全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2016，28:404-408
文章编号:1001-6880(2016)3-0404-05
收稿日期:2015-10-12 接受日期:2015-12-23
基金项目:中国博士后科学基金(2013M321061) ;黑龙江省博士后
科研基金(LBH-Z11102) ;黑龙江省青年科学基金
(QC2011C050) ;黑龙江省教育厅科技研究项目
(12531155) ;黑龙江省普通本科高等学校青年创新人
才培养计划(UNPYSCT-2015070)
* 通讯作者 Tel:86-451-84866922;E-mail:zou8663202@ 163． com
虎眼万年青总皂苷的纯化及抗氧化活性研究
曲中原1，张逸乔1，邹 翔2，3* ，石 鑫1，方月妮3，刘 欣3，季宇彬2，3
1 哈尔滨商业大学药学院;2哈尔滨商业大学 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心;
3 哈尔滨商业大学 药物研究所博士后科研工作站，哈尔滨 150076
摘 要:对虎眼万年青总皂苷的纯化工艺及抗氧化活性进行研究。以比吸附量和比洗脱量为指标，筛选大孔树
脂型号，进一步优化工艺条件。结果表明，AB-8 型大孔树脂对虎眼万年青总皂苷具有良好的吸附和洗脱效果，
最佳纯化条件为药材量与树脂用量比不超过 7∶ 1，用水、30%乙醇除杂，70%乙醇洗脱，在此条件下得到的虎眼
万年青总皂苷纯度为 55． 18%。对纯化后虎眼万年青总皂苷的抗氧化活性进行研究，发现虎眼万年青总皂苷对
羟自由基、超氧自由基阴离子和 DPPH自由基的 IC50分别为 2． 43、2． 28 和 0． 05 mg /mL，具有良好的抗氧化活性。
关键词:虎眼万年青;总皂苷;大孔吸附树脂;纯化;抗氧化活性
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2016． 3． 015
Purification of Total Saponins from Ornithogalum caudatum
and its Antioxidant Activity
QU Zhong-yuan1，ZHANG Yi-qiao1，ZOU Xiang2，3* ，SHI Xin1，FANG Yue-ni3，LIU Xin3，JI Yu-bin2，3
1College of Pharmacy，Harbin University of Commerce;2Engineering Ｒesearch Center of
Natural Antineoplastic Drugs，Ministry of Education，Harbin University of Commrce;3Post Doctoral
Ｒesearch Center of Material Medica，Harbin University of Commrce，Harbin 150076，China
Abstract:The purification process of total saponins from Ornithogalum caudatum and their antioxidant activity were
studied． The adsorption and desorption rates of total saponins were selected as evaluation indexes，the types of macrore-
ticular resin was screened and the purification parameters were further optimized． The results showed that AB-8 macro-
porous resin was considered to have favorable adsorption and desorption rates on total saponins of O． caudatum (OCTS)．
The optimal purification conditions were as follows:the ratio of O． caudatum dosage to the amount of macroporous resin
