全 文 ：Ｒb and white adipose tissue-specific genes，induced PＲDM16 signal pathway and gene mＲNA expression of brown adipose tissue-specific
genes to induce browning of visceral white adipose tissues and improve fat-induced insulin resistance． Conclusion:The inductive effect of
berberine on browning of visceral white adipose tissues in type 2 diabetic hamsters was associated with the gene expression changes of P107 /
Ｒb and PＲDM16 signal pathway．
Key words berberine (黄连素) ;Type 2 diabetes;browning of visceral white adipose tissues;insulin resistance;P107
吉祥草中甾体皂苷 ＲCE- 4 激活 p53- ＲOS通路诱导
人肝癌 HepG2 细胞凋亡的机制研究*
杨小姣1，邹 坤1，尉小琴1，覃慧林1，颜为红1，张永峰1，贺海波1，2＊＊，汪鋆植1
(1 三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室 ＆湖北省土家医药研究所，宜昌 443002;
2三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，宜昌 443002)
摘 要 目的:研究吉祥草中甾体皂苷 ＲCE-4 对 HepG2 的抑制作用及分子机制。方法:用 ＲCE-4(1． 62、3． 13、6． 25、12． 5、25．
0、50． 0μM)处理 HepG2 细胞 24h后，采用 MTT 法检测不同浓度 ＲCE-4 对 HepG2 细胞增殖的影响;ＲCE-4(6． 25、12． 5 和 25． 0μM)分
别处理 HepG2 细胞 12、24 和 48h后，MTT 法检测其对细胞增殖的影响;ＲCE-4(6． 25、12． 5 和 25． 0μM)处理 HepG2 细胞 24h 后用
DCFH-DA 荧光探针标记进行细胞内的活性氧水平检测，Hoechst33258 染色观察细胞形态变化，Annexin V-FITC /PI染色测定细胞凋
亡率，PI标记测定细胞周期，JC-1 染色法测定细胞线粒体跨膜电位水平，Caspase 试剂盒检测 HepG2 细胞中 Caspase-9 和 Caspase-3
的活性，Western blot检测 Bcl-2、Bax 和 p53 蛋白表达，并计算 Bcl-2 与 Bax 的比值。结果:ＲCE-4 在 16． 2 ～ 50． 0μM 浓度范围内对
HepG2 细胞的生长抑制作用呈明显的时间-剂量依赖性，当药物浓度达到 12． 5μM时，抑制率达到最大到 54． 2%，并且经 IC50分析软
件进行计算其 IC50值为 12． 03μM;ＲCE-4(6． 25、12． 5 和 25． 0μM)处理 HepG2 细胞 12、24 和 48h 均能显著抑制 HepG2 细胞增殖，促
进其凋亡(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ;当药物浓度为 25． 0μM，作用时间 24h时，其抑制率高达 93． 4%。ＲCE-4(6． 25、1． 25 和 25． 0μM)处
理 HepG2 细胞 24h后可显著增加 HepG2 细胞内 ＲOS水平，抑制细胞凋亡，阻滞细胞周期于 G2 /M 期，降低线粒体膜电位，上调 Bax
和 p53 蛋白表达，下调 Bcl-2 蛋白表达和 Bcl-2 与 Bax 的比值，增强 Caspase-9 和 Caspase-3 的活性(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01)。结论:
ＲCE-4 可显著的抑制 HepG2 细胞增殖和诱导凋亡，其作用机制可能与其增加细胞内 ＲOS水平，促进 p53 及下游靶基因 Bax表达，增
强 Caspase-9 和 Caspase-3 活性，抑制 Bcl-2 表达，降低 Bcl-2 和 Bax比值及线粒体膜电位，阻滞细胞于 G2 /M期有关。
关键词 ＲCE-4;HepG2;细胞凋亡;活性氧;p53
吉祥草为为百合科吉祥草属植物 Ｒeineckia carnea (Andr．)
Kunth的干燥全草［1］，我们前期研究发现其乙酸乙酯部位和其
中甾体皂苷 ＲCE-4 均具有良好的人宫颈癌 Caski细胞增殖抑制
活性［2，3］，但未见有对人肝癌 HepG2 细胞的作用报道。本研究
通过提取甾体皂苷 ＲCE-4，体外细胞培养肝癌 HepG2 细胞，探
讨其对 HepG2 细胞的抑制作用，并从激活 p53-ＲOS 通路诱导
