全 文 ：　第５０卷２０１４年第５期 　　　　　西　北　师　范　大　学　学　报 （自然科学版）
　Ｖｏｌ．５０　２０１４　Ｎｏ．５ 　　　　　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　
收稿日期：２０１４－０５－２９；修改稿收到日期：２０１４－０８－２８
基金项目：甘肃省科技支撑计划项目（１３０４ＮＫＣＡ１４３）；甘肃省高校科研项目（２０１３Ａ－０１１）；西北师范大学青年教师提升计
划资助项目 （ＮＷＮＵ－ＬＫＱＮ－１０－１８）
作者简介：令利军 （１９７５—），男，甘肃天水人，副教授，博士，硕士研究生导师．主要研究方向为植物与微生物互作．
Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｎｇｌｉｊｕｎ＠ｎｗｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
独角莲内生细菌ＴＧ１１６的分离鉴定及
抑菌特性研究
令利军，雷　蕾，冯　蕾，何　楠，丁　兰
（西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州　７３００７０）
摘要：以从独角莲块茎内分离到的细菌ＴＧ１１６为研究对象，通过１６ＳｒＲＮＡ序列分析结合形态特征和生理生化特性
对ＴＧ１１６进行鉴定，采用皿内涂布、平板对峙和异步培养等方法研究其抑菌特性，并对其生长曲线、最适温度、最
适ｐＨ值及耐盐性等进行了系统研究．结果表明：ＴＧ１１６对辣椒疫霉病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｃａｐｓｉｃｉ）等７种供试植物病原
菌均有良好的掏抑制作用，表现出对植物病原真菌的广谱抗性且能使病原菌菌丝扭曲、变形等．结合形态学、生理生
化指标和１６ＳｒＲＮＡ序列分析等结果，初步鉴定ＴＧ１１６菌株为地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）．研究结果为生
物防治作物病害提供新的菌种资源，为开发和利用独角莲内生拮抗菌提供了理论依据．
关键词：独角莲；内生菌；鉴定；抑菌特性；生长特性
中图分类号：Ｑ　９３９．９　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１００１－９８８Ⅹ（２０１４）０５－００９１－０７
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ＴＧ１１６ｆｒｏｍＴｙｐｈｏｎｉｕｍ　ｇｉｇａｎｔｅｕｍ
ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ＬＩＮＧ　Ｌｉ－ｊｕｎ，ＬＥＩ　Ｌｅｉ，ＦＥＮＧ　Ｌｅｉ，ＨＥ　Ｎａｎ，ＤＩＮＧ　Ｌａｎ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｇａｎｓｕ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｉｓ　ｆｏｃｕｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｔｒａｉｎ　ＴＧ１１６ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｔｕｂｅｒ　ｏｆ
Ｔｙｐｈｏｎｉｕｍ　ｇｉｇａｎｔｅｕｍ Ｅｎｇｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ＴＧ１１６ａｒｅ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｕｓｉｎｇ　１６ＳｒＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ＴＧ１１６ａｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｕｓｉｎｇ
ｓｕｒｆａｃｅ　ｓｐｒｅａｄ　ｐｌａｔｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｃｏｎｆｒｏｎｔ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｄ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ
ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ，ｏｐｔｉｍｕｍ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｏｐｔｉｍｕｍ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ａｎｄ　ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ
