全 文 ：第 38卷 第 1期
2013年 2月
林 业 调 查 规 划
Forest Inventory and Planning
Vol． 38 No． 1
Feb． 2013
doi:10. 3969 / j. issn. 1671-3168. 2013. 01. 004
野龙竹茎中黄酮类化合物的组织化学定位及其提取工艺研究
王明悦1，施 蕊1，杨宇明2，王 娟2，闫修瑜1，吴义军1
(1.西南林业大学，国家林业局西南生物多样性保育重点实验室，云南 昆明 650224;
2.云南省林业科学院，云南 昆明 650201)
摘要:以野龙竹竹茎为材料，采用组织化学定位方法，研究野龙竹茎中黄酮类物质的积累分布及含
量;采用超声波萃取竹茎中的总黄酮，比较各因素对总黄酮提取率的影响，影响顺序为乙醇体积分
数 ＞萃取温度 ＞料液比 ＞超声萃取时间。通过正交试验确定最佳萃取条件为: 乙醇体积分数为
70%，萃取温度为 50℃，超声萃取时间为 15 min，料液比为 1∶ 25，总黄酮的平均含量为 10. 36 mg /g。
关键词:组织化学定位;黄酮类化合物;超声波;正交设计; 野龙竹
中图分类号:S795;Q944. 55;S713 文献标识码:A 文章编号:1671－3168(2013)01－0014－03
Histochemistry Positioning and Extraction Process of Flavonoid Compounds
in the Stem of Dendrocalanus Semiscandens
WANG Ming-yue1，SHI Rui1，YANG Yu-ming2，WANG Juan2，YAN Xiu-yu1，WU Yi-jun1
(1． SFA Key Lab of Biodiversity Conservation in Southwest Region of China，Southwest Forestry University，
Kunming 650224，China;2． Yunnan Academy of Forestry，Kunming 650201，China)
Abstract:Taking Dendrocalanus Semiscandens as material，histochemistry positioning method was used
to test the accumulation of flavonoids compounds distribution condition in the stem of Dendrocalanus Semi-
scandens，the total flavonoids was extracted by using ultrasonic，and the impact of various factors on the
extraction rate also were analyzed，results showed that the effect order was followed as alcohol concentra-
tion ＞ extraction temperature ＞ ratio of solid to solvent ＞ ultrasonic time． The optimum condition
which was 70% of ethanol concentration，50°C of extraction temperature，15 min of ultrasonic extraction
time，1∶ 25 of the solid-liquid ratio，10. 36mg /g of the average content of total flavonoids was confirmed．
Key words:Histochemical positioning;flavonoids compounds;ultrasonic;orthogonal design;Dendro-
calanus Semiscandens
收稿日期:2013－01－16.
基金项目:国家林业局 948 项目(2008－4－30)“竹子重要性状的基因工程研究技术引进”、云南省科技计划项目 2009CD073、云南省中青年
学术技术带头人后备人才培养项目(2010CI016 )共同资助。
作者简介:王明悦(1987－) ，女，河南郸城人，硕士研究生。研究方向为植物化学。
通讯作者:王 娟(1966－) ，女，云南建水人，教授，博士。主要从事竹类植物研究。
野龙竹(Dendrocalanus semiscandens Hsueh et
D. Z. Li)又名丛生毛竹、绥条毛，禾本科牡竹属，分