HepG2 细胞凋亡的作用机制。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 吉祥草根茎采自湖北省长阳县乐园乡，经三峡
大学生物技术中心王玉兵博士鉴定为百合科吉祥草 Ｒeineckia
carnea (Andr．)Kunth。植物标本现保存于三峡大学天然产物
研究与利用湖北省重点实验室(标本编号:20140725)。ＲCE-4
的制备方法见我们前期的研究报道［3］，使用时用 DMSO 配成
1mg /ml的储备液，经 0． 22 μm 滤膜过滤除菌后，用培养基配成
相应的浓度，备用;多柔比星，山西普德药业股份有限公司，使用
时用二甲基亚砜配成 250mg /ml储备液备用。
图 1 吉祥草中甾体皂苷 ＲCE-4 的化学结构
1． 2 细胞 人肝癌细胞 HepG2 由中国医学科学院基础医学研
究所基础医学细胞中心提供。
1． 3 试剂 ＲPMI-1640 培养基:美国 Gibco 公司;胎牛血清，杭
州四季青生物工程材料有限公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)、二
甲基亚砜(DMSO)，美国 Amresco公司;碘化丙啶(PI)、2＇-7＇-二氯
荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)和线粒体膜电位检测试剂盒(JC-
1)，美国 Sigma公司;Hoechst33258，碧云天生物技术研究所;An-
26 中药药理与临床 2016;32(2)
* 基金项目:国家自然科学基金(21272136) ，肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室开放基金(2015KZL03) ，三峡大学培优基金
(2014PY071) ＊＊通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2016.02.018
nexin V /FITC，深圳晶美生物工程有限公司;p53、Bcl-2、Bax 抗
体，美国 Santa Cruz 公司;β-actin 抗体，北京博奥森生物技术有
限公司;羊抗兔二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司;Caspase-
9 和 Caspase-3 活性检测、总蛋白抽提、ECL 发光和蛋白含量测
定试剂盒，碧云天生物技术研究所;其他试剂均为市售分析纯。
1． 4 仪器 3111 CO2 培养箱、Olympus KX41 型倒置显微镜，美
国 Thermo公司;GENios酶标仪，瑞士 Tecan公司;EPICS XL-4 流
式细胞仪，美国 Backman Coulter公司;NIKON TE2000 型荧光倒
置显微镜，上海横桥仪器有限公司;CDF-3220 多元定量 PCＲ
仪，美国 MJ Ｒesearch 公司;电泳仪，北京六一仪器厂;Gene Gen-
ius凝胶分析系统，英国 SYNGNE公司。
1． 5 方法 HepG2 细胞培养于含 10%新生小牛血清、100U /ml
青霉素、100μg /ml链霉素的 ＲPMI 1640 培养基(同时加人 2． 0g /
L HEPES、2． 0g /L NaHCO3)中，置于孵箱中 37℃、5% CO2 饱和
湿度下培养，待 HepG2 细胞贴壁生长，取对数生长期细胞用于
实验。
1． 5． 1 MTT法检测不同浓度 ＲCE-4 对 HepG2 细胞生长抑制率
的影响 取浓度为 1 × 105 个 /ml的细胞悬液接种于 96 孔板中，
每孔 100μl，于 5 % CO2饱和湿度，37 ℃的孵箱中培养，待细胞
贴壁后，更换培养液。将 ＲCE-4 配制成 6 个浓度梯度(1． 62、3．
13、6． 25、12． 5、25、50μM) ，每孔加入上述药液 100 μl，每个浓度
梯度设 5 个复孔，并设置空白孔(含细胞的培养液 + MTT + DM-
SO)、阳性药物孔(含细胞的培养液 +多柔比星 + MTT + DMSO)
及调零孔(培养液 + MTT + DMSO)。于 5% CO2 饱和湿度，
37℃的孵箱中培养 24h后加入 20μl MTT，继续培养 4h后，弃上
清，每孔加入 DMSO 150ml。置摇床上低速振荡 10 min后，用酶
标仪于 490 nm 处测量各孔的吸光度值(OD490nm)根据公式
［细胞抑制率 =(1-药物孔 OD值 /空白孔 OD值)× 100%］计算
细胞抑制率。
1． 5． 2 MTT法检测 ＲCE-4 不同作用时间对 HepG2 细胞生长抑
制率的影响 取浓度为 1 × 105 个 /ml 的细胞悬液接种于 96 孔
板中，每孔 100μl，于 5% CO2饱和湿度，37 ℃的孵箱中培养，待
细胞贴壁后，更换培养液。依据1． 5． 1 实验确定的最佳浓度
(6． 25、12． 5、25μM)进行 ＲCE-4 作用时间的(12、24、48h)的细
胞活性检测，具体方法同1． 5． 1 实验。
1． 5． 3 显微镜观察细胞形态 取浓度为 2 × 105 个 /ml 的细胞
