全 文 :第 32 卷 第 11 期 嘉应学院学报(自然科学) Vol. 32 NO. 11
2014 年 11 月 JOURNAL OF JIAYING UNIVERSITY(Natural Science) Nov. 2014
短穗鱼尾葵果实原花青素粗提物的树脂纯化
张 镜,刘少娜,黄思梅
收稿日期:2014 - 07 - 22
基金项目:广东省科技计划项目(2009B011300015)
作者简介:张镜(1957 -),男,重庆市人,教授,硕士,主要研
究方向:天然产物与应用微生物.
(嘉应学院 生命科学学院,广东 梅州 514015)
摘 要:短穗鱼尾葵果实产量大、原花青素含量高,研究短穗鱼尾葵原花青素的树脂纯化技术,为其开发利用提供
试验依据.通过 5 种大孔吸附树脂供试,筛选出的 DS401 在 25℃对短穗鱼尾葵原花青素的饱和吸附量为
45. 42mg /g、解吸率为 89. 91% . DS401 树脂在粗提物溶液 pH 5、温度 45℃、吸附时间 4. 5 h对原花青素吸附的效果
好,以 80%乙醇为解吸液、解吸液 pH = 8、温度 45℃进行 DS401 树脂吸附原花青素的解吸效果最佳.以体积分数
80%的乙醇溶液、0. 75BV /h流速动态洗脱,在 2. 5 BV的洗脱峰中原花青回收率为 93. 90%,洗脱时间 4. 5 h.
关键词:短穗鱼尾葵;果实;原花青素粗提物;大孔吸附树脂;纯化
中图分类号:R392. 8 文献标识码:A 文章编号:1006 - 642X(2014)11 - 0059 - 07
短穗鱼尾葵(Caryota mitis),又称丛生鱼尾葵、
酒椰子,为棕榈科鱼尾葵属常绿小乔木,高 5 - 8
米.喜温暖,生长适宜温度为 18℃ - 30℃,较耐寒,
对光线适应性强,抗旱能力较强,中国南方种植数
量大.目前,短穗鱼尾葵主要用于绿化、观赏及肉质
茎的加工等[1]. 短穗鱼尾葵果实产量高,且几乎终
年果实次第成熟.文献表明短穗鱼尾葵果实内总酚
含量很高[2],原花青素的含量亦丰富,是开发天然
活性产物难得的资源[3]. 迄今,国内外未见短穗鱼
尾葵果实原花青素分离纯化的研究报道.
大孔吸附树脂具有稳定性高、选择性强、处理
量大、再生方便等优点,在天然活性产物工业化提
取分离中广泛应用[4 ~ 6].本研究以 5 种大孔吸附树
脂供试,从中筛选出对短穗鱼尾葵果实原花青素吸
附量大、解吸率高的树脂种类,研究其吸附量与解
吸率的主要影响因子,获得短穗鱼尾葵果实原花青
素大孔吸附树脂纯化的技术条件,为其原花青素资
源开发奠定基础.
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器
1. 1. 1 材料与试剂
采摘果皮颜色褪绿及淡红色短穗鱼尾葵果实,
剔除杂质和腐烂变质的果实,自来水洗净后晾干果
面余水,冷冻干燥,粉碎,80 目过筛粉末低温保存
备用.
试验用乙醇、正丁醇、HCl、NaOH、FeNH4(SO4)2
·12H2O 等,均为分析纯. 供试的 DS401、AB - 8、
D101、DA201、DM301,均为天津树脂厂生产.
1. 1. 2 仪器与设备
BT2KXL 冻干机(美国 Virtis 公司);U - 2800
紫外 -可见分光光度计(日本日立公司);PHS - 2C
酸度计(上海智光仪器表有限公司);FA2004 电子
分析天平(上海精天电子仪器厂);JLL28 - B 低速
大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂).
