全 文 ：Bioinformatics analysis of ADP-ribosylation factor（ARF）gene
from Dioscorea alata L.
GAOHong-chang，HUANGXiao-long，CHENYin-hua，XUYun，WUWen-qiang，
XIEJun，HUANGDong-yi*
（College of Agronomy，Hainan University，Haikou，570228，China）
Abstract：【Objective】The bioinformatics analysis of 11 plants including Dioscorea alata L. was conducted to provide
references for further research on structure and function of plant ARF gene. 【Method】The cloning and sequence analysis of
homologous fragments of ARF gene from Dioscorea alata L. were performed and predicted by the tools of bioinformatics in
the following aspects: the composition of nucleotide sequences， amino acid sequences， components， hydrophobicity or hy-
drophily， secondary and tertiary structure of protein， signal peptide， transmembrane structure and leader peptide. 【Re-
sult】The homologous fragment of ARF gene from Dioscorea alata L. was 1200 bp. Phylogenetic analysis showed that ARF
amino acid sequence of the 11 plants was classified into two classes，Ⅰand Ⅱ， which included five subtribes of A， B，
C， D and E. Dioscorea alata L. ARF 1 and Medicago truncatula formed a subtribe. Dioscorea alata L. ARF 2 and Hy-
acinthus orientalis was a subtribe. GTP/Mg2+ binding site， G2 and G3 conservative domain existed in the amino acid se-
quence of Dioscorea alata L. ARF. There was the same effector domain Switch 1 and Switch 2. The structure of ARF pro-
tein from Dioscorea alata L. was mainly random coil. Its third-level structure was not steady. ARF protein was fat soluble
protein with hydrophobicity and obvious membrane spaning domain， but there was no signal peptide. The targeting se-
quence of ARF gene had no definite position， which was predicted to be at level three. 【Conclusion】The particularity of
ARF protein from Dioscorea alata L. could serve as a foundation for material transport and involvement in signal transduc-
tion functions.
Key words： Dioscorea alata L.； ADP-ribosylation factor（ARF）； bioinformatics； cluster analysis； protein structure
收稿日期：2013-03-18
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金项目（20114601110001）；海南省自然科学基金项目（310024）