ＴＧ１１６ａｒｅ　ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｙ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ　ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｉｍｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ　ｓｔｒａｉｎ　ＴＧ１１６ｄｉｓｐｌａｙ　ａ
ｗｉｄｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｗｈｉｃｈ　ｅｘｈｉｂｉｔｅ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｔｏｗａｒｄ　ａｌ　ｔｈｅ　７ ｔｅｓｔｅｄ
ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｃａｐｓｉｃｉ．Ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｃａｎ　ｃａｕｓｅ　ｔｈｅ　ｍｙｃｅｌｉａ　ｏｆ　ｆｕｎｇｉ　ｉｎｔｏ　ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ
ａｎｄ　ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｉｔｓ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　１６Ｓ
ｒＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｓ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｃａｎ
ｓｕｐｐｌｙ　ｎｅｗ　ｓｔｒａｉｎ　ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｃｒｏｐ　ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　ｃａｎ　ａｌｓｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ
ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ　ａｎｄ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　Ｔｙｐｈｏｎｉｕｍ　ｇｉｇａｎｔｅｕｍＥｎｇｌ．
Ｋｅｙ　 ｗｏｒｄｓ： Ｔｙｐｈｏｎｉｕｍ　ｇｉｇａｎｔｅｕｍ　 Ｅｎｇｌ； ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　 ｂａｃｔｅｒｉａ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ；ｇｒｏｗｔｈ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
１９
西　北　师　范　大　学　学　报 （自然科学版）　　 第５０卷　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　　 Ｖｏｌ．５０　
　　一直以来，真菌病害引起的农作物减产及采后
损失都是影响农业生产的主要问题之一，化学药剂
是目前防治植物病害的主要措施，但其易导致病原
菌产生抗药性、有害物质残留、环境污染、伤害非
靶标生物和危害人类健康等问题的出现，生物防治
在应用中无污染、对环境安全、成本较低且有利于
提高农田生态系统生物多样性从而越来越受到人们
的重视［１］．内生菌对化学药剂难以发挥作用的植
物维管束病害、土传病害和系统性病害的防治具有
独特优势［２］．迄今为止，已从块根芍药、甘草、
蛇足石杉、铁棍山药等药用植物和马铃薯、番茄、
甘蓝和水稻等植物中获得对多种植物病害具有良好
抑制作用的内生菌［３］．植物内生菌（Ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ）指
的是一类在其生活史的一定或全部阶段生活于健康
植物各种组织及器官内部的真菌或细菌，宿主植物
至少在短期内不会表现出外在症状［４］．植物内生
菌与宿主植物在长期的协同进化过程中形成了十分
密切的关系，内生菌在从宿主植物获得稳定生活环
境的同时也会通过产生水解酶类、抗生素类和生物
碱类等代谢产物，与病原菌竞争营养物质，诱导宿