接种于 24 孔板中，于 5 % CO2饱和湿度，37 ℃的孵箱中培养，
待细胞贴壁后，加入终浓度 ＲCE-4 (6． 25、12． 5、25μM)继续培
养 24h后，置于显微镜观察。
1． 5． 4 DCFH-DA 检测 HepG2 细胞内 ＲOS 水平 HepG2 细胞
用 ＲCE-4(6． 25、12． 5、25μM)处理 24h后，胰酶消化并制备细胞
悬液，用终浓度 10μmol /L的 DCFH-DA 37℃孵育 1h，用 PBS 清
洗 2 遍，流式细胞仪(激发光波长 488nm)检测，每个样品收集 1
× 104 个细胞，用 Cell Quest软件分析结果。
1． 5． 5 流式细胞仪检测细胞周期与凋亡 HepG2 细胞用
ＲCE-4(6． 25、12． 5、25μM)处理 24h后，加入 75%的冷无水乙醇
4℃固定 18h后用 PBS 洗 2 次，加入终浓度为 50mg / l 的 ＲNase
A，37℃孵育 30min，然后加入终浓度为 50mg / l的 PI，4℃闭光染
色 20min后流式细胞仪检测，用 Cell Quest 软件分析各组细胞的
周期分布，分析 G0 /G1 期 S 期和 G2 /M 期细胞所占比例;用流
式细胞仪进行 Annexin V-FITC /PI法测定细胞凋亡，根据 Annex-
in V和 PI的荧光强度计算凋亡百分率。
1． 5． 6 Hoechst33258 检测细胞凋亡形态 将 HepG2 细胞分别
用 ＲCE-4 (6． 25、12． 5、25μM) ，于 5 % CO2 饱和湿度，37℃的孵
箱中培养 24h后，收集细胞，用 PBS 冲洗 2 次，然后加入 1ml 的
4%的多聚甲醛 4℃固定 10min，晾干，每孔加入终浓度为 10mg / l
的 Hoechst33258 染液 100μl，室温避光染色 10min，水冲净晾干，
在荧光显微镜下(激发光波长 450nm，发射光波长 490nm)观察
凋亡细胞形态学变化。
1． 5． 7 JC-1 检测线粒体跨膜电位 将 HepG2 细胞分别用
ＲCE-4(6． 25、12． 5、25μM) ，于 5% CO2 饱和湿度，37℃的孵箱中
培养 24h 后，收集细胞，4℃，2500g 离心 5min，用 PBS 以洗涤 2
次，调节细胞浓度为 1 × 106 /ml，取 100μl 上述细胞，加入 JC-1
(1mg / l)10μl，37℃避光孵育 10 min，上机检测。
1． 5． 8 ELISA 法检测 Caspase 活性 将 HepG2 细胞分别用
ＲCE-4(6． 25、12． 5、25μM) ，于 5 % CO2 饱和湿度，37℃的孵箱
中培养 24h后，收集细胞，用 PBS 以洗涤 2 次，4 ℃，2500g 离心
5min，收集沉淀细胞加入 50 μl 冰冷的裂解缓冲液，反复吹打，
于冰浴中裂解 60 min，4℃，10000g离心 5min，吸取上清液至 EP
管中，进行 Caspase 活性检测，具体方法按照试剂盒说明书进
行。
1． 5． 9 Western Blot 检测 p53、Bcl-2、Bax 蛋白表达分析 将
HepG2 细胞分别用 ＲCE-4 (6． 25、12． 5、25μM) ，于 5% CO2 饱
和湿度，37 ℃的孵箱中培养 24h后，收集细胞，用蛋白提取试剂
盒提取 HepG2 细胞蛋白，进行蛋白定量后，加样品缓冲液煮沸
5min，各取 20μl加样;10%聚丙烯酰胺凝胶，在 120V、28mA 条
件下电泳 1． 5h;100mA条件下 PVDF膜转膜 2h;5%脱脂牛奶封
闭，滴加 p53 (1:400)、Bcl-2(1:500)、Bax(1:500)一抗，4℃过
夜;用含 0． 1% Tween 20 的 TBS冲洗 5min × 3 次，再加二抗(1:
1000)室温下孵育 2h，用 0． 1% TBST 冲洗 10min × 3 次，ECL 发
光检测，X光片显影，扫描图像，测得各条带的灰度值，以 β-actin
为内对照标准化后，比较其表达量的变化。
1． 6 统计分析 每项试验至少重复 3 次，所有实验结果的数
据以均数 ±标准差(x ± s)表示，数据分析在 SPSS13． 0 统计软件
包上进行，以单因素方差分析进行多组间差异的比较，以 Dun-
nett-t检验比较两组间均数的差异，P ＜ 0． 05 说明差异具有统计
学意义。
2 结果
2． 1 不同浓度 ＲCE-4 对 HepG2 细胞生长的影响 如图 2A 所
示，ＲCE-4(1． 62、3． 13、6． 25、12． 5、25、50μM)对 HepG2 细胞有
明显的抑制作用，且呈良好的剂量依赖关系，当 ＲCE-4 浓度为
12． 5μM时细胞抑制率达到最大为 54． 2%，经 IC50分析软件进
行计算其 IC50值为 12． 03μM，在后续实验中，分别用 6． 25、12． 5、
25． 0 μM的 ＲCE-4 进行实验。
36中药药理与临床 2016;32(2)
图 2 ＲCE-4 对 Caski细胞生长的影响