作者简介：*为通讯作者，黄东益（1969-），教授，主要从事能源植物遗传育种及薯蓣植物开发利用研究工作，E-mail：hdongyi@126.
com。高洪昌（1986-），研究方向为能源植物种质创新与利用，E-mail：gaohongchangg@163.com
0 引言
【研究意义】参薯（Dioscorea alata L.）是薯蓣科薯
蓣属缠绕性藤本植物。参薯淀粉含量高，特别因富含
花青素深受人们的喜爱。花青素具有延缓衰老，抗氧
化、抗肿瘤、防治心脑血管疾病、降血糖、抗炎、促进视
力等多种药理作用，已受到国内外医药和食品界的广
参薯ADP-ribosylation factor（ARF）基因的
生物信息学分析
高洪昌，黄小龙，陈银华，许 云，吴文嫱，谢 俊，黄东益*
（海南大学农学院，海口 570228）
摘要：【目的】对参薯等11种植物的ARF基因进行生物信息学分析，为深入研究植物ARF基因的结构与功能分析
奠定基础。【方法】对参薯ARF同源序列进行克隆和序列测定，利用生物信息学相关软件对参薯等11种植物的ARF的
核苷酸序列、氨基酸序列、组成成分、疏水性/亲水性、蛋白质二级和三级结构、信号肽、跨膜结构、导肽进行分析。【结
果】参薯ARF基因同源片段大小为1200 bp。系统进化分析结果表明，参薯等11种植物的ARF氨基酸序列可分为Ⅰ和
Ⅱ两大类，细分A、B、C、D、E 5个亚族，其中参薯ARF1和蒺藜苜蓿组成一个亚族，参薯ARF2和风信子组成一个亚族。
参薯ARF的氨基酸序列中存在GTP/Mg2+结合位点和G2、G3保守区域，具有两个相同的效应结构域Switch1和
Switch2。参薯ARF蛋白结构以无规则卷曲为主，三级空间结构不稳定。ARF蛋白为疏水性、脂溶性蛋白，无信号肽，存
在明显跨膜结构域；ARF导肽无明确定位，预测等级为3级。【结论】参薯ARF蛋白结构的特殊性为其执行物质转运和
参与信号转导功能奠定基础。
关键词：参薯；ARF基因；生物信息学；聚类分析；蛋白结构
中图分类号：S567.239 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2013）07-1069-07
DOI：10.3969/j：issn.2095-1191.2013.7.1069
南方农业学报 JOURNAL OF SOUTHERN AGRICULTURE 2013，44（7）：1069-1075
ISSN 2095-1191；CODEN NNXAAB http：//www.nfnyxb.cn
南 方 农 业 学 报
泛重视。ADP-糖基化因子（ADP-ribosylation factor，
ARF）是小G蛋白Ras超级家族中亚族的一个成员，
ARF最初是在研究霍乱毒素的作用机理时发现，霍乱
毒素通过其A1亚基催化NAD+的ADP-核糖单位结合
到G蛋白的一个氨基酸残基上，使其只能与GTP结合
而不能催化GTP水解，从而使细胞质中cAMP的含量
增加，导致膜蛋白让大量水分进入肠腔，引起腹泻
（Schleifer et al.，1982）。随后发现ARF在内质网与高
尔基体之间的小胞运输，对维持高尔基体和内质网结
构以及在溶酶体与液泡之间运输起重要的作用
（Takeuchi et al.，2002；Lee et al.，2002；Pimpl et al.，
2003）。【前人研究进展】目前，关于ARF基因的生物学
功能一直是国内外研究的热点。ARF具有结合cGMP
等第二信使作用，可以调节花青素合成等相关基因的
表达（Bowler et al.，1994）。将马铃薯的反义ARF转入
马铃薯导致其根系的退化，证明该基因在植物根中具
有重要的作用（Wilczynski et al.，1997）。在拟南芥中，
ARF基因参与植物激素运输及多种激素信号的转导
（Chen and Masson，2005；Gebbie et al.，2005；Xu and
Scheres，2005）。此外，ARF基因存在组织表达的特异
性，在植物根中的表达量高于其他组织（Kobayashi-
Uehara et al.，2001；侯磊等，2007）。【本研究切入点】
近年来，对参薯块茎物质积累研究取得较多的成果，
这些成果不但丰富了参薯块茎物质积累生理生化方
面的研究，并且逐渐向参薯块茎物质积累的分子生物
学方面扩展，但对参薯的核糖基化因子的研究尚未见
报道（周生茂，2009）。【拟解决的关键问题】对参薯的
ARF同源序列进行克隆，利用生物信息学对参薯等11
种植物的ARF核酸及氨基酸序列进行比对，分析、预
测其理化性质、结构与功能，为后续研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1试验材料
供试材料为参薯164（Dioscorea alata L.‘164’），
采自海南大学农学院薯蓣种质资源圃。
数据资料来源于NCBI（National Center for Bio-
technology Information，http：//www. ncbi. nlm.nih.gov/）