主植物产生系统抗性以及增强植物的抵抗力等途径
发挥生物防治作用［５］．
独角莲（Ｔｙｐｈｏｎｉｕｍ　ｇｉｇａｎｔｅｕｍ Ｅｎｇｌ）为中国
特有植物，属于天南星科（Ａｒａｃｅａｅ）、犁头尖属
（Ｔｙｐｈｏｎｉｕｍ），它的干燥块茎被用作药材，常称
为 “禹白附”；其化学成分丰富且药理作用广泛，
具有抗菌抗炎、抗肿瘤、抗破伤风毒素、免疫调
节、抗惊厥、镇静、祛风痰等功效［６］，且独角莲
在生长过程中几乎不感染病虫害，根据药用植物内
生菌可产生与宿主相似甚至相同的活性物质且某些
活性物质可能参与到了植物的抗菌过程中推测［７］，
与独角莲协同进化的内生菌也可能具有其独特性．
国内外学者注重于独角莲的药理作用、临床应用研
究和化学成分的提取，而关于独角莲内生菌的研究
未见报道．
本研究从独角莲块茎中分离得到１株对多种植
物 病 原 真 菌 均 有 良 好 抑 制 作 用 的 内 生
Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，并命名为 ＴＧ１１６．研究结果对
ＴＧ１１６及类似生防菌的抑菌机制和应用推广提供
材料和理论依据．
１　材料与方法
１．１　材料
健康独角莲（Ｔ．ｇｉｇａｎｔｅｕｍＥｎｇｌ．）植株，采自
甘肃陇南文县．供试植物病原真菌为辣椒疫霉病菌
（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｃａｐｓｉｃｉ）、 辣 椒 炭 疽 病 菌
（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｐｓｉｃｉ）、马 铃 薯 立 枯 丝 核 菌
（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎｉ）、小麦赤霉病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ ）、 黄 瓜 枯 萎 病 菌 （Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、黄瓜灰霉病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）、
番瓜绵疫病菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ　ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ），均由
甘肃省农业科学院植物保护研究所惠赠．供试细菌
为大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、金黄色葡萄球菌
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ），均由本实验室保存．
独角莲内生细菌的分离、纯化和培养采用营养
琼脂培养基（ＮＡ），植物病原真菌的培养及拮抗性
实验采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）．营养
琼脂培养基（ＮＡ）：牛肉浸膏３ｇ，蛋白胨１０ｇ，
氯化钠５ｇ，琼脂１８ｇ，加水定容至１　０００ｍＬ，
ｐＨ　７．０～７．２；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）：
马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，琼脂１８ｇ，加水定容
至１　０００ｍＬ，ｐＨ自然．
１．２　ＴＧ１１６菌株的分离
参照梁洁等［８］的方法对独角莲块茎进行表面
清毒，取表面消毒处理后的独角莲块茎，无菌条件
下切成大小约０．５ｃｍ×０．５ｃｍ的组织块，置于分
离培养基上，使切口面与培养基接触，置于３７℃
培养２～５ｄ，待组织块周围长出菌落后，挑取转移
到新的培养基上，划线法纯化后保存备用［９］．利
用漂洗液检验法和组织印迹法设两种空白对
照［９，１０］．ＴＧ１１６为分离菌株中的一株．
１．３　ＴＧ１１６菌株抑菌实验
１．３．１　菌株对植物病原真菌的抑制作用　将在
ＰＤＡ培养基上活化和扩大培养后的供试植物病原
真菌打成直径为６ｍｍ 的菌饼，采用皿内涂布
法［１１］、平板对峙法［１２］和异步培养法［１３］研究ＴＧ１１６
菌株对植物病原真菌的抑制能力，相对抑菌率＝
（对照组病原真菌生长量－试验组病原真菌生长
量）／对照组病原真菌生长量×１００％．参照文献
［１４］的做法研究ＴＧ１１６菌株对植物病原真菌菌丝
形态的影响．
１．３．２　菌株对细菌的抑制作用　参照文献［１５］的
做法，选用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢
杆菌为供试菌．
１．４　ＴＧ１１６菌株的鉴定
