全 文 ：收稿日期:2015-09-14
基金项目:国家自然科学基金(81102858);黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划(UNPYSCT-2015070);中国博士后基金项
目(2013M531061) ;黑龙江省青年基金项目(QC2011C050);黑龙江省博士后资助项目(LBH-Z11102);黑龙江省教育厅科技项目(12531155) ;
哈尔滨商业大学研究生创新科研项目(YJSCX2015-359HSD)
作者简介:曲中原(1980-)，女，博士，副教授，主要从事抗肿瘤天然药物研究;Tel:0451-84865483，E-mail:qiuqiuqu@ 163. com。
* 通讯作者:邹翔，Tel:13945156518，E-mail:zou8663202@ 163. com。
虎眼万年青总皂苷诱导肝癌 HepG-2 细胞凋亡的机制研究
曲中原1，石 鑫1，邹 翔2* ，季宇彬3
(哈尔滨商业大学 1. 药学院;2. 药物研究所博士后科研工作站;3. 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究
中心，黑龙江 哈尔滨 150076)
摘要 目的:探讨虎眼万年青总皂苷诱导人肝癌 HepG-2 细胞凋亡的机制。方法:MTT法检测虎眼万年青总皂
苷对 HepG-2 细胞增殖的影响;倒置显微镜观察细胞形态;流式细胞仪测定细胞凋亡率、细胞线粒体膜电位和 Cyt-C
蛋白表达水平;透射电镜观察细胞超微结构的改变;酶标仪检测细胞内 Caspase-3 活性。结果:虎眼万年青总皂苷
对 HepG-2 细胞增殖有抑制作用，IC50为(79. 80 ± 0. 18)μg /mL;虎眼万年青总皂苷作用细胞后，倒置显微镜下可见
细胞变圆，折光性减弱，悬浮细胞增多;透射电镜下可见细胞出现典型的凋亡特征;随着虎眼万年青总皂苷浓度的
增加，细胞凋亡率、细胞内 Cyt-C表达水平及 Caspase-3 的活性均显著升高，细胞线粒体膜电位显著降低(P ＜ 0. 05
或 P ＜ 0. 01)。结论:虎眼万年青总皂苷可显著抑制人肝癌 HepG-2 细胞的增殖，并可通过启动线粒体途径诱导
HepG-2 细胞发生凋亡。
关键词 虎眼万年青;总皂苷;人肝癌 HepG-2 细胞;凋亡;机制
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2016)04-0867-05
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2016. 04. 041
Study on the Apoptotic Mechanisms of Human Liver Cancer HepG-2 Cells
Induced by Total Saponins of Ornithogalum caudatum
QU Zhong-yuan1，SHI Xin1，ZOU Xiang2，JI Yu-bin3
(1. College of Pharmacy;2. Post Doctoral Ｒesearch Center of Material Medica;3. Engineering Ｒesearch Center of Natural Anticancer
Drugs，Ministry of Education，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China)
Abstract Objective:To investigate the mechanism of human liver cancer HepG-2 cells apoptosis induced by total saponins of Or-
nithogalum caudatum(OCA-TS). Methods:The anti-proliferative effects of OCA-TS on HepG-2 cells was detected by MTT assay;the in-
verted microscope was used to observe cell morphology;transmission electron microscope(TEM)was used to observe the cellular ultra-
structure changes;flow cytometry method was used to detect the apoptosis rate，mitochondrial membrane potential，and protein expression
level of Cyt-C;Caspase-3 activity was measured by ELISA. Ｒesults:OCA-TS can inhibit the proliferation of HepG-2 cells and the IC50
was 79. 80 ± 0. 18 μg /mL. After treated by OCA-TS，cells became round，and the refractivity of cells receded，the number of suspension
cells increased. By TEM method，the cells presented typical apoptosis characteristics. With the increasing of concentration of OCA-TS，
cell apoptosis rate，the protein expression level of Cyt-C and the activity of Caspase-3 were increased markedly(P ＜ 0. 05 or P ＜ 0. 01)．
Conclusion:OCA-TS can effectively inhibit the proliferation of human liver cancer HepG-2 cells by inducing apoptosis of HepG-2 cells
through mitochondrial pathway.