1. 2 供试样品的制备
1. 2. 1 原花青素粗提物
短穗鱼尾葵果实粉末与 75% 乙醇溶液
(pH =2)以 1:5 的料液比混合,室温浸提 2. 5h,
4500r /min离心 20min,上清液冷冻干燥得棕红色粉
末状原花青素粗提物.
1. 2. 2 原花青素的含量测定
以铁盐催化法进行原花青素显色及测定含
量[7].取 1 mL原花青素粗提物溶液于比色管中,依
次加入 6 mL 正丁醇 - 盐酸溶液(95:5,V /V)及
0. 2mL2%硫酸铁铵溶液,沸水浴 40min 后迅速冷
却,以蒸馏水代替样液为参比,测定处理液 A546nm
值,按公式(1)与(2)计算原花青素的含量(%)及
原花青素的质量(mg)
y = A × V ×7. 2W ×0. 366 × 100%, (1)
x = A × V ×7. 2P × 0. 366 × 100% . (2)
注:y—原花青素含量 /%;x—原花青素质量 /mg;A
546nm吸光度;V—稀释倍数;
W—样品质量(mg);0. 366—A1%1 cm在 546 nm处原
花青素的吸光度.
按上述方法测定供试粗提物样品原花青素的
含量为 10. 446%
1. 3 大孔吸附树脂的筛选
1. 3. 1 供试树脂的静态吸附
准确称取树脂湿基 2. 0g 装入 150mL 三角瓶
中,加入 2. 0%原花青素粗提物(原花青素含量为
0. 209%)样液 50mL,25℃、120r /min振荡 12h,充分
吸附后测定溶液吸光值,按公式(3)及(4)计算树脂
吸附量与吸附率.
Qe =(C0 - C1)V /W, (3)
Ee(%)=(C0 - C1)/C0 × 100. (4)
注:Qe -树脂吸附量(mg /g);C0 -吸附前溶液中原花青
素的质量浓度(mg /mL);C1 -吸附后溶液中原花青素的质
量浓度(mg /mL);V -溶液体积(mL);W -树脂湿重(g);Ee
-吸附率.
1. 3. 2 吸附原花青素的解吸试验
取 1. 0g原花青素吸附饱和树脂于 150mL 三角
瓶中,各加入 70% 乙醇溶液 50mL,保鲜膜封口,
25℃、120r /min振荡 12h,取样测定溶液的吸光值,
按公式(4)及(5)计算树脂的解吸量与解吸率.
Qd = C2V /W, (5)
Ed(%)= Qe /Qd × 100. (6)
注:Qd -树脂解吸量(mg /g);C2 -解吸液中原花青素的
质量浓度(mg /mL);V -溶液体积(mL);Ed -解吸率.
1. 4 树脂吸附性能的主要影响因素
1. 4. 1 温度与吸附量的关系
准确称取树脂湿基 2. 0g 装入 150mL 三角瓶
中,加入 1. 0%原花青素粗提物样液 50mL,分别置
于温度设置为 15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、
45℃和 50℃振荡器,振荡 120r /min,每 30min 取样,
正丁醇 -盐酸显色后测定处理液 A546nm值.
1. 4. 2 温度与吸附平衡时间的关系
准确称取树脂湿基 1. 0g 装入 150mL 三角瓶
中,加入 1. 0%原花青素粗提物样液 50mL,分别置
于温度设置为 15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、
45℃和 50℃振荡器,振荡 120r /min,每 30min 取样,
正丁醇 -盐酸显色后测定处理液 A546nm值.
1. 4. 3 pH与树脂吸附量的关系
准确称取树脂湿基 1. 0g 装入 150mL 三角瓶
中,分别加入 pH =1、2、3、4、5、6、7、8 和 9 的 1. 0%
原花青素粗提物溶液 50mL,置于振荡器内 25℃、
120r /min振荡 6h,正丁醇 -盐酸显色后测定处理液
A546nm值,计算吸附量.