A:不同浓度的 ＲCE-4 作用 Caski细胞 24 小时后对其生长的影响;B:不同作用时间对 HepG2 细胞生长的影响(珋x ± s，n = 5)
与空白对照组相比较 * P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01;与同一浓度 ＲCE-4 作用 12h比较 △△ P ＜ 0． 01
2． 2 ＲCE-4 不同作用时间对 HepG2 细胞生长的影响 由图
2B可见:ＲCE-4(6． 25、12． 5、25． 0 μM)在作用 12、24、48h 后对
细胞生长均具有抑制作用，与空白对照组比较，差异具有显著
性;而且同一浓度的 ＲCE-4 对 HepG2 细胞的生长抑制率随作用
时间的延长而提高，与作用 12h时间比较，差异具有显著性。实
验表明 ＲCE-4 对 HepG2 细胞抑制作用呈明显的时间-剂量依赖
性。通过比较 24h和 48h对比分析，两者没有显著性差异，故在
后续实验中，我们选取 ＲCE-4 作用 HepG2 细胞 24h进行实验。
2． 3 ＲCE-4 对 HepG2 细胞形态的影响 由图 3 可见，空白对
照组 HepG2 细胞贴壁较牢固、密集，轮廓清楚，折光性好，胞质
饱满呈梭形或多边形;ＲCE-4(6． 25、12． 5、25μM)作用后，大部
分细胞体积变小、形态不规则、皱缩，失去贴壁特性，部分细胞细
胞膜破裂并有细小颗粒状物质释放，细胞密度降低，呈现出明
显的增殖抑制与细胞凋亡特征。
图 3 ＲCE-4 对 HepG2 细胞形态影响
A:空白对照;B:6． 25μM ＲCE-4;C:12． 5μM ＲCE-4;D:25． 0μM ＲCE-4
2． 4 ＲCE-4 对 HepG2 细胞内 ＲOS 的影响 经流式细胞仪检
测，HepG2 细胞内 ＲOS水平比较低，其平均荧光强度为 11． 54 ±
2． 63，ＲCE-4(6． 25、12． 5、25． 0 μM)作用后，平均荧光强度分别
升为:26． 12 ± 2． 85、38． 47 ± 3． 53 和 51． 46 ± 3． 12，与空白对照
组(平均荧光强度为 11． 54 ± 2． 63)比较具有显著性差异，实验
结果表明 ＲCE-4 能够诱导 ＲOS产生。
2． 5 ＲCE-4 对 HepG2 细胞凋亡的影响 由图 4 可见，ＲCE-4
(6． 25、12． 5、25． 0μM)作用后，出现了明显的细胞凋亡，而且随
着 ＲCE-4 剂量的增加，其凋亡率明显提高(19． 5 ± 3． 2、40． 4 ±
5． 7、62． 1 ± 6． 3)，与空白对照组(3． 0 ± 0． 8)比较具有显著性差
异，实验结果表明 ＲCE-4 能诱导 HepG2 细胞凋亡。
图 4 ＲCE-4 对 HepG2 细胞凋亡影响
A:空白对照;B:6． 25μM ＲCE-4;C:12． 5μM ＲCE-4;D:25． 0μM ＲCE-4
2． 6 ＲCE-4 对 HepG2 细胞周期的影响 流式细胞仪检测结果
显示 ＲCE-4(6． 25、12． 5、25． 0 μM)可使 G0 /G1 期细胞的比例减
少，S 期细胞的比例稳定，G2 /M 期比例明显增加，表明 ＲCE-4
对 HepG2 细胞周期有一定的影响，能够将 HepG-2 细胞阻滞
G2 /M期;细胞凋亡结果分析显示:ＲCE-4(6． 25、12． 5、25． 0
μM)对 HepG2 细胞有显著的凋亡诱导作用，与空白对照组比较
具有显著性差异，见图 5 上图、表 1。
46 中药药理与临床 2016;32(2)
图 5 ＲCE-4 对 HepG2 细胞的影响
上图:ＲCE-4 对 HepG2 细胞周期影响;下图:ＲCE-4 对 HepG2 细胞凋亡凋亡形态影响
A:空白对照;B:6． 25μM ＲCE-4;C:12． 5μM ＲCE-4;D:25． 0μM ＲCE-4
表 1 吉祥草中甾体皂苷 ＲCE-4 对 HepG2 细胞周期的影响(珋x ± s，
n = 5)
组别
剂量
(μM)
G0 /G1(%) S(%) G2 /M(%) 凋亡率(%)
空白对照 54． 4 ± 3． 2 25． 2 ± 3． 6 19． 5 ± 2． 5 3． 4 ± 0． 6
ＲCE-4 6． 25 48． 8 ± 3． 5* 24． 7 ± 2． 5 25． 9 ± 4． 2* 20． 7 ± 4． 9＊＊
12． 5 39． 7 ± 4． 9＊＊ 25． 4 ± 4． 9 34． 1 ± 4． 6＊＊ 41． 1 ± 4． 5＊＊
25． 0 21． 3 ± 3． 1＊＊ 14． 7 ± 3． 0＊＊ 63． 6 ± 3． 7＊＊ 65． 2 ± 5． 4＊＊
与空白对照相比 * P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01(下同)
2． 7 ＲCE-4 对 HepG2 细胞凋亡形态的影响 如图 6 所示，空
白对照组 HepG2 细胞经 Hoechst33258 染色后，荧光显微镜下可
见细胞膜完整、胞核圆形或椭圆形，核形态饱满，核质着色深，密
度均匀一致，折光性好;用 ＲCE-4(6． 25、12． 5、25． 0 μM)作用
24h后，可见细胞膜皱缩，表面粗糙，核变小，染色质浓集，荧光