Key words Ornithogalum caudatum Jacq.;Total saponins;Human liver cancer HepG-2 cells;Apoptosis;Mechanism
虎眼万年青是百合科多年生草本植物虎眼万年
青 Ornithogalum caudatum Jacq. 的干燥全草，原产于
非洲南部，后由朝鲜传入我国，目前我国各地广泛栽
培〔1〕。以虎眼万年青为君药的复方万年青胶囊具
有解毒化瘀、扶正固本的功效，适用于肺癌、肝癌、胃
癌的治疗，其主要成分为虎眼万年青皂苷类成分。
开发新型毒副作用小且活性高的天然抗肿瘤药
物对于癌症的治疗具有重大意义。总皂苷是虎眼万
年青的抗肿瘤主要药效部位，但因工艺复杂、费用昂
贵等原因，以往对虎眼万年青提取物的研究较多，而
针对其总皂苷抗肿瘤作用及机制的研究较少〔2〕。
笔者前期建立了虎眼万年青总皂苷提取、正丁醇部
分大孔树脂分离纯化的最佳制备工艺，制备的虎眼
万年青总皂苷质量分数达 55%左右。本研究在此
基础上考察虎眼万年青总皂苷对人肝癌 HepG-2 细
胞增殖和凋亡的影响，并从线粒体途径初步探讨其
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抗肿瘤的可能机制，为今后开发以虎眼万年青总皂
苷为主要成分的抗肿瘤药物提供实验依据。
1 材料与仪器
1. 1 细胞株 人肝癌细胞株(HepG-2)，由哈尔滨
商业大学生命科学与环境科学研究中心提供。
1. 2 药物与试剂 虎眼万年青药材购自吉林省长
白朝鲜族自治县长白山中药研究所，经哈尔滨商业
大学药学院张德连副教授鉴定为虎眼万年青 Orni-
thogalum caudatum Jacq. 的干燥全草，经乙醇提取、
正丁醇萃取、AB8 大孔树脂纯化，30% ～70%乙醇洗
脱部位为虎眼万年青总皂苷，质量分数 55%;注射
用羟基喜树碱(HCPT)，黄石飞云制药有限公司;胎
牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司;ＲPMI-
1640 培养液，美国 Gibco 公司;胰蛋白酶、溴化四氮
唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、PI、Ｒhodanine
123，美国 Sigma 公司;鼠抗人 Cyt-c 一抗、FITC 标记
马抗小鼠 IgG(H + L)，中杉金桥生物技术有限公
司;4%多聚甲醛，武汉博士德生物工程有限公司;
TritonX-100，上海华舜生物工程有限公司;BSA，Bio-
Vision公司;Caspase-3 活性检测试剂盒，上海碧云天
公司。
1. 3 主要仪器 FW100 型高速万能粉碎机(天津
市泰斯特仪器有限公司);HH-2 型数显恒温水浴锅
(江苏荣华仪器制造有限公司);DL-CJ-1N超净工作
台(北京东联哈尔仪器制造有限公司);CO-150 CO2
培养箱(美国 NBS公司);CKX 41 倒置显微镜(日本
OLYMPUS公司);标准型 PB-10 pH计(德国 Sartori-
us公司);Model680 酶标仪(美国 Bio Ｒad 公司);
Anke TDL-80-2C 离心机(上海安亭科学仪器厂);
BPICS XL-MCL 流式细胞仪(美国 Beckman Coul-
ter)。
2 方法
2. 1 细胞培养 将细胞复苏后，取对数生长期的
HepG-2 细胞，分别用 PBS洗 3 次，胰酶消化，置于倒
置显微镜下观察，当 80%以上的细胞变圆且间隙变
大时，倒掉胰酶，加入 3 mL 含 10%胎牛血清 ＲPMI-
1640 培养液，将细胞从培养瓶壁上轻轻吹下，并混
合均匀，将适量的细胞悬液转移到新的培养瓶中，再
加入 MPI 1640 培养基，在 5% CO2、37 ℃培养箱中
培养。