did not exceed 7∶ 1;distilled water and 30% ethanol were used to clean the impurity，and 70% ethanol was selected to e-
lute total saponin． Under these conditions，the purity of OCTS obtained was 55． 18% ． Then，the antioxidant activity of pu-
rified OCTS was studied． The IC50 of OCTS on hydroxyl radical，superoxide anion radical and DPPH radical were 2． 43，
2． 28 and 0． 05 mg /mL，respectively． It suggested that OCTS had good antioxidant activity．
Key words:Ornithogalum caudatum;total saponins;macroreticular resin;purification;antioxidant activity
虎眼万年青(Ornithogalum caudatum Ait．)为百
合科虎眼万年青属多年生草本植物，原产于非洲南
部，在我国北方得到广泛栽培［1］。虎眼万年青具有
清热解毒、消坚散结功效，在民间主要用于消炎止
痛、消除火毒之症［2］，在治疗癌症，肝纤维化等方面
都有很好的疗效［3，4］。以虎眼万年青为君药的复方
万年青胶囊用于治疗肺癌、肝癌、胃癌疗效显著。近
年来对虎眼万年青的研究主要集中在抗肿瘤药效物
质基础研究，这些研究表明皂苷和多糖类物质是主
要的抗肿瘤成分［5-8］。目前报导虎眼万年青总皂苷
抗肿瘤作用的文献大多以乙醇提取后的正丁醇萃取
物或粗制皂苷为研究对象，纯度不确定，成分比较复
杂。为此，本文对虎眼万年青总皂苷的纯化工艺进
行优化，以期得到最佳的大孔树脂纯化工艺参数，获
得较高纯度的虎眼万年青总皂苷。此外，对虎眼万
年青总皂苷的抗氧化能力进行研究，为其作为药品、
保健品原药的开发提供依据。
1 材料与仪器
1． 1 实验材料
虎眼万年青药材(购自吉林省长白朝鲜族自治
县长白山中药研究所)经哈尔滨商业大学药学院张
德连副教授鉴定为虎眼万年青 Ornithogalum cauda-
tum Ait．的干燥全草。
大孔吸附树脂 AB-8、D101、HPD100、H103、
HPD826、NKA-9(沧州宝恩吸附材料有限公司) ;薯
蓣皂苷对照品、Vc(天津一方科技有限公司) ;羟自
由基测定试剂盒、超氧阴离子自由基试剂盒(南京
建成生物工程研究所) ;DPPH(天津市致远化学试
剂有限公司)。化学试剂均为国产分析纯。
1． 2 实验仪器
FW100 型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器
有限公司) ;KQ5200DB 型数控超声波清洗器(江苏
省昆山市超声仪器有限公司) ;T6 新世纪紫外可见
分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司) ;
BSA万分之一电子天平(北京赛多利斯科学仪器有
限公司) ;DGH-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海一
恒科学仪器有限公司) ;N-1000 型旋转蒸发仪(上海
爱朗仪器有限公司) ;LD4-2A 低速离心机(北京京
立离心机有限公司)等。
2 实验方法
2． 1 虎眼万年青粗皂苷样品的制备
将虎眼万年青全草粉碎(20 目) ，精确称量 250
g，采用 80%乙醇浓度回流提取 3 次，每次 4 h，料液
比为 1∶ 20 g /mL。提取液合并过滤，减压回收乙醇
至无醇味。加蒸馏水适量，经石油醚除杂，正丁醇萃
取，合并醇相，干燥得到浸膏。蒸馏水复溶后定容至
250 mL容量瓶，即得生药量为 1 g /mL，皂苷含量为 10．
65%。
2． 2 对照品溶液的制备
精密称取 2． 5 mg薯蓣皂苷标准品，置于 25 mL
容量瓶中。用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，备用。
2． 3 大孔树脂预处理
取大孔树脂适量，加入 5 倍量的 95%乙醇浸泡
24 h，装柱，用蒸馏水淋洗至流出液无醇味。然后
5%HCL洗涤至流出液 pH为 3 时，静置 2 h，蒸馏水