增强，同时也可见凋亡小体的形成(白色箭头所示为凋亡小
体)，其中以 25． 0μM的 ＲCE-4 剂量组作用效果更为显著。
2． 8 ＲCE-4 对 HepG2 细胞线粒体膜电位的影响 由表 2 可
知，ＲCE-4 (6． 25、12． 5、25． 0 μM)可使线粒体膜电位分别下降
了 18． 7%、34． 6%和 50． 1%，且随着 ＲCE-4 给药浓度的升高而
增强，与空白对照组比较具有显著性差异。
表 2 ＲCE-4 对 HepG2 线粒体膜电位和 Caspase-9、Caspase-3 活性
的影响(珋x ± s，n = 5)
组别
剂量
(μM)
线粒体膜电位
(mV)
Caspase-3
(U /ml)
Caspase-9
(U /ml)
空白对照 153． 55 ± 18． 83 61． 10 ± 10． 35 65． 45 ± 10． 44
ＲCE-4 6． 25 124． 87 ± 16． 04* 82． 53 ± 11． 57* 94． 66 ± 10． 67＊＊
12． 5 100． 43 ± 19． 88＊＊ 96． 66 ± 9． 92＊＊ 112． 42 ± 13． 12＊＊
25． 0 76． 55 ± 11． 54＊＊114． 91 ± 12． 90＊＊123． 94 ± 9． 89＊＊
2． 9 ＲCE-4 对 HepG2 细胞 Caspase-9、Caspase-3 活性的影响
由表 3 可知，ＲCE-4 (6． 25、12． 5、25． 0 μM)可使 HepG2 细胞中
Caspase-3、Caspase-9 活性分别提高 35． 1%、58． 2%、88． 1% 和
44． 6%、71． 8%、89． 4%，与空白对照组比较具有显著性差异。
2． 10 ＲCE-4 对 HepG2 细胞 p53 和 Bcl-2、Bax 蛋白表达影响
如表 5 和图 5 所示，空白对照组中 Bcl-2 蛋白表达水平明显升
高，p53 和 Bax表达水平显著降低;用 ＲCE-4 (6． 25、12． 5、25． 0
μM)作用后可使 Bcl-2 表达水平降低，p53 和 Bax 表达水平升
高，Bcl-2 /Bax的比值降低，且随着 ＲCE-4 浓度增加其作用效果
更为明显，与空白对照组比较具有显著性差异。
表 3 ＲCE-4 对 HepG2 细胞 p53 和 Bcl-2、Bax蛋白表达影响(珋x ± s，
n = 4)
组别
剂量
(μM)
p53 /β-actin
Bcl-2 /
β-actin
Bax /β-actin Bcl-2 /Bax
空白对照 0． 290 ± 0． 056 0． 646 ± 0． 073 0． 262 ± 0． 076 2． 587 ± 0． 520
ＲCE-4 6． 25 0． 386 ± 0． 070* 0． 520 ± 0． 095* 0． 412 ± 0． 089* 1． 274 ± 0． 116＊＊
12． 5 0． 537 ± 0． 045＊＊0． 427 ± 0． 063＊＊0． 505 ± 0． 095＊＊0． 854 ± 0． 067＊＊
25． 0 1． 018 ± 0． 083＊＊0． 391 ± 0． 050＊＊0． 618 ± 0． 064＊＊0． 632 ± 0． 018＊＊
图 6 ＲCE-4 对 HepG2 细胞 p53 和 Bcl-2、Bax蛋白表达影响
1:空白对照;2:6． 25μM ＲCE-4;3:12． 5μM ＲCE-4;4:25． 0μM ＲCE-4
3 讨论
肝癌严重威胁着人类的健康，在我国其发病率呈逐年上升
趋势，因此研究积极开展肝癌的防治显得尤为重要。当前，手术
和西药放化疗虽有在一定程度地遏制和延缓了肝癌的发展，但
是许多患者由于体质和西药副作用大等原因，极大地降低其疗
效。今年近年来从天然药物中寻找疗效确切且副作用小的抗肿
瘤药已成为国内外重要的课题，围绕天然药物抗肿瘤的机制研
究方兴未艾。土家民间药物吉祥草广泛用于肺热咳嗽、咯血、吐
血、衄血、便血、咽喉肿痛、目赤翳障、痈肿疮疖等的治疗。在前
期研究中我们发现其重要的甾体皂苷 ＲCE-4 具有良好的抗宫
颈癌活性［3］。本研究观察了我们观察了其对 HepG2 细胞的增
殖及对凋亡的影响，并检测调控细胞凋亡的 p53、ＲOS及凋亡相
关蛋白 p53、Bcl-2、Bax 和 Caspase-3、Caspase-9 表达水平的变
化，初步探讨 ＲCE-4 抑制 HepG2 增殖、诱导细胞凋亡的机制。
由于细胞膜、线粒体膜、内质网膜等生物膜均由磷脂双分子
层及膜蛋白构成，极易受到 ＲOS 攻击;当线粒体膜受到 ＲOS 攻
击后可发生脂质过氧化膜的通透性改变，线粒体膜通透性转换
小孔开放，导致 Ca2 + 外流和细胞色素 C 释放，最终激活
Caspase-3 从而引起细胞凋亡;而当核膜受到 ＲOS 攻击后可引
56中药药理与临床 2016;32(2)
起细胞内内源性核酸内切酶的激活和 DNA的损伤，最终导致细
胞凋亡［4］。研究发现，肿瘤细胞内抗氧化酶活性较正常细胞
低，其对 ＲOS的清除效率较正常细胞低，当其细胞内 ＲOS 含量
与正常细胞中处于同一水平，往往可以显示出对肿瘤细胞具有