１．４．１　形态观察及生理生化分析　参照文献［１６］
的做法对ＴＧ１１６菌株进行扫描电镜观察，参照《常
见细菌系统鉴定手册》［１７］观察 ＴＧ１１６菌株的培养
形态、革兰氏染色并测定其生理生化特征．
２９
　２０１４年第５期 　　　　　令利军等：独角莲内生细菌ＴＧ１１６的分离鉴定及抑菌特性研究
　２０１４　Ｎｏ．５ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＴＧ１１６ｆｒｏｍＴｙｐｈｏｎｉｕｍ　ｇｉｇａｎｔｅｕｍａｎｄ　ｉｔｓ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
１．４．２　１６ＳｒＲＮＡ序列测定及系统发育分析　采
用菌落ＰＣＲ的方法扩增 ＴＧ１１６的１６ＳｒＲＮＡ 片
段，将３０μＬ无菌水加入１．５ｍＬ离心管中并挑取
少量菌体于水中制成悬液，先煮沸１０ｍｉｎ，再迅
速放入冰中５ｍｉｎ，以１２　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ
后的上清液作为ＰＣＲ模板［１８］，采用细菌通用引物
２７Ｆ（５′－ＡＧＡ　ＧＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＣ　ＴＧＧ　ＣＴＣ　ＡＧ－３′）
和１４９２Ｒ（５′－ＧＧＴ　ＴＡＣ　ＣＴＴ　ＧＴＴ　ＡＣＧ　ＡＣＴ　Ｔ－
３′）［１９］，参照张国庆等［２０］的方法扩增菌株 ＴＧ１１６
的１６ＳｒＲＮＡ．所得序列经校对后与ＧｅｎＢａｎｋ数据
库中 的 已 有 序 列 进 行 ＢＬＡＳＴ 比 对 分 析，用
ＭＥＧＡ　６．０软件采用邻接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）聚
类分析，并构建系统发育树［２１］．
１．５　ＴＧ１１６菌株的生长特性分析
参照陈美标及王英等的报道［２２，２３］，略有修改．
１．５．１　生长曲线的制作　将ＴＧ１１６菌株的新鲜种
子液以 １％ 的接种量接入 ＮＡ 液体培养基中，
３５℃，２２０ｒ·ｍｉｎ－１振荡培养，每隔２ｈ取样，用分
光光度计测不同培养时间细菌悬浮液在ＯＤ６００处的
吸光值，以不接种的ＮＡ液体培养基为空白对照．
１．５．２　最适生长温度的测定　将ＴＧ１１６菌株的新
鲜种子液以１％的接种量接入 ＮＡ液体培养基中，
分别置于２０℃，２５℃，３０℃，３５℃，４０℃，４５℃，
５０℃，５５℃，６０℃，６５℃，７０℃下２２０ｒ·ｍｉｎ－１振荡
培养，１０ｈ后取样，用分光光度计测ＯＤ６００，以不
接种的ＮＡ液体培养基为空白对照．
１．５．３　最适生长ｐＨ 值的测定　制备ｐＨ 分别为
３．０，４．０，５．０，６．０，６．５，７．０，７．５，８．０，８．５，９．０和
１０．０的ＮＡ液体培养基，将ＴＧ１１６菌株的新鲜种
子液以１％的接种量接入不同ｐＨ值的ＮＡ液体培
养基中，３５℃，２２０ｒ·ｍｉｎ－１振荡培养，１０ｈ后取
样，用分光光度计测ＯＤ６００，以不接种的ＮＡ液体
培养基为空白对照．
１．５．４　耐盐性测定　将ＴＧ１１６菌株的新鲜种子液
以１％的接种量分别接种于 ＮａＣｌ添加质量分数为
３％，４％，５％，６％，６．５％，７％，７．５％，８％，８．５％，
９％，１０％的ＮＡ液体培养基中，３５℃，２２０ｒ·ｍｉｎ－１
振荡培养，１０ｈ后取样，用分光光度计测不同
ＮａＣｌ质量分数细菌悬浮液在 ＯＤ６００处的吸光值，
以不接种的ＮＡ液体培养基为空白对照．
以上实验均至少设置３次重复．
２　结果与分析
２．１　ＴＧ１１６菌株对植物病原真菌的抑制作用
采用皿内涂布法、平板对峙法和异步培养法分
别评价了ＴＧ１１６菌株对供试植物病原菌的抑制能
力．结果显示，ＴＧ１１６菌株对供试的７种植物病
原菌均有良好抑制作用，为广谱型抑制菌．皿内涂
布法试验（图１Ａ，Ｂ）中处理组供试植物病原菌与对
照组相比几乎不生长，故只能作为对ＴＧ１１６菌株
抑制能力的定性评价．通过平板对峙法（图１Ｃ，Ｄ）
进一步对菌株的抑制能力做了定量评价，结果如表
１所示．异步培养法处理组供试植物病原菌与对照
组相比也几乎不生长，表明ＴＧ１１６菌株发酵液中
含有对供试植物病原菌有强抑制作用的物质．
表１　ＴＧ１１６菌株对植物病原真菌的抑菌活性
Ｔａｂ　１ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ＴＧ１１６
ｔｏ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｆｕｎｇｉ
植物病原真菌Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｆｕｎｇｉ 抑菌率Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ／％
