全 文 ：收稿日期:2007-05-08
基金项目:辽宁师范大学教学改革项目(20050101123)
作者简介:梁佼(1985-),女 ,辽宁葫芦岛人 ,辽宁师范大学生命科学学院本科学生。
＊通讯作者简介:姜长阳(1954-),男 ,汉族 ,辽宁大连人 ,教授 ,从事生物技术研究。
　山 东 农 业 科 学 Shandong Ag ricultural Sciences 2007年　第 6期
毛地黄优良变异植株组织培养及无性系的建立
梁　佼 ,程丽娟 ,陈　莹 ,王黎波 ,姜长阳＊
(辽宁师范大学生命科学学院 ,辽宁 大连　116029)
　　摘　要:研究了毛地黄优良变异植株嫩茎愈伤组织的诱导 、分化及无性系的建立。结果表明:MS +1
mg/ L BA+0.6 mg/ L 2 , 4-D 是毛地黄嫩茎愈伤组织诱导的理想培养基;MS+0.5 mg/ L BA +0.1 mg/ L
NAA 是愈伤组织分化的理想培养基;MS+0.2 mg/ L BA+0.2 mg/ L IAA 是不定芽壮苗培养的理想培养基;
1/3MS+0.3 mg/ L IAA 是生根培养的理想培养基;炉灰渣 、河沙是生根试管苗移栽的理想基质。
关键词:毛地黄;组织培养;无性系
中图分类号:S567.210.43　　文献标识号:A　　文章编号:1001-4942(2007)06-0011-04
Tissue Culture and Establishment of Clonal Propagation of
Digi talis pur purea Variant
LIANG Jiao ,CHENG Li-juan ,CHEN Ying ,WANG Li-bo , JIANG Chang-yang＊
(College of L i f e Science , Liaoning Normal University , Dalian 116029 , China)
Abstract　The experiments for callus induction ,dif fe rentiat ion f rom immature stems , the root ing
and transplantat ion of tube seedlings and establishment of clonal propagat ion of digi tali s purpurea
variant w as car ried out.The results indicated that the ideal medium fo r induction and dif ferentiation of
callus w ere MS+1 mg/ L BA+0.6 mg/ L 2 , 4-D and MS+0.5 mg/L BA+0.1 mg/L NAA respect ive-
ly.The ef fective medium for cultiva ting advent itious buds w as M S +0.2 mg/ L BA +0.2 mg/L
IAA.The medium of 1/3MS+0.3 mg/ L IAA was sui table fo r ro oting.Cinder and sand w ere used as
the best medium for t ransplantation.
key words　Digital is purpurea;Tissue cult rue;Clone
　　毛地黄(Digi tal is purpurea)又称自由钟 、洋
地黄 ,属玄参科毛地黄属一年生草本植物 ,原产欧
洲 ,我国也有栽培[ 1 , 2] 。毛地黄是重要的草药 ,有
强心等功效;也是重要的观赏植物 ,近年来辽宁大
连等地已经引种栽培。毛地黄进行盆栽观赏 ,若
在温室中促成栽培 ,可在早春开花 ,植株高大且花
序花形优美 ,多在花坛 、路旁 、广场和岩石园中进
行栽培 ,也可作自然式花卉布置。目前生产中使
用的毛地黄多是由种子育苗而来 ,存在前期生长
速度慢 、生产周期较长 、种子发芽率较低 、实生苗
生长不整齐等问题 ,使园林绿化规模化栽培受到
了一定的影响。在栽培中偶尔可以发现长势非常
旺盛的变异植株 ,但利用种子繁殖 ,因分离作用后
代无法保持变异植株的优良性状 ,而用传统技术
又难以对毛地黄进行无性繁殖 。所以 ,我们对毛
地黄优良变异植株进行了组织培养及无性系建立
的研究。现报道如下 。
1　材料与方法