2. 2 MTT法检测细胞增殖抑制作用 取对数生长
期的人肝癌 HepG-2 细胞，胰酶消化后，调整细胞密
度为 5 × 104 /mL，以 100 μL /孔接种于 96 孔板中，于
CO2 培养箱中培养 24 h 后，每孔加 100 μL 虎眼万
年青总皂苷，使其终浓度为 12. 5、25、50、100、200、
400 μg /mL，空白对照组加等体积培养液，阳性对照
组加入 HCPT，终浓度为 21 μg /mL，每组设 6 个平行
孔。将 96 孔板放入恒温培养箱中培养 72 h，弃上清
后，加入 0. 5 mg /mL MTT 溶液 100 μL，于培养箱中
继续孵育 2 ～ 4 h，弃上清，每孔加入 150 μL DMSO，
用酶标仪在检测波长 490 nm 处检测光密度 D(λ)
值，并计算增殖抑制率。
细胞抑制率% =
D(λ)空白对照组 － D(λ)给药组
D(λ)空白对照组
× 100%
2. 3 倒置显微镜观察细胞形态 取对数生长期的
HepG-2 细胞，胰酶消化后，制备密度为 3 × 104 /mL
的细胞悬液，接种于 6 孔板中，细胞培养 24 h 后给
药，使虎眼万年青总皂苷终浓度为 20、40、80 μg /
mL，空白对照组加等体积培养液，阳性对照组加入
HCPT(终浓度为 21 μg /mL)，每组设 3 个平行孔。
将 6 孔板置培养箱中培养 48 h，倒置显微镜下观察
细胞形态。
2. 4 流式细胞仪(FCM)测定凋亡率 取对数生长
期的 HepG-2 细胞，胰酶消化后，制备密度为 3 ×
105 /mL的细胞悬液，以 1 mL /孔接种于 6 孔培养
板，细胞培养 24 h 后给药，给药方法同“2. 3”项下，
将细胞置 CO2 培养箱中培养 48 h后收集细胞，离心
弃上清，加入预冷的 70%乙醇，于 4 ℃固定 24 h，离
心弃固定液，PBS洗 1 次，加入 PI染色液 800 μL 轻
轻吹匀，室温避光孵育 30 min，过滤，上流式细胞仪
检测细胞凋亡率。
2. 5 透射电镜观察细胞超微结构 取对数生长期
的 HepG-2 细胞，胰酶消化后，含 10%胎牛血清的
ＲPMI-1640 培养液稀释细胞，密度为 3 × 105 /mL，以
1 mL /孔接种于 6 孔板，细胞培养 24 h 后，每孔加 1
mL药液，使虎眼万年青总皂苷的终浓度为 40 μg /
mL，阳性药 HCPT终浓度为 21 μg /mL，空白对照组
加等体积 ＲPMI-1640 培养液。收集细胞后，立即用
2%戊二醛固定 24 h 以上，超薄切片，醋酸铀-柠檬
酸铅染色后，透射电镜下观察并摄影。
2. 6 FCM检测细胞线粒体膜电位 取对数生长期
的 HepG-2 细胞，胰酶消化后，以 3 × 105 /mL 接种于
6 孔板，置于 37 ℃、CO2 培养箱中培养，培养 24 h后
给药，每个浓度设 3 个平行孔，给药方法同“2. 3”项
下，培养 48 h 后，收集细胞，加入 500 μL Ｒhoda-
mine123，使其终浓度为 10 μg /mL。避光孵育 30
min，离心弃染料，PBS 洗 2 次后，PBS 重悬细胞，上
流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位。
2. 7 FCM检测细胞内 Cyt-C 蛋白水平 按“2. 6”
项下方法培养细胞和给药，收集细胞后，加 4 g /L 的
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多聚甲醛 2 mL固定 40 min;离心去固定液，用 PBS
洗 2 次;加 0. 1% TritonX-100 2 mL打孔 15 min，PBS
洗 2 次;加 1%BSA封闭 1 h，离心弃去封闭液，加入
小鼠抗人 Cyt-cⅠ抗，37 ℃孵育 1 h，PBS 洗 1 次，加
