全 文 ：UPLC法同时测定黔产隔山消药材中 3 个 C21 甾体酯苷的含量
*
杨庆雄1，李松林1，张婕2，葛永昌1，严晓琳1
(1．贵州师范大学化学与材料科学学院，贵阳 550001;2．贵州省烟草科学研究所，贵阳 550081)
摘要 目的:建立同时测定民族药材隔山消中 3 个 C21甾体酯苷(白首乌新苷 F、G 和 H)的 UPLC 分析法。方法:样品经
甲醇超声提取后，用 UPLC － PDA 进行分析检测;采用 Waters Acquity UPLC 系统，ACQUITY UPLC BEH C18(2． 1 mm ×
100 mm，1． 7 μm)色谱柱，流动相为乙腈 －水，梯度洗脱，流速为 0． 4 mL·min － 1，检测波长 220 nm，柱温 30 ℃，进样量
2 μL。结果:白首乌新苷 F、G 和 H 3 个 C21甾体酯苷在检测范围内均呈良好线性(r≥0． 9995) ;平均加样回收率(n = 3)
在98． 2% ～ 104． 1%之间，RSD 均不大于 1． 1%。结论:UPLC 分离效果及重复性好，且快速、简便，可作为隔山消药材质
量控制的参考方法。
关键词:超高效液相色谱;民族药材白首乌成分分析;隔山消(耳叶牛皮消) ;甾体酯苷;白首乌新苷
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2012)09 － 1525 － 04
Simultaneous determination of three C21 pregnane
glycosides in Cynanchum auriculatum by UPLC*
YANG Qing － xiong1，LI Song － lin1，ZHANG Jie2，GE Yong － chang1，YAN Xiao － lin1
(1． School of Chemistry and Material Science，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，China;
2． Guizhou Institute of Tobacco，Guiyang 550081，China)
Abstract Objective:To develop an ultra performance liquid chromatography(UPLC)method to simultaneously
determine three pregnane glycosides(cynanauriculosides F，G，H)in Cynanchum auriculatum． Methods:After the
untrasonic － assisted extraction with methanol，the analyses were performed on a Waters UPLC system，equipped
with a binary solvent manager，a sampler manager，a column compartment and a PDA detector． An ACQUITY UPLC
BEH C18 column(2． 1 mm !100 mm，1． 7 m)was used for all analyses． The investigated compounds were separa-
ted with the mobile phases of water and acetonitrile in gradient elution，with a flow rate of 0． 4 mL·min －1 ． The
temperature of column was set at 30 ℃，and the injection volume was 2 L． The detection wavelength was set at 220
nm． Results:The investigated compounds including cynanauriculoside F，G and H had good linearity(r≥0． 9995)
over the tested ranges． The average recoveries(n = 3)were 98． 2% to 104． 1% with RSDs≤1． 1% ． Conclusion:
The developed UPLC method is simple，sensitive and accurate with good repeatability，which is available for quality
control of raw material of Cynanchum auriculatum．