冲至流出液 pH至 7，再用 5%NaOH洗涤至流出液 pH
至 9，静置 2 h，蒸馏水淋洗至流出液 pH为 7，备用。
2． 4 虎眼万年青总皂苷定量测定
2． 4． 1 薯蓣皂苷标准曲线的绘制
精密量取薯蓣皂苷对照品溶液 0、0． 2、0． 4、
0. 6、0． 8、1． 0 mL 置具塞试管中，80 ℃水浴挥干甲
醇，然后分别向具塞试管内加入 5%香草醛-冰醋酸
溶液 0． 2 mL，高氯酸 0． 8 mL，充分摇匀后 60 ℃水浴
保温 15 min，取出后立即放入冰水中冷却，加 5 mL
冰醋酸稀释，在 454 nm处测吸光度(A)值。以对照
品的质量为横坐标，以 A 值为纵坐标，进行线性回
归，得回归方程为 Y = 4． 3467X-0． 0116 (r =
0. 9998) ，表明薯蓣皂苷在 0． 06 ～ 0． 18 mg范围内和
A值呈良好的线性关系。
2． 4． 2 方法学考察
精密度实验 ＲSD 为 0． 13%(n = 6) ，稳定性实
验 ＲSD 为 0． 14% (n = 6) ，重复性实验 ＲSD 为
0. 77%(n = 6) ;薯蓣皂苷平均回收率为 98． 42%，
ＲSD为 0． 83%(n = 6)［1］。
2． 4． 3 供试品总皂苷的含量测定
精密称取供试品溶液放入具塞试管中，其余步
骤同“2． 4． 1”项下，测定吸光度，根据标准曲线计算
虎眼万年青总皂苷的含量。
2． 5 筛选大孔树脂型号
取预处理好的大孔吸附树脂各 15 g(M 树) ，置
100 mL锥形瓶中，分别加入样品提取液各 50mL，测
定上样液中皂苷含量为 129． 43 mg(M 上) ，放入振
摇器中振荡 8 h 后，抽滤，收集滤液，测定滤液中皂
苷质量(M残)。然后将树脂装入层析柱(内径 1． 5
cm、高 20 cm)中，径高比 1∶ 9，用 3 BV蒸馏水除杂，
流速 2 BV /h，收集水液，测定皂苷质量(M水) ，再用
60%乙醇 100 mL 洗脱，流速 2 BV /h，收集洗脱液，
定容于 100 mL容量瓶中，测定皂苷质量(M 洗脱)。
精密量取 50 mL洗脱液减压回收乙醇并置浓缩液于
蒸发皿中干燥恒重，其重量的 2 倍为 M 干膏。计算
不同类型大孔吸附树脂对总皂苷的比吸附量(A，即
单位质量的干树脂吸附的总皂苷质量)和比洗脱量
(E，即单位质量的干树脂洗脱出的总皂苷质量)以
及总皂苷在干膏中所占比例即干膏纯度(W 纯度) ，
选择最优者。
A =(M上-M残-M水)/M树 = M吸 /M树
E = M洗脱 /M树
吸附率 = M吸 /M上
解吸率 = M洗脱 /M吸
2． 6 优化大孔吸附树脂纯化虎眼万年青总皂苷的
工艺
504Vol. 28 曲中原等:虎眼万年青总皂苷的纯化及抗氧化活性研究
2． 6． 1 药材量与树脂用量比例考察
首先绘制泄露曲线。取筛选好型号的大孔树脂
约 15 g装入层析柱中，另取样品提取液 100 mL 上
样，流速 2 BV /h，每 10 mL收集 1 份，共收集 10 份，
测定每管的皂苷含量，以皂苷质量为纵坐标，上样药
液体积为横坐标绘制泄漏曲线。
取 4 根相同型号的层析柱，用大孔树脂约 15 g
装柱。根据泄漏体积分别选取其附近 4 个不同体积
上样，计算药材量与树脂用量比，流速均为 2 BV /h。
上样后分别用 3 倍量蒸馏水洗脱，收集水洗液。检
测水洗液中总皂苷的含量，计算总皂苷的泄漏量和
泄漏率，得出最佳药材量与树脂用量比例。
2． 6． 2 洗脱剂浓度考察
取 4 根层析柱装柱，用大孔树脂 15 g 装柱，上
样量为 15 mL，流速 2 BV /h。吸附 12 h后先用 3 BV
蒸馏水除杂，再分别用 5 BV 10%、20%、30% 和
40%乙醇溶液洗脱，流速 2 BV /h，收集洗脱液，测定
各洗脱液中皂苷含量和干膏质量，计算皂苷纯度，确
定适宜的乙醇除杂浓度。另取 4 根层析柱，用大孔
树脂 15 g 装柱，上样量为 15 mL，流速 2 BV /h。吸
附 12 h后用 5 BV蒸馏水和已确定的低浓度乙醇除
杂，再分别用 60%、70%、80%和 95%乙醇进行洗
脱，流速 2 BV /h，收集洗脱液，回收乙醇，测定各洗
脱液中皂苷含量和干膏质量，计算皂苷纯度，确定乙
醇洗脱浓度。
2． 6． 3 验证试验
采用筛选的最佳型号的大孔树脂对虎眼万年青
粗皂苷样品按照上述最优条件进行纯化，测定树脂
纯化前、后的皂苷的含量。
2． 7 虎眼万年青总皂苷抗氧化活性研究
2． 7． 1 清除羟自由基、超氧阴离子自由基活性研究
