕凡 , 乙` 汉与 ` 筑与心筑与心沉与` 戈与 ,次产 J `
(上接第 81 页 )
着继代数的增多促进 次生代谢产物的增多 。 是需认真解决的又一问题 。
另外 , 本试验的结果还可以看出培养温度也与愈伤组织的生长有一定的关系 , 在 20
一 23 ℃生长状况 良好 , 高于 25 ℃ , 生长减慢 , 而且极易褐变 , 温度过高 , 可使组织中的
多酚氧化酶活性提高 , 酚类物质被氧化后产生的醒类物质会逐渐扩散到培养基中 , 抑制
其他酶的活性 , 毒害愈伤组织 , 因此控制培养温度对愈伤组织生长的状况十分重要 。
参 考 文 献
〔1〕 高井康雄等编 , 散光明译 1 9 8 8 《 植物营养与技术 》 科学 出版社北京 第 45 4一 4幼页 。
〔2〕 岳绍光 1 9 8 9 《植物学通讯》 第 7期 。
〔3〕 中国医学科学院药物研究所 1 9 7 9 《 中草药栽培技术 》 人民卫生出版社北京 第 442 一4 43 页。
〔4〕 中国医学科学院药物研究所 1 9 7 2 《 中草药有效成分的研究 》 人民卫生出版社北京 , 第 2 07 一
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〔5〕 K a u l 、 B 29 6 9 u o e l i a 5 2 、 第 3 4 7一3 5 9页。 、 .