布于云南省南部至西南部海拔 500 ～ 1 000 m 地带，
是云南南部最重要的优质笋用竹种之一［1］。目前
野龙竹的资源只限于木材和竹笋的开发利用［2］。
云南省是世界竹子种类最多、生态类型和天然竹林
最丰富的地区之一，野龙竹是云南省特有的丛生竹
竹种之一。近年的研究表明，竹类植物中含有大量
王明悦，等:野龙竹茎中黄酮类化合物的组织化学定位及其提取工艺研究
的黄酮类化合物［5］，也是竹类植物中主要的生理活
性成分［6］。黄酮类化合物具有清除自由基、抗炎、
预防心血管疾病、抗衰老和降血脂等生理功能［3 － 4］，
广泛的存在于各种植物中。竹类黄酮以其良好的药
理活性和低毒性作用，已成为一种具开发前景的新
型药用资源［7］。黄酮类化合物在丛生竹中的含量
比较丰富［8］。但是有关野龙竹中的类黄酮化合物
研究至今未见报道。为此，本文以野龙竹的竹茎为
材料，对黄酮类化合物在野龙竹茎中的分布状态和
提取工艺进行了研究，以期为野龙竹资源的进一步
开发提供理论基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
野龙竹竹茎于 2012 年 5 月 25 日采自西南林业
大学竹园，由西南林业大学植物教研室王娟教师鉴
定为野龙竹。将竹茎上的竹叶去净，经风干后，粉碎
至 20 目，用于黄酮类化合物的提取实验。
1. 1. 2 实验仪器
荧光显微镜(尼康 E800)、752 －紫外分光光度
计、KQ －250D 型数控超声波清洗器(昆山超声波仪
器有限公司生产) ;粉碎机、天平等。
1. 1. 3 试剂
酸醋镁，甲醇，氢氧化钠，磷酸二氢钾，氯化钠，
二苯基硼酸 － 2 －氨基乙酯，去离子水，乙醇，芦丁标
品，硝酸铝溶液等，所用试剂均为分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 黄酮类化合物的组织化学定位
对新鲜竹茎进行徒手切片，分别以 5% NaOH水
溶液［9 － 10］、1%醋酸镁甲醇溶液［10］和 1% NA甲醇溶
液［10 － 13］对切片进行染色，然后分别用荧光显微镜
(尼康 E800)的自然光、蓝光和紫外光源为激发光源
观察黄酮类化合物发出的荧光并照相。
1. 2. 2 总黄酮的检测方法
检测黄酮类化合物含量采用 NaNO2 － Al
(NO3)3 － NaOH体系络合化学吸光法
［14］，在 510 nm
处测定吸光度，以芦丁为标准品制定标准曲线，利用
标准曲线方程，得到野龙竹茎中总黄酮的含量。
1. 2. 3 超声波萃取野龙竹茎中黄酮类化合物的方法
影响超声波萃取结果的因素很多，如材料粉碎
粒度大小、溶剂种类、溶剂浓度、溶剂用量、超声波功
率、萃取温度以及萃取时间等。本试验主要研究乙
醇体积分数、液料比、萃取温度和萃取时间等因素对
黄酮类化合物提取的影响，然后通过单因素实验确
定最佳水平范围，再通过正交试验确定最佳的提取
条件。
称取过 20 目筛的野龙竹竹茎粉末 2. 00 g，用
70%乙醇浸泡 24 h，在超声波功率 200 W 条件下，
超声处理 15 min，萃取温度 50℃，减压浓缩，定容置
10 mL容量瓶中，吸取 1 mL，并按照总黄酮的检测
方法计算出黄酮类化合物的含量。
2 结果与分析
2. 1 野龙竹茎中黄酮类化合物的组织化学定位
采用 5%NaOH水溶液染色法进行类黄酮化合
物组织化学定位，呈黄至橙色均是黄酮类化合
物［9 － 10］;经 1%醋酸镁甲醇溶液染色法染色黄酮类
化合物可产生天绿色荧光［10］;经 1% NA 甲醇溶液
染色法染色黄酮类化合物呈黄色荧光［10 － 13］。图 1a
是用蒸馏水进行封片，做对照。在野龙竹的竹茎中，
黄酮类化合物经 5% NaOH 水溶液染色(图 1b) ，在
表皮层、表皮层内部和维管束的周围及其伴胞和筛
管之间呈黄色;经 1% 醋酸镁甲醇溶液染色(图
1c) ，在表皮层和维管束周围的一圈纤维束之中产
生绿色荧光;经 1%NA甲醇溶液染色(图 1d) ，在表
皮层、表皮层内部和维管束中呈黄色荧光。
2. 2 超声波法萃取黄酮类化合物单因素实验与正交
实验结果
单因素实验分析最佳提取条件。依据试验方法
分别对乙醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%、
80%) ，超声波萃取时间(5 min、10 min、15 min、20
min、25 min) ，萃取温度(30℃、40℃、50℃、60℃、
70℃) ，料液比(g /mL) (1:15、1:20、1:25、1:30、1:
35)分组进行实验分析。随着乙醇浓度的增大，黄
酮类化合物提取量增多，当乙醇浓度超过 70%时，
乙醇浓度过高，其他物质也被溶出，而黄酮类化合物
成分减少，所以选择乙醇浓度为 70%。黄酮类化合