虎眼万年青总皂苷分别配置成不同浓度的样
液，参照羟基自由基、超氧阴离子自由基试剂盒所标
明的操作方法进行实验。按式(1)计算样品对羟自
由基、超氧阴离子自由基的抑制率。以 Vc 为阳性
对照。
清除率(%)=(Ao-As)/Ao × 100% (1)
式中，Ao 是对照管吸光度;As 是测定管吸光
度。
2． 7． 2 清除 DPPH自由基活性研究
虎眼万年青总皂苷分别配置成不同浓度的样
液。取样品溶液 2 mL，加入 DPPH 乙醇溶液(0． 025
mg /mL)2 mL，混匀后静置 30 min，用紫外可见分光
光度计于 517 nm 处测定其吸光度值(As) ;取样品
溶液 2 mL，加入蒸馏水 2 mL，测定其吸光度值
(Ar) ;取 DPPH 乙醇溶液 2 mL，加入蒸馏水 2 mL，
测定其吸光度值(Ao)。按式(2)计算样品对 DPPH
的抑制率。以 Vc为阳性对照［9-10］。
抑制率(%)= 1-(As-Ar)/Ao × 100% (2)
3 实验结果
3． 1 优化大孔吸附树脂纯化虎眼万年青总皂苷的
实验结果
3． 1． 1 大孔吸附树脂型号筛选结果
通过对 6 种不同型号的大孔吸附树脂进行筛
选，实验结果如表 1。各种树脂对虎眼万年青总皂
苷均表现出良好的吸附性，其中 AB-8 型树脂对皂
苷的吸附率和解析率最高，因此选择 AB-8 树脂作
为纯化虎眼万年青总皂苷的树脂，进行深入研究。
3． 1． 2 泄漏曲线
实验结果如图 1，以皂苷泄露量为纵坐标，以上
表 1 不同型号大孔吸附树脂筛选结果
Table 1 Screening results of different types of macroporous adsorption resins
A (mg) E (mg) 吸附率Adsorption rate (%)
解析率
Desorption rate (%)
AB-8 6． 47 6． 15 74． 22 95． 02
D101 5． 38 4． 91 62． 32 91． 33
HPD100 6． 18 5． 16 71． 64 83． 47
H103 6． 06 5． 62 70． 21 92． 71
HPD826 5． 62 5． 21 65． 08 92． 81
NKA-9 5． 59 5． 04 64． 81 90． 15
604 天然产物研究与开发 Vol. 28
样药液体积为横坐标绘制泄漏曲线，结果见图 1。
上样 70 mL后开始明显泄露，至上样 90 mL时，树脂
达吸附饱和而完全泄露。
3． 1． 3 药材量与树脂用量比例考察结果
根据泄露体积选择上样量 65、70、75 和 80 mL，
即药材量与树脂用量比分别为 7 ∶ 1、7． 6 ∶ 1、8． 2 ∶ 1、
8． 7∶ 1。结果如表 2，可见药材量与树脂用量比 7． 6
∶ 1、8． 2∶ 1、8． 7∶ 1 时皂苷损失较大，因此药材量与树
脂用量比应不超过 7∶ 1。
14
12
10
8
6
4
2
0
0 20% 40% 60% 80 100%120
累计上样量
Accumulative%total%
sample%volume(mL)
皂
苷
泄
漏
量
Le
ak
ag
e%q
ua
nt
ity
%
of
%sa
po
ni
ns
(m
g)
图 1 虎眼万年青总皂苷泄露曲线
Fig. 1 Leakage curve of O． caudatum total saponin
表 2 药材量与树脂用量比例考察
Table 2 Proportion of medicinal materials and resins
药材量∶树脂量
Medicinal material∶
resin content (g∶ g)
上样体积
Sample
volume (mL)
皂苷质量
Saponins
quantity (mg)
泄漏量
Leakage
quantity (mg)
泄漏率
Leakage
rate (%)
7． 0∶ 1 65 106． 41 7． 95 7． 47
7． 6∶ 1 70 114． 6 16． 09 14． 07
8． 2∶ 1 75 122． 78 25． 96 21． 15
8． 7∶ 1 80 130． 97 35． 12 26． 88
3． 1． 4 洗脱剂浓度考察
乙醇除杂浓度选择结果见表 3，乙醇 30%浓度
以下洗脱下来的干膏质量较低杂质较多，40%乙醇
洗脱的皂苷质量明显增加，因此选择 30%乙醇为除
杂浓度。乙醇洗脱浓度选择结果见表 3。经蒸馏水