的核酸及蛋白质数据库中已注册的10种植物的ARF
基因核酸序列及其对应的氨基酸序列：甘蓝型油菜
（Brassica napus L.）（EU595666）、水稻（Oryza glaberri-
ma L.）（ABR25719）、棉花（Gossypium spp.）（AJ21017）、
拟南芥（Arabidopsis thaliana）（NP-172533）、蓖麻（Rici-
nus communis）（XP002521452）、玉米（Zea mays）（NP00
1105897）、香蕉（Musa paradisiaca）（ACM67553）、烟草
（Nicotiana tabacum）（ABF74733）、风信子（Hyacinthus
orientalis L.）（AAT08648）、蒺藜苜蓿（Medicago trun-
catula）（XP003618207）。
1. 2试验方法
1. 2. 1 材料的培养 采集参薯的带节茎端以0.1%
HgCl2消毒8 min，无菌水冲洗5次，75%酒精消毒30 s；
无菌水冲洗3次，取1 cm左右的带节茎段接种于MS培
养基中，于光照强度为2500 lx、光照周期14 h、26℃条
件下培养两个月，获得参薯无菌苗。
1. 2. 2 参薯ARF基因的克隆 采用改良CTAB-LiCl
方法提取经组培获得的参薯无菌苗叶片的总RNA（覃
芳等，2009），采用Thermo Scientific RecertAid First
Strand cDNA Synthesis Kit# 1621合成 cDNA。根据
NCBI的已知物种的ARF基因的同源序列设计引物F：
5′-GAAGGATCCATGGTGACTACTAT-3′和R：5′-GC
GCTCGAGCACACAACAACACTG- 3 ′。PCR扩增程
序为：94℃预变性3 min；94℃ 45 s，56℃ 50 s，72℃ 2
min，进行35个循环；72℃延伸10 min，最后4℃保存。
扩增产物与pMD19-T载体连接，经转化克隆后，对重
组克隆进行PCR鉴定，阳性克隆送至南京金瑞斯生物
技术有限公司测序。
1. 2. 3 ARF的生物信息学分析 利用MEGA 5.0中
邻接树法构建系统发育树，进行系统进化分析；利用
ProtScale在线工具对ARF的氨基酸序列的疏水性/亲
水性进行预测；用ProParam在线工具对氨基酸的理化
性质进行分析；利用SOPM在线工具（Geourjion and
Deleage，1995）对ARF蛋白的二级结构进行预测与分
析；利用在线工具CPHmodels 3.2 Server（Nielsen et
al.，2010）对其ARF蛋白进行三级结构预测与分析；
利用在线工具TMHM 2.0（Petersen et al.，2011）对其
跨膜结构域进行预测与分析；利用SignalP 4.1 Server
（Petersen et al.，2011）对其信号肽进行预测与分析；
利用Target.P 1.1 Server（Olof et al.，2007）在线工具
对其导肽进行预测与分析。
2 结果与分析
2. 1参薯总RNA的提取及ARF基因同源片段的扩增
本研究采用改良的CTAB-LiCl方法提取参薯叶片
总RNA，如图1所示，扩增获得的28S、18S无明显降解，
可以满足后续研究的需要；利用F和R引物对提取的总
RNA反转录cDNA进行扩增，获得1200 bp左右的目的
条带（图2），将其回收连接转化后得到的阳性克隆进
行测序。
图 1 总RNA电泳检测结果
Fig.1 Gel electrophoresis detection of total RNA extracted
28S
18S
1070· ·
高洪昌等：参薯ADP-ribosylation factor（ARF）基因的生物信息学分析
图 2 反转录得到的cDNA的PCR扩增结果
Fig.2 PCR amplified results of cDNA by reverse transcription
M：Marker；1，2：引物F和R Primers F and R
2. 2系统进化分析与功能鉴定
使用MEGA 5.0软件对参薯及已知的其他植物
ARF氨基酸序列进行系统进化分析，由图3可以看出，
ARF可以分为Ⅰ和Ⅱ两大类，可以细分A、B、C、D、E 5
个亚族，其中甘蓝型油菜、水稻、棉花、拟南芥、蓖麻这
5种植物属于同一亚族；香蕉和烟草属于另一亚族，
参薯ARF1和蒺藜苜蓿组成一个亚族，参薯ARF2和风
信子组成一个亚族，而玉米独自成为一个亚族。前人
研究发现，棉花ARF基因也分为两大亚族（任茂智等，
2004；侯磊等，2007），与本研究结果相似。经BLAST
发现，在参薯ARF的氨基酸序列中存在GTP/Mg2+结合
位点和G2、G3保守区域，同时具有两个相同的效应结
构域Switch1和Switch2，这与人类Arf6具有结合GTP和
GDP功能的研究结果相同（Paspualato et al.，2001）。