辣椒疫霉病菌Ｐ．ｃａｐｓｉｃｉ　 ８１．９８
辣椒炭疽病菌Ｃ．ｃａｐｓｉｃｉ　 ７４．４２
马铃薯立枯丝核菌Ｒ．ｓｏｌａｎｉ　 ７４．８８
小麦赤霉病菌Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ　 ８４．８３
黄瓜枯萎病菌Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　 ７５．７８
黄瓜灰霉病菌Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ　 ７２．８５
番瓜绵疫病菌Ｐ．ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ　 ７８．６９
图１　ＴＧ１１６菌株对植物病原真菌的抑制作用
Ｆｉｇ　１ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ＴＧ１１６ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｆｕｎｇｉ
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西　北　师　范　大　学　学　报 （自然科学版）　　 第５０卷　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　　 Ｖｏｌ．５０　
　　镜检结果显示（图２），受到 ＴＧ１１６菌株影响
的植物病原菌菌丝形态与对照相比有明显差异，对
照菌丝形状均匀、细长，直立整齐有规律，生长旺
盛、密集饱满；受到ＴＧ１１６菌株影响的病原菌菌
丝形态发生变化，许多菌丝扭曲、变形，部分菌丝
变得透明干瘪，原生质外渗造成菌丝中空干枯．
２．２　ＴＧ１１６菌株对细菌的抑制作用
抑菌实验结果显示，ＴＧ１１６菌株对大肠杆菌、
金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌没有拮抗作用，表
明ＴＧ１１６为真菌特异型生防菌．
２．３　ＴＧ１１６菌株的鉴定
２．３．１　形态及生理生化鉴定　ＴＧ１１６菌株在 ＮＡ
培养基上菌落呈扁平圆形，边缘不规则，表面较光
滑，不产生色素，全株为乳白色，革兰氏染色为阳
性（图３Ａ）；扫描电镜观察为棍棒状，大小为（０．７
～０．９）μｍ ×（３～６）μｍ（图３Ｂ）．ＴＧ１１６生理生化
特性实验结果见表２，结合其形态特征，初步将菌
株ＴＧ１１６归于芽孢杆菌属．
图２　ＴＧ１１６菌株对植物病原真菌菌丝的抑制作用
Ｆｉｇ　２ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ＴＧ１１６ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　ｍｙｃｅｌｉａ　ｏｆ　ｆｕｎｇａｌ　ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ
　　 Ａ．ＴＧ１１６ 菌 株 革 兰 氏 染 色 形 态 （Ｇｒａｍ　ｓｔｒａｉｎ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ＴＧ１１６）；Ｂ．ＴＧ１１６菌株扫描电镜图
（Ｔｈｅ　ＳＥＭ　ｐｉｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ＴＧ１１６）
图３　ＴＧ１１６菌株的形态
Ｆｉｇ　３ Ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ＴＧ１１６
２．３．２　分子生物学鉴定　采用细菌通用引物ＰＣＲ
扩增１６ＳｒＲＮＡ，扩增片段纯化后克隆并测序，将
ＴＧ１１６菌株的１６ＳｒＲＮＡ 序列向 ＧｅｎＢａｎｋ提交，
其序列登录号为 ＫＪ７２６７６９．测序结果同源比对显
示，ＴＧ１１６菌株１６ＳｒＲＮＡ序列与芽孢杆菌属１６Ｓ
ｒＲＮＡ高度相似，其中与Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　Ｗ－２（登
录号：ＧＵ２１６２６２．１）同源性为９９％．从构建的系
统发育树来看（图４），ＴＧ１１６与地衣芽孢杆菌
Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　Ｗ－２（登 录 号：ＧＵ２１６２６２．１）、
Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　 ＫＩＢＧＥ－ＩＢ５ （登 录 号：
ＥＦ６５６４５５．１）和Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　ＪＫ－ＳＨ００１（登录
号：ＧＱ１６９７８３．１）同源性高达９９％．