Key words:ultra performance liquid chromatography(UPLC) ;national medicine Baishouwu analysis;Cynanchum
auriculatum;pregnane glycosides;cynanauriculoside
* 国家自然科学基金(30760032，31160076) ;贵州省中药现代化(黔科合社字［2008］5022 号) ;贵州省科技基金(黔科合 J字［2007］2145
号) ;贵州省优秀科技教育人才省长专项基金(黔省专合字(2007)34 号)
第一作者 Tel:(0851)6702134;E － mail:yangqx@ gznu． edu． cn
隔山消 Cynanchum auriculatum Royle ex Wight
为萝摩科(Ascleplaceae)鹅绒藤属植物，又称耳叶牛
皮消［1］，是中药白首乌的植物来源之一。在我国资
源丰富，分布于华中、中南、河北、陕西、甘肃、台湾、
四川、贵州、云南等地;山东、江苏有人工栽培。具有
补肝肾、强筋骨、益精血、健脾消食、解毒疗疮等功
效。现代药理学实验表明，隔山消提取物有抗肿
瘤［2 ～ 4］、胃保护［5］、抗抑郁［6］、抗氧化［7］和抗衰老［8］
—5251—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32(9)
DOI:10.16155/j.0254-1793.2012.09.004
等作用。隔山消中化学成分复杂，最为特征的成分
是其中的苯酮类化合物［9］和 C21甾体酯苷类化合
物［10 ～ 13］，特别是其中的 C21甾体酯苷被认为是隔山
消的主要活性成分。不同产地的隔山消化学成分有
较大差异，药用习惯也不相同。贵州地区的隔山消
主要用于消食健胃［14］，其主要成分含有系列的 C21
甾体酯苷［15，16］。该类成分结构复杂，特别是糖链部
分的微小差异也导致了分离难度较大。本文采用超
高效液相色谱法对贵州地区不同来源的隔山消中 3
个主要的 C21甾体酯苷，白首乌新苷 F(cynanauricu-
loside F)、白首乌新苷 G(cynanauriculoside G)和白
首乌新苷 H(cynanauriculoside H)进行含量测定，旨
在为贵州民族药材隔山消的质量控制提供参考
方法。
1 仪器与试药
ACQUITY UPLC高效液相色谱仪，PDA 检测器
和 Empower工作站软件(美国 Waters) ;恒温超声波
仪(0 ～ 60 ℃) ;AT201 电子天平(德国 Sartorius)。
乙腈为色谱纯，实验用水为重蒸水，其他试剂均
为分析纯。白首乌新苷 F、白首乌新苷 G 和白首乌
新苷 H 的对照品均为自制，通过质谱、1 H － NMR
和13C － NMR 数据及与文献对照确认了它们的结
构，以 HPLC 面积归一化法分析，纯度均 ＞ 98． 5%。
隔山消样品部分采于贵州省都匀、独山、凯里，还有
部分分别购自都匀、凯里和贵阳药材集市，经贵州师
范大学生命科学学院陈庆富教授鉴定为隔山消
Cynanchum auriculatum Royle ex Wight，隔山消药材
留样保存于贵州师范大学生命科学学院标本室。将
隔山消药材阴干，粉碎后过 40 目筛。
2 方法与结果
2． 1 对照品储备液的制备 精密称取白首乌新苷
F、白首乌新苷 G 和白首乌新苷 H 的对照品适量，
置于同一 5 mL 量瓶中，加入甲醇溶解定容，制成
每1 mL含白首乌新苷 F 0． 76 mg，白首乌新苷 G
0． 20 mg，白首乌新苷 H 0． 78 mg 的混合溶液，
即得。
2． 2 供试品溶液的制备 取药材粉末(过 40 目
筛)约 0． 5 g，精密称定，置具塞 50 mL 锥形瓶中，加
入 80% 甲醇溶液 10 mL，密塞，称定重量。超声
(220 W，25 kHz)处理 45 min，放冷，称重，用 80%甲
醇补充减失的重量，摇匀，0． 22 m 微孔滤膜滤过，
取续滤液即得。
2． 3 色谱条件 采用 ACQUITY UPLC BEH C18
(2． 1 mm ×100 mm，1． 7 μm)色谱柱，流动相为乙腈
(A)－水(B)溶液，梯度洗脱(0 ～ 20 min，37% A #
70%A) ，流速 0． 4 mL·min －1，检测波长 220 nm，柱
温 30 ℃，进样量 2 μL，经 0． 22 m滤膜过滤并超声
脱气。在该色谱条件下，各成分得到良好的分离，见
图 1。
图 1 对照品(A)和 1 号隔山消样品(B)的 UPLC图谱
Fig 1 UPLC chromatograms of the mixed reference standards (A)and
the sample of Cynanchum auriculatum (No． 1) (B)
1．白首乌新苷 H(cynanauriculoside H，4． 94 min) 2． 白首乌新苷 F