1. 5 树脂吸附原花青素的解吸
1. 5. 1 乙醇浓度与解吸效果的关系
准确称取 1. 0g 已吸附原花青素的树脂湿基装
入 150mL三角瓶中,分别加入不同体积分数的乙醇
溶液 50mL,25℃、120r /min 振荡 12h,测定处理液
A546nm值.
1. 5. 2 温度对解吸性能的影响
准确称取 1. 0g 已吸附原花青素的树脂湿基装
入 150mL三角瓶中,加入 90%乙醇溶液 50mL,于设
定温度下 120r /min振荡 12h,取样正丁醇 -盐酸显
色后测定处理液 A546nm值.
1. 5. 3 pH对解吸性能的影响
准确称取 1. 0g 已吸附原花青素的树脂湿基装
入 150mL三角瓶中,分别加入不同 pH 值的 90%乙
醇溶液 50mL,25℃、120r /min 振荡 12h,正丁醇 -盐
酸显色后测定处理液 A546nm值.
1. 5. 4 解吸正交试验
分别称取已吸附原花青素的树脂湿基 1. 0g,以
解吸温度、乙醇浓度及溶液的 pH 值进行 3 因素、3
06 嘉应学院学报(自然科学) 2014 年 11 月
水平正交试验,正交试验设计如下:
表 1 正交试验设计
水平 A B C
1 35 70 7
2 40 80 8
3 45 90 9
注:A.温度 /℃,B.乙醇浓度 /%,C. pH值
1. 6 吸附原花青素的动态解吸试验
树脂与 10%原花青素粗提物溶液按 1:10 比例
混合,25℃吸附 6h后取出,以 2 倍体积的蒸馏水漂
洗 60s,准确称取 20g 吸附饱和的树脂装入 2cm ×
10cm的层析柱,分别以 0. 50、0. 75、1. 00、1. 25 及
1. 50 倍柱床体积流速洗脱,以 10mL 为 1 流份收集
洗脱液,共收集 15 流份,洗脱液正丁醇 -盐酸显色
后测定处理液 A546nm值.
1. 7 处理重复及数据分析
各处理重复 3 次,以 SPSS 11. 0 进行数据处理,
3 次重复数据平均值以 excel 作图,以 Duncans'法进
行差异显著性分析,P < 0. 0 5 表示差异显著,
P < 0. 0 1表示差异极显著.
2 结果与分析
2. 1 供试树脂的吸附量与解吸率
5 种树脂对短穗鱼尾葵果实原花青素均具有一
定的吸附能力,其中 AB -8 与 DS401 的吸附能力与
解吸能力较好,2 种树脂的吸附量 45. 29、45. 42
mg /g,差异不显著. 其次是 D101,吸附量 42. 24
mg /g,与上述 2 树脂差异显著. 树脂 DA201 及
DM301 的吸附量更低. AB - 8 与 DS401 树脂上的短
穗鱼尾葵果实原花青素的解吸率高,分别为
87. 89%及 89. 91%,两者无显著差异. 而 D101、
DA201 及 DM301 树脂上的原花青素的解吸率均较
低(表 2). 表明弱极性的大孔吸附树脂 AB - 8 与
DS401 都较适合短穗鱼尾葵果实原花青素的纯化,
其中 DS401 树脂上原花青素的解吸率更高,故以
DS401 树脂纯化短穗鱼尾葵果实原花青更佳.
虽然 DS401 与 AB -8 在 25℃下对短穗鱼尾葵
果实原花青素的饱和吸附量相当,但 AB - 825℃下
对山 竹 壳 原 花 青 素 的 静 态 饱 和 吸 附 达
76. 40mg /g[8],高于对短穗鱼尾葵果实原花青素吸
附量,表明短穗鱼尾葵果实原花青素与山竹壳原花
青素为结构不同的原花青素.