入 FITC标记马抗小鼠 IgG(H + L)Ⅱ抗，在室温避
光孵育 30 min，离心弃上清，PBS 重悬细胞，上流式
细胞仪检测。
2. 8 酶标仪检测 Caspase-3 活性 按照试剂盒说
明书操作，将 pNA 用稀释液(检测液 ∶ 裂解液 9 ∶ 1)
稀释为 0、10、20、50、100、200 μmol /L 6 个不同浓
度，接种于 96 孔板，每孔 100 μL，酶标仪 405 nm 处
检测光密度，建立 pNA标准曲线。不同浓度虎眼万
年青总皂苷作用 48 h后，收集细胞，加入裂解液，冰
浴裂解 15 min，重悬沉淀，冰浴裂解，4 ℃低温离心
机离心 15 min，将上清液小心的转移到冰盒上预冷
的离心管中，取 96 孔板，按照 Caspase-3 活性检测试
剂盒设计的反应体系加入反应试剂，再加入 Ac-
DEVD-pNA后混匀，37 ℃孵育 2 h 以上直至孔内液
体发生明显的变色，采用酶标仪在波长 405 nm处检
测光密度，进一步计算 Caspase-3 的活性。
2. 9 统计学处理 实验数据均采用 SPSS 15. 0 软
件进行统计分析，结果以 珋x ± s 表示，组间比较采用
单因素方差分析(One-way ANOVA)，多重比较采用
LSD方法。
3 结果
3. 1 虎眼万年青总皂苷对 HepG-2 细胞增殖的抑
制作用 结果如图 1 所示，虎眼万年青总皂苷作用
于HepG-2细胞72 h后，随着虎眼万年青总皂苷浓
度的升高，细胞的增殖抑制率均逐渐升高，其作用呈
一定的剂量依赖性。经计算，虎眼万年青总皂苷对
HepG-2 细胞的 IC50为(79. 80 ± 0. 18)μg /mL。
图 1 虎眼万年青总皂苷对人肝癌 HepG-2
细胞增殖的抑制作用
3. 2 虎眼万年青总皂苷对 HepG-2 细胞形态的影
响 结果如图 2 所示，空白对照组细胞生长紧密，形
态饱满且贴壁生长;20、40、80 μg /mL虎眼万年青总
皂苷作用于 HepG-2 细胞 48 h 后，贴壁细胞逐渐减
少，细胞逐渐变圆，折光性减弱，悬浮的细胞逐渐增
多。
3. 3 虎眼万年青总皂苷对 HepG-2 细胞凋亡的影
响 结果如图 3 所示，20、40、80 μg /mL虎眼万年青
总皂苷作用 HepG-2 细胞 48 h 后，各组细胞均出现
不同程度的凋亡，凋亡率分别为(5. 94 ± 0. 21)%、
(10. 52 ± 0. 69)%和(20. 08 ± 0. 07)%，HCPT 作用
HepG-2 细胞 48 h 后，细胞的凋亡率为(17. 04 ±
0. 90)%。与空白对照组比较，各给药组细胞凋亡
率均显著升高(P ＜ 0. 01)。
图 2 虎眼万年青总皂苷对人肝癌 HepG-2 细胞形态的影响(×400)
A. 空白对照组 B. 虎眼万年青总皂苷 20 μg /mL组 C. 虎眼万年青总皂苷 40 μg /mL组 D. 虎眼万年青总皂苷 80 μg /mL
组 E. HCPT组
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图 3 虎眼万年青总皂苷对 HepG-2 细胞凋亡的影响
A. 空白对照组 B. 虎眼万年青总皂苷 20 μg /mL组 C. 虎眼万年青总皂苷 40 μg /mL组 D. 虎眼万年青总皂苷 80 μg /mL
组 E. HCPT组
3. 4 虎眼万年青总皂苷对 HepG-2 细胞超微结构
的影响 结果如图 4 所示。空白对照组细胞结构清
晰，细胞器结构完整，细胞表面有明显的微绒毛突
起。40 μg /mL 虎眼万年青总皂苷作用 HepG-2 细
胞 48 h后，出现细胞微绒毛减少、细胞核内染色质
固缩、线粒体肿胀、胞浆中的空泡增多、凋亡小体形
成等典型的凋亡形态学特征。
图 4 虎眼万年青总皂苷对人肝癌 HepG-2
细胞超微结构的影响(×5000)