图 3 不同植物ARF氨基酸序列的系统进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of ARF amino acid sequence in different species
2. 3参薯ARF蛋白的亲水性与疏水性分析与预测
以ProtScale在线工具对参薯ARF1氨基酸序列的
疏水性/亲水性进行预测，结果表明，该肽链第51位点
上的L疏水性最强，分值为2.311，而第125位点上的E
亲水性最强，分值为-3.144。整体而言，疏水性氨基酸
分布相对均一，且数量大于亲水性氨基酸，故推测参
薯的ARF1蛋白为疏水性，对其他物种及参薯ARF2的
氨基酸进行类似的分析，发现这些物种ARF蛋白也为
疏水性。
2. 4参薯ARF蛋白的理化性质
ProParam预测结果显示（表1），参薯ARF1蛋白编
码290个氨基酸，蛋白质的分子式为C1517H2294N410O417S21，
相对分子质量为33620.6 Da，理论等电点是8.87，不稳
定参数为41.19，大于40，属于不稳定蛋白质。理论半衰
期在2 min~1 h。ARF1蛋白中相对含量较多的氨基酸
是Leu（31，10.7%）与ser（30，10.3%）。总的带负电荷的
残基（Asp+Glu）为13；总的带正电荷的残基（Arg+Lys）
为23，蛋白质的亲水性平均数为-0.237，脂溶性指数
为81.97，为脂溶性蛋白。对其他植物的ARF及ARF2蛋
白进行类似分析，从表1可知，其他常见植物的ARF氨基
酸数目为181~335个，相对分子量在20000.0~337472.0 Da，
理论等电点在6.31~9.61，除了蒺藜苜蓿和参薯ARF1
为不稳定蛋白，其余均为稳定蛋白。
2. 5参薯ARF蛋白二级结构的预测与分析
利用在线软件SOPM对参薯ARF1蛋白质的氨基
酸进行分析，从图4可知，该蛋白二级结构有26.21%的
α-螺旋［Alpha helix（Hh）］、27.24%的延伸链［Extend-
ed strand（Ee）］、10.00%的β-转角［Beta turn（Tt）］、
36.55%的无规则卷曲［Random coil（Cc）］。纵观整个
蛋白质结构发现，参薯ARF1蛋白的二级结构主要由
无规则卷曲和延伸链及α-螺旋组成。对其他植物的
ARF及参薯ARF2的蛋白二级结构进行相似预测分析
后发现，ARF蛋白的二级结构主要由无规则卷曲和延
伸链及α-螺旋组成。
2. 6参薯ARF蛋白三级结构的预测与分析
利用在线工具CPHmodels 3.2 Server对参薯ARF1
氨基酸序列进行三级结构的预测，然后以Rasmol软件
进行编辑获得参薯ARF1三维结构模型。从结构模型
中发现（图5），无规则卷曲在参薯ARF1蛋白结构中占
主要地位。对其他植物ARF及参薯ARF2的氨基酸进行
相似预测分析后发现，ARF蛋白的三级结构以α-螺旋
结构占主导。
M 1 2
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
200 bp
100 bp
1200 bp
1071· ·
南 方 农 业 学 报
表 1 不同植物ARF蛋白氨基酸的组成成分及其理化性质分析
Tab.1 Amino acid composition and physicochemical character comparisons of ARF proteins in different plants
氨基酸数目（个） 分子量（Da） 理论等电点 不稳定指数（%） 亲水性总平均值
Amino acids number Molecular weight Theoretical isoelectric point Instability index Grand average hyd-rophobicity
拟南芥 Arabidopsis thaliana 181 20622.6 6.43 31.34 -0.193
蓖麻 Ricinus communis 181 20643.6 6.31 30.51 -0.209
风信子 Hyacinthus orientalis 199 22598.8 7.00 32.32 -0.230
甘蓝型油菜 Brassica napus L. 181 20578.6 6.43 30.40 -0.203
蒺藜苜蓿Medicago truncatula 248 28935.2 9.61 47.60 -0.477
棉花 Gossypium spp 181 20635.6 6.43 32.18 -0.220
水稻 Oryza glaberrima L. 181 20555.6 6.31 29.04 -0.141
香蕉Musa paradisiaca 181 20623.6 6.43 33.08 -0.222
烟草 Nicotiana tabacum 181 2.651.6 6.43 33.80 -0.291