(cynanauriculoside F，8． 77 min) 3．白首乌新苷 G(cynanauriculoside
G，14． 46 min)
2． 4 线性关系考察及检测限(LOD)、定量限
(LOQ)测定 精密量取上述对照品储备液适量，用
倍比稀释的方法，以甲醇分别制成 6 个浓度的系列
对照品混合溶液:含白首乌新苷 F 0． 76，0． 38，0． 19，
0． 095，0． 0475，0． 024 mg·mL －1;白首乌新苷 G
0． 20，0． 10，0． 050，0． 025，0． 0125，0． 0063 mg·mL －1;
白首乌新苷 H 0． 78，0． 39，0． 195，0． 098，0． 049，
0． 024 g·mL －1。在上述色谱条件下，分别进样
2 L，每个浓度进样 3 针，测量峰面积值。以进样量
(X，g)为横坐标，峰面积平均值(Y)为纵坐标绘制
—6251— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32(9)
标准曲线，计算回归方程，结果见表 1。将混合对照
品溶液用甲醇逐级稀释后做 UPLC 分析，得到 3 个
成分的 LOD(S /N = 3)和 LOQ(S /N = 10) ，结果见
表 1。
表 1 3 个 C21甾体酯苷的线性回归方程及 LOD、LOQ测定结果
Tab 1 The linear regression equation，LOD and LOQ data for the 3 pregnane glycosides
化合物
(components)
回归方程
(regression equation)
线性范围
(linear range)/g
r
LOD /
g·mL －1
LOQ /
g·mL －1
白首乌新苷 F(cynanauriculoside F) Y = －1． 14 !103 + 1． 43 !106X 0． 0475 ～ 1． 52 0． 9999 0． 0070 0． 013
白首乌新苷 G(cynanauriculoside G) Y =1． 04 !104 + 7． 74 !105X 0． 0125 ～ 0． 40 0． 9997 0． 0062 0． 0092
白首乌新苷 H(cynanauriculoside H) Y = －5． 50 !104 + 9． 76 !105X 0． 0488 ～ 1． 56 0． 9995 0． 0081 0． 025
2． 5 精密度试验 取“2 ． 4”项下各化合物线性范
围中间浓度点的对照品混合溶液，连续进样 6
次;并每天进样 2 次，连续 3 d，分别记录各峰面
积，计算各峰 RSD。结果:3 个化合物的日内和
日间 RSD 均不大于 2 ． 5% 和 3 ． 1%，表明精密
度良好。
2． 6 重复性试验 取隔山消 1 号药材粉末 5 份，按
“2． 2”项下方法制备供试品溶液，进样测定并以外
标法计算含量。5 份药材样品经测定，白首乌新苷
F、G 和 H 的平均含量分别为 0． 12%，0． 18%，
0． 63%，对应的 RSD 分别为 0． 47%，0． 69%，
0． 88%。表明本方法重复性良好。
2． 7 加样回收率试验 取已知含量的 1 号药材粉
末约 0． 25 g，共 9 份，精密称定，分别加入一定量
(高、中、低)的 3 个化合物的对照品溶液(其中含有
白首乌新苷 F、G 和 H 的浓度分别为:2． 0 mg·
mL －1，3． 2 mg·mL －1，5． 2 mg·mL －1。高浓度组加
入400 L，中浓度组加入 200 L，低浓度组加入 100
L)各 3 份，按“2． 2”项下方法制备溶液，按上述色
谱条件测定。分别计算平均回收率(n = 3) ，结果见
表 2。
2． 8 稳定性试验 取“2． 4”项下对照品混合溶液，
于 0，1，2，5，10，20 h 分别按上述色谱条件分析，新
白首乌苷 F、G、H 峰面积的 RSD 分别为 1． 5%，
2． 4%，1． 9%。结果表明，对照品溶液中 3 个 C21甾
体酯苷在 20 h内稳定。
2． 9 样品含量测定 取不同产地的药材粉末，按
“2． 2”项下方法分别制备供试品溶液，按本文所述
的色谱条件进样测定，按外标法计算白首乌新苷 F、
G和 H含量，结果见表 3。
3 讨论
萝藦科鹅绒藤属中有很多种植物作为中药和民
族药使用。该属植物的特征性成分 C21甾体酯苷，也
表 2 3 个 C21甾体酯苷的加样回收率结果(n =3)
Tab 2 The recovery of the 3 C21 pregnane glycosides
化合物
(components)
称样量
(sample
weights)/mg
原始量
(original)/
mg
加入量
(spiked)/
mg
回收率
(recovery)/
%
RSD /
%
白首乌新苷 F