和 30%乙醇除杂后，70%乙醇洗脱下来的总皂苷纯
度最高，因此确定最佳洗脱溶剂为 70%乙醇。
表 3 乙醇除杂和洗脱浓度选择
Table 3 Selection of ethanol concentration for removing impurities and elution
乙醇浓度
Ethanol
concentration (%)
皂苷质
Saponins
quantity (mg)
干膏质量
Dry paste
quantity (g)
干膏纯度
Dry extract
purity (%)
10% 5． 40 0． 03 20． 78
20% 10． 36 0． 05 19． 11
30% 15． 71 0． 08 19． 31
40% 20． 25 0． 10 20． 23
60% 21． 32 0． 07 25． 36
70% 39． 25 0． 07 54． 98
80% 41． 01 0． 08 48． 77
95% 42． 15 0． 09 46． 78
3． 2 验证实验
按最佳工艺条件进行验证，选用 AB8 型大孔树
脂，上样液浓度 1 g /mL，上样量 15 mL，吸附 12 h 后
用 5 BV蒸馏水和 30%乙醇除杂，6 ～ 8 BV 70%乙醇
洗脱，经纯化虎眼万年青总皂苷的纯度由 10． 65%
提高到 55． 18%。
3． 3 虎眼万年青总皂苷抗氧化活性结果
虎眼万年青总皂苷对自由基的清除能力如图 2
～ 4 所示。虎眼万年青总皂苷能显著抑制羟自由
基、超氧自由基阴离子、DPPH自由基的产生，IC50分
别为 2． 43、2． 28、0． 05 mg /mL。
704Vol. 28 曲中原等:虎眼万年青总皂苷的纯化及抗氧化活性研究
虎眼万年青总皂苷70
60
50
40
30
20
10
0
0 0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 2.5% 3.0% 3.5
浓度
Concentration(mg/mL)
抗坏血酸 Vc
抑
制
率
In
hi
bi
tio
n%
ra
te
(%
)
图 2 虎眼万年青总皂苷和 Vc对羟自由基的抑制作用
Fig. 2 Inhibitory effects of O． caudatum saponins and Vc on
hydroxyl radical
虎眼万年青总皂苷80
70
60
50
40
30
20
10
00 0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 2.5% 3.0% 3.5
浓度
Concentration(mg/mL)
抗坏血酸 Vc
抑
制
率
In
hi
bi
tio
n%
ra
te
(%
)
图 3 虎眼万年青总皂苷和 Vc对超氧自由基阴离子的抑
制作用
Fig. 3 Inhibitory effects of O． caudatum saponins and Vc on
superoxide radical anion
虎眼万年青总皂苷80
70
60
50
40
30
20
10
00 0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 2.5% 3.0% 3.5
浓度
Concentration(mg/mL)
抗坏血酸 Vc
抑
制
率
In
hi
bi
tio
n%
ra
te
(%
)
图 4 虎眼万年青总皂苷和 Vc对 DPPH自由基的抑制作用
Fig. 4 Inhibitory effects of O． caudatum saponins and Vc on
DPPH free radical
4 结论
AB-8 型大孔树脂是一种比较理想的纯化虎眼
万年青总皂苷的树脂，最佳工艺条件:径高比 1 ∶ 9，
药材量与树脂用量比不超过 7 ∶ 1，5 BV 蒸馏水和
30%乙醇除杂，流速 2 BV /h，6 ～ 8 BV70%乙醇洗脱
皂苷，流速 2 BV /h，最终优选工艺得到的虎眼万年
青总皂苷纯度为 55． 18%。体外实验表明虎眼万年
青总皂苷对羟自由基、超氧自由基阴离子、DPPH自
由基的 IC50分别为 2． 43、2． 28、0． 05 mg /mL，具有较
好的抗氧化活性。本研究为虎眼万年青中皂苷类成
分的分离纯化奠定了基础，也为虎眼万年青总皂苷
有效部位的开发应用提供科学依据。
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