玉米 Zea mays 181 20660.7 6.31 32.61 -0.207
参薯ARF1 Dioscorea alata L. 290 33620.6 8.87 41.19 -0.237
参薯ARF2 Dioscorea alata L. 335 37472.0 9.61 39.11 0.275
图 4 参薯ARF1、拟南芥ARF蛋白二级结构预测
Fig.4 Secondary structure analysis of protein of Dioscorea alata（ARF1）and Arabidopsis thaliana ARF
h：α-螺旋 Alpha helix；e：延伸连 Extended strand；t：β-转角 Beta turn；c：无规则卷曲 Random coil
A：参薯（Dioscorea alata L.）ARF1
B：拟南芥（Arabidopsis thaliana）
h e t c
图 5 参薯ARF1、拟南芥ARF蛋白三级结构预测
Fig.5 Predicted three-dimensional structure of protein in Dioscorea alata（ARF1）and Arabidopsis thaliana ARF
A：参薯（Dioscorea alata L.） B：拟南芥（Arabidopsis thaliana）
1072· ·
Ramachandran图是反映立体化学质量的参数，它可通
过分析Phi（φ）角和Psi（ψ）角的分布方式来大致评价所
预测的结构与自然结构的相同程度。现可利用蛋白质
三级结构评价软件 ANTHEPROT 3D构建其 Ra-
machandran图（Deléage，2012）。如预测二面角的>
90%位于核心区域，则表明其空间结构稳定（薛庆
中，2009）。由图6可知，参薯ARF的空间结构不稳定，
而拟南芥等其他植物的空间结构稳定。
图 6 拟南芥（A）和参薯（B和C）ARF蛋白的Ramachandran图
Fig.6 Ramachandran map of ARF protein in Arabidopsis thaliana（A）and Dioscorea alata L.（B，C）by ANTHEPROT 3D
A：拟南芥（Arabidopsis thaliana） B：参薯ARF1（Dioscorea alata L.） C：参薯ARF2（Dioscorea alata L.）
2. 7参薯ARF蛋白信号肽的预测与分析
信号肽一般位于蛋白质N 端，一般有16~26 个氨
基酸残基，包括疏水核心区、信号肽的C 端和N端等3
部分。利用在线工具SignalP 4.1 Server对参薯ARF1和
ARF2氨基酸序列的信号肽进行预测（图7），结果表
明，参薯ARF无信号肽。对其余几种植物氨基酸序列
的信号肽存在位置及其序列做相应的分析，也得到相
似的结果，可推测植物的ARF基因无信号肽。
2. 8参薯ARF蛋白的跨膜结构域的预测与分析
跨膜结构域常常是由跨膜蛋白的效应区域所展
现，一般由20个左右的疏水性氨基酸残基组成，主要
形成α-螺旋。利用在线工具TMHMM 2.0预测参薯
ARF1和ARF2的跨膜结构域，结果表明，其存在明显的
跨膜结构域，可以在胞膜之间来回穿梭。对其他物种
进行类似的分析，结果表明，其他植物ARF跨膜结
构主要存在细胞内，这与参薯ARF的结构预测完全
不同。
2. 9参薯ARF导肽的预测与分析
导肽是一段新合成肽链进入细胞器的识别序列。
通常带正电荷的碱性氨基酸含量较为丰富，如果它们
被不带电荷的氨基酸取代就起引导作用，说明这些氨
基酸对于蛋白质的定位具有重要作用（强毅，2007）。
利用在线工具Target.P 1.1 Server对参薯及其他物种
ARF基因进行导肽的预测与分析，可知参薯的导肽没
有明确定位，预测等级为3级，除了风信子外，其他植
物的导肽都明显定位在线粒体内膜上，预测等级为5
级（表2）。
3 讨论
近年来，小G蛋白的调控途径已成为许多学者研
究细胞信号转导过程的热点，其在基因表达、细胞骨
架重组装、微管的形成以及囊泡和核孔运输机制中，
起到分子开关的作用（王昕和种康，2005）。ARF尤其
在真核生物细胞膜的转运中起重要的作用（Chavrier
图 7 参薯ARF1氨基酸序列信号肽的预测
Fig.7 Predicted signal peptide of amino acid sequence in
Dioscorea alata L. ARF1
C值：原始剪切位点的分值；S值：信号肽的分值；Y值：综合剪切位点的
分值
C score：Primitive cleavage site score；S score：Signal peptide score；Y
sore：Synthetic splice site score
图 8 参薯ARF1跨膜区域的预测
Fig.8 Transmembrane domain prediction of ARF1 in Dioscorea
alata L.