1.1　材料及灭菌
将在田间发现的长势非常旺盛的毛地黄变异
植株嫩茎切下后 ,放到 250 ml 的磨口广口瓶中 ,
用自来水振荡洗涤 10 ～ 20 min ,再用 0.05%安利
洗涤液振荡洗涤 10 ～ 15 min ,然后置于超净工作
11
DOI :10.14083/j.issn.1001-4942.2007.06.024
台上 ,用 70%乙醇灭菌 20 s左右后 ,迅速用无菌
水振荡洗涤 1 次 ,倒入 0.05%HgCl2溶液振荡灭
菌 10 min ,接着用无菌水振荡洗涤 5 次 ,将装有
材料的瓶子置于约 20℃室温下或温箱中 12 h ,然
后再用 0.05%HgCl2 灭菌 5 min ,接着用无菌水
洗涤 5次 ,即可获得毛地黄无菌嫩茎。
1.2　培养条件
以 MS 或 1/3MS 为基本培养基 ,添加不同浓
度的 BA 、IAA 、NAA 、2 , 4-D。以 MS 为基本培
养基加蔗糖 30 g/L ,以 1/3M S 为基本培养基加
蔗糖 10 g/L 。培养基胨力强度为 180 g/cm2 [ 3] ,
pH5.8 ～ 6.0。培养温度 20 ～ 25℃,光照度 2 000
～ 3 000 lx ,光照 10 ～ 12 h/d。
2　结果与分析
2.1　愈伤组织诱导
将无菌嫩茎切成 0.5 cm 左右茎段 ,接种到以
MS 为基本培养基 , 添加不同浓度 BA 、NAA 、
IAA 和 2 , 4-D的培养基上 ,进行愈伤组织诱导。
接种后 30 d左右可见形成愈伤组织 , 60 d时观察
统计 。由表 1可见 ,在 BA 与 NAA 或 2 ,4-D配
合使用的培养基上均能诱导形成愈伤组织 ,且
BA 与 2 , 4-D配合使用的诱导率明显高于 BA
与 NAA 配合使用的 ,其中在 MS+BA 1 mg/L+
　　表 1　不同浓度激素对嫩茎愈伤组织诱导的影响
激素(mg/ L)
BA NAA IAA 2 , 4-D
接种数量
(段)
诱导愈伤组
织数(块)
诱导率
(%)
0 0 0 0 50 0 0
0.2 0 0 0 50 0 0
0.6 0 0 0 50 0 0
1.0 0 0 0 50 0 0
1.4 0 0 0 50 0 0
1.8 0 0 0 50 0 0
0.2 0.2 0 0 50 25 50
0.6 0.4 0 0 50 21 42
1.0 0.6 0 0 50 36 72
1.4 0.8 0 0 50 31 62
1.8 1.0 0 0 50 42 84
0.2 0 0.2 0 50 0 0
0.6 0 0.4 0 50 0 0
1.0 0 0.6 0 50 0 0
1.4 0 0.8 0 50 0 0
1.8 0 1.0 0 50 0 0
0.2 0 0 0.2 50 37 74
0.6 0 0 0.4 50 38 76
1.0 0 0 0.6 50 50 100
1.4 0 0 0.8 50 46 92
1.8 0 0 1.0 50 50 100
2 ,4-D 0.6 mg/L 培养基上诱导率为 100%,所
诱导的愈伤组织呈淡绿色的颗粒状 ,为具有分化
能力的愈伤组织[ 4] 。把在这一培养基上诱导的愈
伤组织 ,在相同培养基上连续继代培养 12代 ,愈
伤组织的外观仍然保持不变。这说明 MS +1
mg/L BA +0.6 mg/L 2 , 4-D 是毛地黄嫩茎愈
伤组织诱导的理想培养基 。
2.2　愈伤组织的分化及增殖培养
将上述培养的淡绿色颗粒状愈伤组织接种到
以 MS 为基本培养基 ,添加不同浓度 BA 、NAA 、
IBA 和2 , 4-D的培养基上进行分化培养 ,至28 d
愈伤组织开始分化 ,60 d时观察统计 。由表 2可
见 ,在 MS +0.5 mg/L BA +0.1 mg/L NAA 培
养基上 ,愈伤组织的分化率达 99.8%,且培养到
45 d时 ,愈伤组织能分化成密集的丛生不定芽。
这说明 MS+0.5 mg/L BA+0.1 mg/L NAA 是
毛地黄愈伤组织分化的理想培养基 。
　　表 2　　 不同浓度激素对愈伤组织分化的影响
激素(mg/ L)
BA NAA IBA 2 , 4-D 分化数
分化率
(%) 长势
0 0 0 0 0 0
0.5 0 0 0 496 82.7 ++
1.0 0 0 0 315 52.5 ++
1.5 0 0 0 209 34.8 +
2.0 0 0 0 47 7.8 +
0.5 0.1 0 0 599 99.8 +++
1.0 0.1 0 0 508 84.7 ++