较好的杀伤作用，因此，近年来也就成为了肿瘤防治的一个重
要靶点［5］。作为肿瘤的重要抑制因子之一的 p53 在细胞周期
的调控、细胞凋亡中起着十分重要的作用，它像分子警察一
样监视着基因组 DNA的完整性。在细胞发生 DNA 损伤时，p53
蛋白能使细胞分裂过程终止，以使细胞有足够的时间修复损
伤。近年来，Borodkina 等人研究证实 p53 是 ＲOS诱导细胞凋亡
的重要下游调控因素［6］。研究都表明，ＲOS 可以导致 DNA 损
伤，进而激活凋亡-p53 通路［7］。为了验证 ＲCE-4 是否会通过激
活 ＲOS-p53 通路诱导 HepG2 细胞凋亡。我们利用 DCF-DA 荧
光染色结合流式细胞分析 HepG2 细胞内 ＲOS含量的同时，通过
Western blot 实验来分析了 p53 的蛋白表达水平。研究发现:
ＲCE-4 作用 HepG2 细胞后，细胞内 ＲOS 含量、细胞凋亡率和细
胞内 p53 蛋白表达量均明显升高，实验结果表明 ＲCE-4 诱导
ＲOS的产生，进而上调 p53 表达和诱导 HepG2 细胞凋亡。p53
作为细胞内重要转录因子，它也在细胞周期阻滞过程中发挥了
重要作用。它在调控的 G2 进入 M 期转换机制中，p53 对细胞
分裂周期基因 2 和细胞周期蛋白 B1 的抑制使 G2 期发生阻
滞［8］。在实验中，我们发现 ＲCE-4 作用 HepG2 细胞 24h后可使
HepG2 细胞 G0 /G1 期比例减少，S期细胞的比例稳定，G2 /M 期
比例明显增加，表明 ＲCE-4 能够有效地阻滞 HepG-2 细胞于
G2 /M期。当 DNA 损伤无法修复时，p53 除了阻滞细胞周期调
控外，另一重要的作用的是促进细胞凋亡。研究发现 p53 可通
过转录激活其他前凋亡基因和直接调节其下游凋亡相关基因，
两者一道结合 Apaf1 后，激活 Caspase-9，被激活的 Caspase-9 可
裂解下游的 Caspase-3，进而引起细胞凋亡［9］。在实验中，我们
发现 ＲCE-4 上调 p53 表达水平后，可以显著下调 Bcl-2 蛋白表
达水平，上调 Bax蛋白表达水平，进而降低 Bcl-2 和 Bax的比值;
在利用 JC-1 结合流式细胞分析细胞线粒体膜电位中，我们进一
步证实 ＲCE-4 可通过降低线粒体的跨膜电位，增加线粒体膜的
通透性来诱导 HepG2 细胞凋亡;在 Caspase-9 和 Caspase-3 的
ELISA的活性检测也证实了这一点。上述结果与其对 HepG2
细胞的凋亡影响的形态学结果和文献报道一致。
综上所述，ＲCE-4 具有诱导 HepG2 细胞凋亡的作用，其促
凋亡作用机制可能与上调细胞内 ＲOS水平，促进 p53 及下游靶
基因 Bax表达及增加 Caspase-9 和 Caspase-3 活性，抑制 Bcl-2 表
达及降低 Bcl-2 和 Bax 比值，降低线粒体膜电位和阻滞细胞于
G2 /M期有关。
参考文献
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Apoptosis effect of steroidal saponin ＲCE-4 on the human hepatocellular carcinoma HepG2 cells by
activating the p53-ＲOS signaling pathway
Yang Xiaojiao1，Zou Kun1，Yu Xiaoqin1，Qin Huilin1，Yan Weihong1，Zhang Yongfeng1，He Haibo1，2，Wang Junzhi1
(1 Hubei Key Laboratory of Natural Products Ｒesearch and Development，China Three Gorges University ＆ Hubei Institute of
Tujia Medicine，Yichang 443002;2Hubei Key Laboratory of Tumor and Microenvironment and Immunotherapy，Yichang 443002 )
Objective:To investigate the apoptosis effect of steroidal saponin ＲCE-4 from Ｒeineckia carnea (Andr．)Kunth on the human hepato-
cellular carcinoma HepG2 cells，and to explore the possible mechanism． Methods:HepG2 cells were treated with ＲCE-4 (1． 62，3． 13，6．
25，12． 5，25． 0，50． 0μM)for 24h，and cell viability was determined by MTT assay;After HepG2 cells were treated with ＲCE-4 (6． 25，