图４　基于１６ＳｒＲＮＡ序列构建的ＴＧ１１６菌株的系统发育树
Ｆｉｇ　４ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ＴＧ１１６ｂａｓｅｄ　ｏｎ　１６ＳｒＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
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　２０１４年第５期 　　　　　令利军等：独角莲内生细菌ＴＧ１１６的分离鉴定及抑菌特性研究
　２０１４　Ｎｏ．５ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＴＧ１１６ｆｒｏｍＴｙｐｈｏｎｉｕｍ　ｇｉｇａｎｔｅｕｍａｎｄ　ｉｔｓ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
表２　ＴＧ１１６菌株的生理生化特征
Ｔａｂ　２ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ＴＧ１１６
测定指标 Ｔｅｓｔ　ｉｎｄｅｘ 结果Ｒｅｓｕｌｔｓ
接触酶Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＋
厌氧生长Ａｎａｅｒｏｂｉｃ　ｇｒｏｗｔｈ ＋
明胶液化Ｇｅｌａｔｉｎ　ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ ＋
淀粉水解Ａｍｙｌｏｌｙｓｉｓ ＋
柠檬酸盐利用Ｃｉｔｒａｔｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ＋
丙酸盐利用 Ｍａｌｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ＋
甲基红 Ｍｅｔｈｙｌ　ｒｅｄ　ｔｅｓｔ －
硝酸盐还原Ｎｉｔｒａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ＋
纤维二糖Ｃｅｌｏｂｉｏｓｅ ＋
２％ ＮａＣｌ生长Ｇｒｏｗｔｈ　ｕｎｄｅｒ　２％ ＮａＣｌ ＋
５％ ＮａＣｌ生长Ｇｒｏｗｔｈ　ｕｎｄｅｒ　５％ ＮａＣｌ ＋
７％ ＮａＣｌ生长Ｇｒｏｗｔｈ　ｕｎｄｅｒ　７％ ＮａＣｌ ＋
生长ｐＨ　５．７Ｇｒｏｗｔｈ　ｕｎｄｅｒ　ｐＨ５．７ ＋
葡萄糖Ｇｌｕｃｏｓｅ ＋
阿拉伯糖Ｐｅｃｔｉｎｏｓｅ ＋
木糖Ｘｙｌｏｓｅ ＋
甘露醇 Ｍａｎｎｉｔｏｌ ＋
果糖Ｆｒｕｃｔｏｓｅ ＋
乳糖Ｌａｃｔｏｓｅ －
Ｖ－Ｐ测定Ｖ－Ｐ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ＋
蔗糖Ｓｕｃｒｏｓｅ ＋
１０℃生长 Ｇｒｏｗｔｈ　ａｔ　１０℃ －
４０℃生长 Ｇｒｏｗｔｈ　ａｔ　４０℃ ＋
５０℃生长 Ｇｒｏｗｔｈ　ａｔ　５０℃ ＋
５５℃生长 Ｇｒｏｗｔｈ　ａｔ　５５℃ ＋
生长ｐＨ　６．８Ｇｒｏｗｔｈ　ｕｎｄｅｒ　ｐＨ６．８ ＋
　　 “＋”表示阳性（ｍｅａｎｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ），“－”表示
阴性（ｍｅａｎｓ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）．
　　结合形态学、生理生化指标和１６ＳｒＲＮＡ序列
综合分析结果，将ＴＧ１１６菌株初步鉴定为地衣芽
孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）．
２．４　ＴＧ１１６菌株的生长特性
２．４．１　生长曲线　结果显示，０～８ｈ间生长缓
慢，处于迟缓期；８～１６ｈ间活菌数增长迅速，处
于对数生长期；１６ｈ之后曲线平稳，生长进入稳
定期，１６～４８ｈ间处于稳定生长期；接种４８ｈ后
进入衰退期（图５）．
２．４．２　最适生长温度　温度对ＴＧ１１６菌株的生长
影响较大（图６），其在２０～６０℃范围内均能生长，
生长温度范围较广，最适生长温度为４５℃．
２．４．３　最适生长ｐＨ 值　由图６可知，培养基的
初始ｐＨ对ＴＧ１１６菌株的生长有明显影响，其在
初始ｐＨ值３．０～９．０范围均可生长，具有较宽的
ｐＨ值适应范围；ｐＨ值在５．０～８．０范围内菌株生
长良好，最适生长初始ｐＨ值为７．０．
２．４．４　耐盐性能　如图７可知，与不添加 ＮａＣｌ
相比，在培养基中加入ＮａＣｌ后对菌株的生长均有
一定的影响，ＴＧ１１６菌株在低钠离子浓度下能正
常生长，高浓度的钠离子明显抑制了其生长．
图５　ＴＧ１１６菌株的生长曲线
Ｆｉｇ　５ Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ＴＧ１１６
图６　温度和ｐＨ值对ＴＧ１１６菌株生长的影响