(cynanauriculoside F)
241． 13 0． 29 0． 20 101． 5 0． 58
247． 56 0． 30 0． 40 102． 7 0． 72
235． 19 0． 28 0． 80 101． 9 0． 52
白首乌新苷 G
(cynanauriculoside G)
256． 73 0． 46 0． 32 104． 1 0． 61
250． 09 0． 45 0． 64 102． 7 0． 83
245． 60 0． 44 1． 28 103． 8 0． 69
白首乌新苷 H
(cynanauriculoside H)
257． 75 1． 63 0． 52 98． 2 0． 70
244． 60 1． 54 1． 04 98． 3 1． 1
255． 06 1． 61 2． 08 99． 8 0． 92
表 3 贵州不同来源的隔山消药材中 3 个 C21
甾体皂苷的含量测定结果(%，n =3)
Tab 3 Determination of cynanauriculosides F，G，H in C．
auriculatum collected from different areas
in Guizhou province
序号
(No．)
来源
(source)
白首乌新苷 F
(cynanauri-
culoside F)
白首乌新苷 G
(cynanauri-
culoside G)
白首乌新苷 H
(cynanauri-
culoside H)
1 都匀(Duyun)1 0． 12 0． 18 0． 63
2 都匀(Duyun)2 0． 21 0． 12 0． 41
3 贵阳(Guiyang) 0． 05 0． 03 0． 23
4 凯里(Kaili) 0． 08 0． 15 0． 47
5 剑河(Jianhe) 0． 05 0． 01 0． 29
6 雷山(Leishan) 0． 03 0． 08 0． 11
7 独山(Dushan) 0． 12 0． 02 0． 05
8 龙里(Longli) 未检测到
(undetected)
未检测到
(undetected)
0． 10
9 三都(Sandu) 0． 02 0． 01 0． 22
10 黔西(Qianxi) 0． 02 未检测到
(undetected)
0． 08
是该属药用植物的主要活性成分。该类成分结构复
杂，同种植物中所含的该类成分，苷元结构变化不
大，不同化合物间的结构差异，主要体现在糖链部分
—7251—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32(9)
的糖基的组成和连接位置的不同等微小变化。这就
导致了同种植物中，该类化合物的分离纯化难度大，
标准物质难以得到，药用植物的质量标准难以建立。
普通的 HPLC方法很难把 C21甾体酯苷中的主要峰
与相邻峰分离开，通过 UPLC的方法，经梯度洗脱的
方式，使用较长的 UPLC 色谱柱(2． 1 mm × 100
mm) ，才能够将隔山消中 3 个主要的 C21甾体酯苷白
首乌新苷 F、G 和 H 分离出来，通过 PDA 检测器中
显示的紫外光谱图，与对照品对应的紫外光谱图一
致，表明为单一色谱峰。同时，与相近的色谱峰之间
具有较好的分离度，能用于定量测定。
药材提取方法，分别采用了加热回流提取和超声
波提取的方法，经 TLC 初步比较以及含量测定过程
中发现两者未表现出显著的差异，考虑到超声波方法
简便易于操作，所以选此方法作为提取方法。提取溶
剂可选择甲醇，也可以选择乙醇。由于干燥隔山消药
材块茎含有较多的淀粉，为使溶剂能够有效浸入其
中，提取溶剂需要含有一定量的水分。实验中采用了
80%的甲醇溶液，能有效地溶解并提取出待测组分。
由于待测的新白首乌苷 F、G、H 3 个化合物分
子结构的苷元部分中均含有 2 个共轭的不饱和双
键，故可采用紫外光检测器进行测定，经筛选吸收波
长，选择在 220 nm波长处检测，可以得到较为理想
的吸收灵敏度，同时，溶剂的影响也可以消除。
在选择流动相时，由于 3 个 C21甾体酯苷的极性
较小，用甲醇 －水等常用体系不能得到理想的分离效
果，采用了洗脱能力更强的乙腈作为有机相，并采用
梯度洗脱的方法，才能有效地对待测组分进行分离。
本文建立了 UPLC 同时测定隔山消中 3 个 C21
甾体酯苷白首乌新苷 F、G和 H的方法，线性范围较
宽，分离速度较快，分离效率高，重复性好，提取方法
简便，方法加样回收率高。
对隔山消药材的测量结果显示，隔山消因产地的
不同，其中白首乌新苷 F、G和 H的含量也有差异。
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(本文于 2012 年 4 月 9 日修改回)
—8251— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012，32(9)