12． 5 and 25． 0 M)at different times (12，24，48h) ，cell viability was determined by MTT assay;After treated with ＲCE-4(6． 25，12． 5 and
25． 0μM)for 24h，Intracellular ＲOS level was analysed with DCFH-DA fluorescence dye;Cell morphology was examined by hoechst33258
through fluorescence microscope;Annexin V /PI double-staining and PI staining were performed to detect apoptosis and cycle of HepG2 cells
by flow cytometry;The mitochondrial membrane potential of HepG2 cells was measured by the JC-1 staining;The activities of caspase-9 and
caspase-3 were measured by caspase assay kit;The Expressions of Bcl-2，Bax and p53 protein were detected by western blot，and Bcl-2 /Bax
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ratio was analyzed． Ｒesults:ＲCE-4 from 1． 62 to 50． 0μM concentration range for HepG2 cells growth inhibition was obvious time-dose de-
pendent，when the concentration of drug at 12． 5μM，reached the maximum inhibition rate to 54． 2%，and by the IC50 analysis software to
calculate the IC50 value concentration of 12． 03μM;ＲCE-4(6． 25，12． 5 and 25． 0μM)treatment could significantly inhibit HepG2 cell prolif-
eration，promote apoptosis compared with the negative group (P ＜ 0． 05 or P ＜ 0． 01) ，when the drug concentration of 25． 0 μM for 24 h，
the inhibition rate might up to 93． 4%;After ＲCE-4 (6． 25，1． 25 and 25． 0μM)treated HepG2 cell for 24h，it could significantly increase
intracellular ＲOS levels，inhibit HepG2 cell apoptosis，arrest cells in G2 /M phase，decrease mitochondrial membrane potential，upregulate
the protein expression levels of Bax and p53 preotein level，downregulate expression level of Bcl-2 and Bcl-2 /Bax ratio，decrease activities of
caspase-9 and caspase-3 compared with the negative control group (P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01，respectively)． Conclusion:ＲCE-4 could effective-
ly inhibit proliferation and induce apoptosis in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells． The mechanism may be related to increaseing in-
tracellular ＲOS levels，promoting the downstream target gene Bax expression，strengthening activities of caspase-9 and caspase-3，inhibiting
Bcl-2 expression，decreasing Bcl-2 /Bax ratio and mitochondrial membrane potential，arresting cells in G2 /M phase．