A. 空白对照组 B. 虎眼万年青总皂苷 40 μg /mL 组
C. HCPT组
3. 5 虎眼万年青总皂苷对 HepG-2 细胞线粒体膜
电位的影响 结果如图5所示，空白对照组细胞线
粒体跨膜电位为(60. 30 ± 1. 56)%。20、40、80 μg /
mL虎眼万年青总皂苷作用细胞 48 h 后，各组细胞
线粒体膜电位分别为(58. 67 ± 1. 21)%、(54. 90 ±
1. 36)%、(52. 00 ± 1. 46)%，呈一定的浓度依赖性。
HCPT作用 HepG-2 细胞 48 h后，细胞线粒体膜电位
降低为(52. 90 ± 1. 20)%，各给药组细胞线粒体膜
电位均显著低于空白对照组(P ＜ 0. 01)。
3. 6 虎眼万年青总皂苷对 HepG-2 细胞中 Cyt-C蛋
白表达的影响 结果如图 6 所示，空白对照组细胞
Cyt-C蛋白表达水平为(51. 10 ± 0. 36)%。20、40、
80 μg /mL虎眼万年青总皂苷作用细胞后，细胞内
Cyt-C表达水平分别为(56. 73 ± 1. 19)%、(76. 27 ±
1. 36)%、(79. 30 ± 1. 85)%，均显著高于空白对照
组(P ＜ 0. 01)。
3. 7 虎眼万年青总皂苷对 HepG-2 细胞内 Caspase-
3 活性的影响 结果如图 7 所示，20、40、80 μg /mL
虎眼万年青总皂苷作用 HepG-2 细胞 48 h 后，各给
药组细胞Caspase-3活性依次为(115. 56 ± 9. 68)%、
图 5 虎眼万年青总皂苷对 HepG-2 细胞线粒体膜电位的影响
A. 空白对照组 B. 虎眼万年青总皂苷 20 μg /mL组 C. 虎眼万年青总皂苷 40 μg /mL组 D. 虎眼万年青总皂苷 80 μg /mL
组 E. HCPT组
图 6 虎眼万年青总皂苷对 HepG-2 细胞中 Cyt-C蛋白表达的影响
A. 空白对照组 B. 虎眼万年青总皂苷 20 μg /mL组 C. 虎眼万年青总皂苷 40 μg /mL组 D. 虎眼万年青总皂苷 80 μg /mL
组 E. HCPT组
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图 7 虎眼万年青总皂苷对 HepG-2 细胞内
Caspase-3 活性的影响
A. 空白对照组 B. 虎眼万年青总皂苷 20 μg /mL 组 C.
虎眼万年青总皂苷 40 μg /mL组 D. 虎眼万年青总皂苷 80
μg /mL组 E. HCPT组
注:与空白对照组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
(154. 07 ± 11. 64)%和(216. 92 ± 14. 62)%，均显著
高于空白对照组(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)。
4 讨论
在长期肿瘤治疗过程中，人们发现用中药治疗
肿瘤的疗效突出，不仅能减轻临床不良反应症状，还
对防止肿瘤复发转移、增效减毒等有很好的效果。
虎眼万年青总皂苷是中药虎眼万年青中有明确抗肿
瘤作用的活性部位，对肝癌、乳腺癌、胃癌等都有很
好的疗效，对肿瘤细胞的细胞毒作用明显，能显著抑
制肿瘤细胞增殖，而对正常细胞的毒副作用很小，是
一种非常有前景的抗肿瘤天然药物有效部位。笔者