1.5 0.1 0 0 331 55.2 ++
2.0 0.1 0 0 68 11.3 +
0.5 0 0.1 0 0 0
1.0 0 0.1 0 0 0
1.5 0 0.1 0 0 0
2.0 0 0.1 0 0 0
0.5 0 0 0.1 0 0
1.0 0 0 0.1 0 0
1.5 0 0 0.1 0 0
2.0 0.1 0 0.1 0 0
　　注:接种愈伤组织颗粒数均为 600;+++好;++较好;+
一般。
2.3　壮苗分化增殖培养
将上述分化的不定芽剪成 1 cm 左右的有芽
茎段 , 接种到 MS +0.2mg/L BA +0.2 mg/L
IAA 培养基上进行壮苗增殖培养 ,30 d时观察统
计。结果:每个单芽茎段平均能增殖生长成 7.5
个高 2.5 ～ 6 cm 、茎粗 0.15 cm 以上 、生长旺盛的
丛生无根苗;且接种茎段的成活率近 100%。把
在这一培养基上生长的无根苗剪段后 ,在相同的
12
培养基上连续继代培养 10代 ,无根丛生苗的长势
和增殖率保持不变。这说明 MS+0.2 mg/L BA
+0.2 mg/ L IAA 是不定芽壮苗分化增殖的理想
培养基。
2.4　生根培养
将上述长势良好 、茎较粗壮的不定苗剪成 2
cm 以上的茎段 ,接种到以 1/3MS 为基本培养基 ,
添加不同浓度 IAA 和 NAA 的培养基上进行生
根培养。至 7 d时形成可见根原基 ,15 d后根开
始并迅速生长 , 25 d 后可长成旺盛的试管苗 ,此
时观察统计。由表 3可见 ,在 1/3MS+0.3 mg/ L
IAA 和 1/3M S+0.2 mg/L NAA 培养基上的试
管苗生根率高 ,生根数目达 8.4条/株以上。但观
察发现 ,在 1/3M S+0.2 mg/ L NAA培养基上形
成的根多是由基部的愈伤组织上长出的 ,几乎都
是无效根[ 5] ,其他加入 NAA 的培养基也有类似
现象 。而在 1/3M S+0.3 mg/L IAA培养基上的
试管苗生根率高 , 根数多 ,长势旺 。这说明 , 1/3
MS+0.3 mg/L IAA 是毛地黄试管苗生根的理
想培养基 。
　　表 3　　　　不同浓度激素对生根的影响
激素(mg/ L)
IAA NAA
生根数 生根率(%)
每株
平均生根数
0.0 0.0 0 0 0
0.1 0.0 18 30.0 3.6
0.2 0.0 39 65.0 4.1
0.3 0.0 59 98.4 8.7
0.4 0.0 47 78.3 8.3
0.5 0.0 17 28.3 3.5
0.0 0.1 23 25.0 1.8
0.0 0.2 55 91.7 8.4
0.0 0.3 48 80.0 4.0
0.0 0.4 29 48.3 2.3
0.0 0.5 33 55.0 6.5
　　注:接种数量均为 60。
2.5　试管苗移栽与扦插
将长势旺盛的生根试管苗培养瓶打开 ,使试
管苗直接与空气接触 ,放在光照强度 5 000 lx 左
右 、温度 20℃以上的条件下炼苗 3 ～ 5 d ,待培养
基表面上刚刚长出菌落时 ,将试管苗拔出 ,洗掉根
部的培养基 ,然后移栽到河沙 、炉灰渣 、营养土 、河
沙与营养土混合物 、炉灰渣与营养土混合物五种
基质上。移栽后在保持湿度 90%以上 、温度 23 ～
30℃、无直射光的条件下 ,10 d 后即可成活 , 25 d
时观察统计。由表 4可见 ,以营养土为基质 ,移栽
不能成活;以营养土与河沙或炉灰渣各半配制的
基质 ,移栽的成活率也很低;以河沙或炉灰渣为基
质 ,移栽的成活率较高 。这说明河沙和炉灰渣是
毛地黄试管苗移栽的理想基质 。
　　表 4　　　　不同基质对移栽成活的影响
基质类型 移栽数(株)
移栽
成活数(株)
移栽
成活率(%)
河沙 50 47 94
炉灰渣 50 48 96
营养土 50 0 0
河沙∶营养土(1∶1) 50 11 22
炉灰渣∶营养土(1∶1) 50 12 24
　　将在壮苗分化增殖培养基上培养的无根苗剪
成 1.5 cm 左右 、至少具有一个芽的茎段 ,扦插到
上部铺有 5 cm 厚炉灰渣的温室苗床上或花盆中 ,
按照移栽试管苗条件管理 ,平均成活率为 91%。
扦插试管苗前 20 d长势较缓慢 ,其后生长速度及
长势与试管生根移栽苗基本一致。
与同期播种的实生苗相比 ,试管苗不仅保持
了叶片大 、花朵多 、长势旺盛等母株的优良变异性
状 ,而且平均花期延长了 5 d ,枯萎时间晚 7 d左
右 ,根系也相当于实生苗的 1.5 ～ 2倍。
3　讨论
虽然现在已有毛地黄组织培养及植株再生的