物提取率随着萃取时间的增加而增加，当超过 20
min 后提取率反而下降，因此最佳萃取时间为 20
min;在 30 ～ 50℃时黄酮类化合物的得率随着温度
的增大而增大，大于 50℃时反而下降。综合考虑，
温度范围应取在 40 ～ 60℃最为合适;随着液体体积
的增加，乙醇溶液对黄酮类化合物的溶解能力也在
增加，当液料比达 1∶ 30 时，黄酮类化合物提取量最
大，随后再增加乙醇溶液体积，黄酮类化合物的提取
量有所下降。
·51·第 1 期
林 业 调 查 规 划
图 1 黄酮类化合物的组织化学定位结果
Fig. 1 Histochemical positioning results of flavonoids
综上所述，选用乙醇浓度(60%、70%、80%) ，
超声波萃取时间(15 min、20 min、25 min) ，萃取温度
(40℃、50℃、60℃) ，料液比(1∶ 25、1∶ 30、1∶ 35)4 个
因素进行正交实验，因素水平表见表 1 所示。选用
L9(3
4)正交试验表进行试验设计，实验结果及分析
见表 2 所示。
表 1 正交因素 －水平设计
Tab. 1 Orthogonal factors － horizontal design
水平
因素
乙醇体积分数
/% A
萃取温度
/℃ B
超声萃取时间
/min C
料液比
/(g·mL －1)D
1 60 40 15 1:25
2 70 50 20 1:30
3 80 60 25 1:35
表 2 正交试验结果与分析
Tab. 2 Oorthogonal test results and analysis
试验号 A B C D
黄酮的含量
/(mg·g － 1)
1 1 1 1 1 4. 40
2 1 2 2 2 6. 13
3 1 3 3 3 3. 12
4 2 1 2 3 6. 08
5 2 2 3 1 9. 41
6 2 3 1 2 7. 40
7 3 1 3 2 4. 46
8 3 2 1 3 5. 64
9 3 3 2 1 4. 56
K1 13. 65 14. 94 17. 44 18. 37
K2 22. 89 21. 18 16. 77 17. 99
K3 14. 66 15. 08 16. 99 14. 84
R 3. 08 2. 08 0. 23 1. 18
从表 2 中极差值(R)可以看出，影响黄酮类化
合物提取量的因素顺序是乙醇体积分数 ＞萃取温度
＞料液比 ＞超声萃取时间，因此可以确定超声萃取
时间对充分提取野龙竹茎中黄酮类化合物具有重要
意义。超声波辅助萃取黄酮类化合物最佳萃取条件
是 A2B2C1D1，即乙醇体积分数为 70%，萃取温度为
50℃，超声萃取时间为 15 min，料液比为 1 ∶ 25。为
验证此结果，设置 3 个重复，按此最佳工艺条件对野
龙竹的茎进行黄酮类化合物的提取，每次测得的结果
基本稳定，黄酮类化合物含量平均为 10. 36 mg /g。
3 结论
经对照和 3 种试剂染色结果得出，野龙竹茎中
黄酮类化合物主要分布在表皮层、表皮层内部以及
维管束周围。与谭玲玲［10］和李晓丹［11］等人的研究
结果相似。通过研究，可初步确定野龙竹茎中黄酮
类化合物的分布状况，以期为研究野龙竹茎中黄酮
类化合物的合成、运转的途径提供理论依据。
通过单因素实验和正交实验结果表明，超声波
萃取法对野龙竹竹茎中的黄酮类化合物的萃取效果
很好，其因素影响顺序为乙醇体积分数 ＞萃取温度
＞料液比 ＞ 超声萃取时间，最佳萃取工艺条件为
A2B2C1D1，即乙醇体积分数为 70%，萃取温度为
50℃，超声萃取时间为 15min，料液比为 1 ∶ 25，在此
条件下黄酮类化合物的萃取量为 10. 36 mg /g。超
声波萃取法具有省时、高效、节能、提取杂质少等特
点，是提取黄酮类化合物较为理想的方法，具有一定
的应用前景。
参考文献:
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( 下转第 21 页)
·61· 第 38 卷
何小芳，等:武汉市金银湖水鸟多样性及其与栖息环境的初步研究
生境进行恢复，增加湿地生境的多样性。
4)加强对金银湖湿地的监管，对湖区周边居民
特别是周边餐饮店经营者进行爱鸟以及环保教育，
提高民众对环境保护的意识。并且健全相关法律法
规，将环境保护与水鸟保护提高到法律层面。相关
部门应加强对金银湖湿地的巡管力度和保护管理
力度。
5)停止对湿地的蚕食行为。近几十年来，金银
湖湿地面积急剧缩小，保护湿地、爱护环境是每一个
公民的责任。停止对湿地的蚕食行为，需要依靠当
地政府以及金银湖湿地相关的管理部门，加强对湿
地的保护，让后人能有一片清水。
参考文献:
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