Ｆｉｇ　６ Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｐＨ
ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ＴＧ１１６
图７　不同ＮａＣｌ含量对ＴＧ１１６菌株生长的影响
Ｆｉｇ　７ Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ＮａＣｌ
ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ＴＧ１１６
５９
西　北　师　范　大　学　学　报 （自然科学版）　　 第５０卷　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　　 Ｖｏｌ．５０　
３　讨论
植物内生菌本身就存在于植物体内，具有便于
优先占据有益于生物防治的生态位、能够经受住植
物自身的防卫反应、生存环境稳定等优势［２，４］，植
物内生菌同时还是良好的外源基因载体，为固氮、
抗病及杀虫等外源基因向植物体内的转移提供了新
的途径和方法［５］．与分离自土壤等的生防菌相比
而言，ＴＧ１１６作为内生菌可能更易于在植株中定
殖、增殖，更有利于其生防作用的发挥．
药用植物有其独特的药理活性，特别在治疗某
些疑难杂症上具有不可替代的作用［２４］．药用植物
内含有丰富的生防资源菌，这些内生菌能够产生具
有抗菌等多种活性的产物，是植物病害生物防治的
重要微生物资源［３］．药用植物这一宝贵的生防菌
资源库为筛选活性代谢产物及发现新物种提供了广
阔的研究空间，将内生菌的研究与药用植物的研究
相结合，寻求能够产生与宿主植物具有相似或相同
药理作用成分的内生菌，对突破药用植物生长周期
长等限制及对濒危药用植物资源的保护也具有积极
的作用［２５］．
本实验从独角莲块茎内分离到的ＴＧ１１６菌株
对７种供试植物病原真菌均有良好的抑制作用，为
广谱型植物病原真菌拮抗菌，能够使病原菌菌丝扭
曲、变形等．对ＴＧ１１６进行形态学、生理生化特
征和分子生物学鉴定，其形态学和生理生化反应与
芽孢杆菌属特征基本相似，１６ＳｒＲＮＡ序列的比对
分析显示ＴＧ１１６菌株属于芽孢杆菌属，与地衣芽
孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）同源性高达９９％，
与形态学和生理生化反应结果一致，因而确定
ＴＧ１１６ 菌 株 为 地 衣 芽 孢 杆 菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）．地衣芽孢杆菌能够代谢产生抗生
素和抗菌蛋白等多种物质，在工业及医药业应用广
泛，在植物病害的防治中也具有利用价值，是一种
具有极高应用价值的微生物［２６，２７］．芽孢杆菌因其
菌体本身及所产生的抗菌物质在防治病害及促进植
物生长发育等方面均有良好的效果而成为植物病害
生物防治的研究热点［２８］，其在自然界中存在广泛，
也是植物体内常见的内生细菌，不污染环境且对人
畜无毒无害，能够产生多种酶和抗菌素，抗菌活性
具有广谱性，不产生耐药性，生长快且所需营养简
单，能产生具有强耐热和抗逆性能的芽孢，在长期
储存过程中存活率高，芽孢杆菌所具有的特性有益
于其相关生防菌剂的生产、加工和在环境中存活、
定殖及繁殖等［２９］．目前，已有一些芽孢杆菌优势
菌株作为生物农药投入到植物病害防治的应用中，
在国外一些菌株已登记为生物杀菌剂用于防治多种
真菌病害［３０］．迄今为止，关于独角莲内生菌的研
究未见报道，ＴＧ１１６丰富了内生地衣芽孢杆菌的
资源，为生物防治作物病害提供了新的微生物资
源，且本研究表明，ＴＧ１１６菌株生长繁殖快，酸
碱条件和温度环境适应范围广泛，抑菌谱广，这些
都显示了该菌在植物病害生物防治方面的潜在应用
价值，其防病机理、促生作用、实用发酵条件及田
间应用效果等还需做进一步研究．
致谢：感谢甘肃省农业科学院植物保护研究所
李继平研究员惠赠植物病原真菌．
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Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ　ｆｒａｇａｒｉａｅ　ｕｓｉｎｇ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ　ＢＳ８７ａｎｄ　ＲＫ１ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
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（责任编辑　俞诗源）
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