报道[ 6 , 7] ,但迄今未见毛地黄优良变异植株非分
生组织愈伤组织的无性系建立的报道。本研究以
毛地黄的嫩茎为材料建立的无性系 ,不仅使变异
植株的优良性状得到了保存 ,而且还证明毛地黄
的非分生组织也具有全能性。该研究所获得的高
分化毛地黄嫩茎愈伤组织 ,还为毛地黄的转基因
研究奠定了基础。这种由愈伤组织诱导分化的试
管苗 ,栽培后完全保持了母株的优良变异性状 ,说
明通过组织培养建立的无性系是繁殖毛地黄优良
变异植株的有效途径 ,同时 ,也为毛地黄优良变异
植株的迅速推广应用 、工厂化育苗奠定了基础。
试管苗的花期延长 、枯萎时间推迟 、根系发达 ,除
遗传了母体的变异性状外 ,还与培养过程中使用
较高浓度激素的后效作用有关 。
生根培养中 ,在含有 NAA 的培养基上虽然
也能诱导生根 ,但根系多是由基部的愈伤组织上
长出的 ,这与 NAA 的愈伤组织促进作用强而化
学性质较为稳定有关;长出的根多是无效根 ,因为
愈伤组织没有输导组织 ,移栽后的试管苗根系吸
收的营养和水分难以运输到地上部 ,而由叶子合
成的有机营养也无法运送到根部 ,从而无法保证
植株的正常生命活动 。 IAA 之所以具有良好的
促进生根作用 ,与其化学性质不 (下转第 20页)
13
种子脂肪氧化酶的电泳图谱不同 ,郯城睡果子 、牟
平兔子墩 、non-nod和 8130均为普通型品种 ,郯
城睡果子为 4条酶带 ,其他 3份品种则呈现 3条
酶带 。A.SPDB是由 A.SP 加倍获得的 ,二者种
子脂 肪氧化 酶的电泳 图谱 不同 , A.SP 比
A.SPDB 多一条等电点略偏酸性的 A 酶带 ,其他
3条两者均有 ,但 A.SPDB的酶带 B 、D带显色略
浅。
3　结论与讨论
等电聚焦电泳技术是一种根据样品的等电点
不同而使它们在 pH 梯度中相互分离的一种电泳
技术 ,具有分辨率高 、特异性强 、重现性好等特点。
本研究结果表明 ,花生种子脂肪氧化酶同工酶有
4 条 带 , 等电 点 分 别 为:pH6.35 、 pH7.00 、
pH7.46 、pH7.74。等电点差异明显 ,酶活性高 ,
通过该技术鉴定分析花生种子脂肪氧化酶同工酶
完全可行 。
以亚油酸为底物 ,根据产生氢过氧基手性和
位置专一性的不同 , 植物 LOX 可分为三种类
型[ 7] ,但本研究所得 4条酶带的产物尚不清楚 ,暂
以 A 、B 、C 、D来表示。
根据不同品种花生种子脂肪氧化酶酶带数量
的差异 ,可以将供试品种分为两类:一类呈现 4条
酶带 ,即 A 、B 、C 、D 4条酶带均具有;另一类呈现
三条酶带 ,仅含有 B 、C 、D 3条酶带 ,两类品种的
区别在于酶带 A 的有无 ,酶带 A有何特定生理功
能尚需深入研究 。A.SPDB是 A.SP经加倍处理
后的种质 , A.SPDB 缺少酶带 A ,且酶带 B 和 D
显色略浅 ,原因有待从分子水平深入探讨。
花生种子脂肪氧化酶与大豆相比 ,在酶活性
和酶活性最适 pH 值上均有较大差异[ 5 , 8 ～ 11] ,花
生脂肪氧化酶酶活性最适 pH 值为6.2和8.3 ,大
豆为 6.5 、7.0和 9.0;而花生脂肪氧化酶酶活性
比大豆的低。因此 ,本试验在借鉴大豆脂肪氧化
酶鉴定方法的基础上 ,经过反复试验确定了花生
种子脂肪氧化酶适宜的提取条件 、酶染条件和两
性电解质 pH 范围:提取液 pH7.3 ～ 7.5 ,冰浴提
取;酶染缓冲液为 pH7.4 的磷酸盐缓冲液 ,酶染
温度 26 ～ 28℃,振荡条件下染色过夜。本试验选
用的两性电解质 pH 为 3.0 ～ 9.5 ,而 4 条谱带等
电点在 pH6.35 ～ 7.74间 ,因而下一步选用两性
电解质的 pH 范围 ,可适当缩小至 4 ～ 8之间),以
提高酶带的分辨率。
参　考　文　献:
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(上接第 13页)稳定 ,生根培养 10 d左右即自动
分解有关 ,因为在这段时间里 ,它诱导形成了根原
基 ,这对根的伸长生长极为有利;但根原基形成
后 ,若培养基中仍然存在着较高浓度的生长素 ,就
会抑制根原基的伸长生长 。
河沙和炉灰渣是毛地黄试管苗移栽和扦插的
理想基质 ,与这两种基质通气性好有关 ,这说明充
足的氧气供给是移栽与扦插毛地黄试管苗根系生
长非常重要的条件。
参　考　文　献:
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20