Key words steroidal saponin ＲCE-4;Ｒeineckia carnea (Andr．)Kunth (吉祥草) ;HepG2;apoptosis;ＲOS;p53
红景天苷对异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌缺血的影响
*
常厦云，朱凌鹏，王秋娟，颜天华＊＊
(中国药科大学生理教研室，南京 210009)
摘 要 目的:研究红景天苷对异丙肾上腺素诱发小鼠急性心肌缺血的影响。方法:取雄性 ICＲ 小鼠 60 只，随机分为 6 组:
正常组、模型组、普萘洛尔组(15 mg /kg) ，红景天苷组(12 mg /kg) ，红景天苷组(24 mg /kg) ，红景天苷组(48 mg /kg)。正常组及模
型组按 10 ml /kg 灌胃给予生理盐水，普萘洛尔组(15 mg /kg)、红景天苷组(12 mg /kg，24 mg /kg，48 mg /kg)灌胃给予相应的药物，一
共给药 7 天，每次给药 1 h后，除空白组外，其余各组小鼠腹腔给予异丙肾上腺素(80 mg /kg) ;末次给药 2 h后，检测小鼠心电图，采
血测定血清心肌酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA) ，白介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α，并测
定心脏 CK、LDH、SOD、MDA、IL-6 和 TNF-α，取各组小鼠心脏做 HE 染色，并取各组小鼠心脏检测心脏 Bax 及 Bcl-2 蛋白表达。结
果:红景天苷(12 mg /kg，24 mg /kg，48 mg /kg)能显著降低异丙肾上腺素诱导的心肌缺血小鼠血清及心脏 CK、LDH、SOD、MDA、IL-6
和 TNF-α的含量;能显著改善异丙肾上腺素诱导的心脏病理学改变;显著升高心脏 Bcl-2 蛋白表达，降低心脏 Bax蛋白表达。结论:
红景天苷对异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌缺血有保护作用，其作用可能与调节心脏凋亡蛋白相关。
关键词 红景天苷;心肌缺血;凋亡
心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减
少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理
状态，其主要特点为心肌缺氧、能量代谢失衡、心功能障碍和心
肌细胞凋亡等。在临床上可表现为心绞痛、心肌梗死、心律失常
甚至猝死，是危害人们健康的最常见疾病之一，对它的发病机
理和预防治疗的研究一向是医学研究的热点。研究表明心肌
缺血及损伤的发生发展和血管内皮功能紊乱及炎症反应［1］、线
粒体功能障碍［2，3］、氧自由基损伤［4，5］、心肌细胞凋亡等密切相
关。抗心肌缺血药物可以通过多种机制改善心脏缺血状况，目
前临床常用的药物有多种，包括硝酸酯类药物，β 受体阻断剂，
钙拮抗剂和血管紧张素转换酶抑制剂［6］，红景天苷(Salidro-
side)是红景天的主要成分之一，具有多种药理学活性。研究表
明，红景天苷能够改善认知障碍、抗脑缺血、抗抑郁、治疗胃溃
疡、改善哮喘和脓毒症［7 ～ 9］，本实验拟观察红景天苷对异丙肾上
腺素诱导的小鼠心肌缺血的保护作用。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 红景天苷(由第二军医大学提供，纯度:
99%)。红景天苷用 0． 1%羧甲基纤维素钠作为助溶剂溶解，配
制成 10 mg /ml贮备液，于 4℃冰箱内保存。
1． 2 动物 雄性 ICＲ小鼠 60 只，体重 18 ～ 22 g，由中国药科大
学实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(苏)2014-0003，实
验室饲养温度: (23 ± 2)℃。
1． 3 试剂 异丙肾上腺素购自 sigma 公司，CK、LDH、SOD、
MDA 购自南京建成生物有限公司;IL-6、TNF-α 酶联免疫
(ELISA)试剂盒购自南京凯基生物有限公司。Bax、Bcl-2 和
GAPDH抗体购自 Sigma 公司。
1． 4 仪器 BL-420S 生物信号采集与分析系统(成都泰盟) ，
ＲT-6500 酶标仪(雷杜)。
1． 5 方法 小鼠 60 只，随机分为 6 组:正常组、模型组、普萘洛
尔组(15 mg /kg) ，红景天苷组 (12 mg /kg) ，红景天苷组 (24
mg /kg) ，红景天苷组 (48 mg /kg)。正常组及模型组按 10 ml /kg
灌胃给予生理盐水，普萘洛尔组(15 mg /kg)、红景天苷组 (12
76中药药理与临床 2016;32(2)
* 基金项目:十二五重大新药创制项目(2011ZX09102-002-01) 通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2016.02.019