高洪昌等：参薯ADP-ribosylation factor（ARF）基因的生物信息学分析 1073· ·
南 方 农 业 学 报
表 2 不同植物ARF基因的导肽的预测与分析
Tab.2 Prediction and analysis in leader peptide ARF gene a-
mong different plants
植物 Species cTP mTP Sp Other Loc RC
参薯（ARF1）Dioscorea alata L. 0.116 0.167 0.699 3
参薯(ARF2）Dioscorea alata L. 0.016 0.172 0.684 3
玉米 Zea mays 0.003 0.542 0.306 0.482 M 5
烟草 Nicotiana tabacum 0.004 0.567 0.299 0.430 M 5
香蕉Musa paradisiaca 0.003 0.542 0.306 0.482 M 5
水稻 Oryza glaberrima 0.003 0.600 0.275 0.422 M 5
拟南芥 Arabidopsis thaliana 0.003 0.515 0.378 0.382 M 5
棉花 Gossypium spp 0.003 0.515 0.378 0.382 M 5
蒺藜苜蓿Medicago truncatula 0.117 0.621 0.007 0.458 M 5
甘蓝型油菜 Brassica napus L. 0.003 0.559 0.285 0.440 M 5
风信子 Hyacinthus orientalis L 0.196 0.193 0.191 0.384 5
蓖麻 Ricinus communis 0.003 0.508 0.335 0.449 M 5
and Goud，1999），参与形成胞质溶性外被蛋白并将其
运输到囊胞出芽位点。运输囊泡的外被蛋白有3种类
型：COPⅠ、COPⅡ和笼形蛋白（Kirchhausen，2000），它
们的形成都与ARF家族密切相关，通常参与运输功能
的蛋白，与其结构的特殊性密不可分。
本研究首先利用简并引物对参薯ARF的基因进
行克隆和测序，利用生物信息学分析技术对参薯、拟
南芥、风信子、水稻、甘蓝型油菜、蓖麻、玉米、香蕉、烟
草、蒺藜苜蓿、棉花的部分ARF蛋白质的疏水性/亲水
性、理化性质和蛋白质二、三级结构、信号肽、跨膜结
构、导肽进行分析预测。由构建ARF的系统进化发育
树结果可知，该分类结果与经典生物分类存在差异。
在参薯ARF氨基酸序列中，存在GTP/Mg2+结合位点，
还有 G2、G3保守区域，其中G2是结合特异的鸟核苷
酸，G3与核酸基团相互作用；参薯ARF基因有两个效
应区，N末端有一个α-螺旋构成一个βαβ超二级结构
域，当GTP与ARF结合后，ARF-N末端的α-螺旋可以在
内质网膜内外穿梭，从而启动外被蛋白的装配与运输
（Huang et al.，2001；Lee et al.，2005），符合转运蛋白的
交替通路模型（Jardetzk，1966）。因ARF基因高度进化
保守，存在高度保守的结构和功能域，可能不适合作
为研究植物系统发育的对象，这与前人的研究结果相
驳（王磊等，2007），可能是因本研究仅采用邻接树法
构建系统发育树，今后还需采用最大自然法及最小进
化法构建系统发育树进行验证。本研究还发现，参薯
ARF基因与其他植物ARF基因存在较大差异，主要是
蛋白二级结构与其他作物不同，以无规则卷曲占主
导，由于无规则卷曲是构成酶的活性单位和其蛋白质
的特异的功能部位，它们经常受其侧链相互作用的影
响，从而造成其空间结构不稳定，出现明显地跨膜区
域。另外对参薯ARF蛋白的理化性质进行分析，发现
其Leu、Ser的含量最高，这两种氨基酸常是酶的活性
位点，参与酶活性的调节或直接参与酶促反应。
4 结论
本研究利用目前已知参薯ARF基因的序列设计
引物，扩增其全长，通过对参薯和其他物种ARF蛋白
的组成成分、结构和功能进行预测，发现参薯ARF蛋
白结构具有一定的特殊性，为其执行物质转运和参与
信号转导功能奠定基础。
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（责任编辑 韦莉萍）
高洪昌等：参薯ADP-ribosylation factor（ARF）基因的生物信息学分析 1075· ·