前期建立了虎眼万年青总皂苷的提取、分离纯化方
法，得到虎眼万年青总皂苷(含量为 55%)。本研究
在此基础上，研究虎眼万年青总皂苷抑制人肝癌
HepG-2 细胞增殖及诱导凋亡的作用及可能机制。
本研究结果显示虎眼万年青总皂苷对人肝癌
HepG-2 细胞有显著的增殖抑制作用，并存在一定的
浓度依赖性。倒置显微镜下可观察到，不同浓度虎
眼万年青总皂苷作用 HepG-2 细胞后，贴壁细胞逐
渐减少，细胞逐渐变圆，折光性减弱，悬浮细胞数量
逐渐增多。进一步采用流式细胞仪和 PI 单染法检
测细胞凋亡率，结果表明，20 ～ 80 μg /mL 虎眼万年
青总皂苷作用 HepG-2 细胞后，细胞凋亡率均显著
升高，表明虎眼万年青总皂苷可诱导人肝癌细胞的
凋亡。细胞凋亡是凋亡调控基因调控细胞主动死亡
的过程，具有明显的形态学特征变化〔3〕。电镜观察
也证实空白对照组细胞结构清晰，细胞器结构较完
整，细胞表面的微绒毛突起明显，而虎眼万年青总皂
苷作用后，HepG-2 细胞出现微绒毛减少、线粒体肿
胀、细胞核内染色质固缩、胞浆中的空泡增多等现
象，并形成凋亡小体。这一结果表明虎眼万年青总
皂苷对人肝癌 HepG-2 细胞的线粒体具有一定的影
响，这可能是虎眼万年青总皂苷诱导 HepG-2 细胞
凋亡的主要途径之一。
线粒体在细胞凋亡过程中起着中心调控作
用〔4〕。由线粒体内膜两侧电化学梯度形成的线粒
体膜电位是保障线粒体基本功能的前提条件，低线
粒体膜电位是细胞经线粒体途径凋亡不可逆转的标
志。本研究结果显示，虎眼万年青总皂苷作用后，
HepG-2 细胞线粒体膜电位较空白对照组显著降低，
说明虎眼万年青总皂苷可能是通过破坏线粒体发挥
凋亡诱导作用的。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族，
作为直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，在细胞
凋亡机制网络中占主导地位。Caspase-3 是 Caspase
家族中研究比较透彻的蛋白酶之一，是细胞凋亡的
主要执行者，一旦被激活，就会启动下游的级联反
应，使细胞发生凋亡〔5〕。本研究结果显示虎眼万年
青总皂苷作用后，HepG-2 细胞内 Caspase-3 活性显
著升高，证明细胞已经发生凋亡。
综上所述，虎眼万年青总皂苷可抑制人肝癌
HepG-2 细胞的增殖。其机制可能是通过降低
HepG-2 细胞的线粒体膜电位，进而促进 Cyt-C 向胞
浆的释放，最终激活 Caspase-3 的活性，通过线粒体
途径诱导 HepG-2 细胞发生凋亡。
参 考 文 献
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中南药学，2010，4(8):293-295.
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殖与凋亡的影响［J］． 时珍国医国药，2013，24(11):
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［3］吴喜利，张王刚，石兴民，等 . 青蒿素对大鼠肾小球系膜
细胞增殖、凋亡及 Caspase-3 活性的影响［J］． 中药材，
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