表 2 供试树脂静态吸附与解吸效果
树 脂
吸附量
(mg /g湿基)
解吸量
(mg /g湿基)
解吸率
(%)
AB - 8 45. 29a 39. 92a 87. 89a
DS401 45. 42a 38. 00a 89. 91a
D101 42. 24b 24. 64b 58. 34b
DA201 39. 16c 11. 46c 28. 26c
DM301 37. 68c 3. 74d 9. 92d
2. 3 温度与原花青素吸附量与吸附平衡时间的关系
2. 3. 1 温度对原花青素吸附量
图 1 表明在 15℃ ~ 50℃内 DS401 树脂对原花
青素的吸附量随温度的升高而增大,45℃的吸附量
为 65. 637mg /g、50℃的吸附量 67. 791 为 mg /g,其
吸附分别为 25℃吸附量的 133. 937%及138. 332%,
两者差异不显著.但 50℃吸附量较 35℃吸附量的差
异显著、较 30℃以下的差异极显著. 试验结果与张
泽生等的研究结果相近[9],而 DS401 对短穗鱼尾葵
原花青素的吸附量低于 AB - 8 对山楂果中原花青
素的吸附量[6].而 LS300 大孔吸附树脂树脂对月柿
原花青素的吸附 50℃的吸附量几乎较 30℃的吸附
量高 1 倍[10],两者差异远大于本实验的结果,表明
短穗鱼尾葵原花青素的结构和性质不同于上述 2
类原花青素.
图 1 温度与吸附量的关系
16第 32 卷第 11 期 张 镜,刘少娜,黄思梅 短穗鱼尾葵果实原花青素粗提物的树脂纯化
结果表明吸附体系的温度对原花青素在固相
与液相的分配影响极大,提高吸附体系的温度可明
显提高树脂对原花青素的吸附量,降低吸附后液中
原花青素的残留量,有利于提高穗鱼尾葵原花青素
的得率.
2. 3. 2 温度对原花青素吸附平衡时间的关系
DS401 树脂 1g 湿基与 1%短穗鱼尾葵原花青
素粗提取物 50mL 混合,不同温度下进行静态吸附
结果如图 2 所示.由图 2 看出温度与吸附平衡时间
的关系是在 15 ~ 30℃内,温度越低吸附平衡时间越
长,当温度升为 30℃时吸附平衡时间由 15℃的 7h
缩短为 4. 5h,但在 35 ~ 50℃吸附温度对吸附平衡时
间无明显的影响,吸附平衡时间与 30℃无明显差
异.表明吸附体系的温度 30℃以上时,吸附平衡时
间为 4. 5h.
图 2 温度与吸附平衡时间的关系
2. 4 pH对吸附性能的影响
由图 3 可知,当原花青素粗提物溶液的 pH在 1
~ 5 时,树脂对原花青素的吸附量随 pH值增大而提
高,pH5 时对原花青素的吸附量为 56. 52mg /g,但当
pH值继续上升时,吸附量先下降后在 pH8 时又开
始上升,pH9 时的吸附率 52. 04mg /g,且与 pH7 的吸
附量差异显著(p > 0. 05).这与大多数文献报道的
植物活性物质要达到较好的吸附效果一般是在酸
性条件下被吸附具明显差异[11 ~ 12]. 有文献报道原
花青素的稳定性受 pH影响,在碱性条件下不稳定,
随着 pH的升高易发生分解[13],使吸附后液的吸光
值降低,从而造成计算所得的吸附量增加,而 DS401
树脂对短穗鱼尾葵原花青素的吸附量在 pH9 时大
于 pH7 的吸附量,显然不是由于碱性条件下原花青
素的分解,而应该与原花青素的性质有关.
图 3 不同 pH对吸附效果的影响系
2. 5 温度对原花青素解吸的影响
吸附原花青素的 DS401 树脂不同温度解吸试
验的结果如图 4 所示,在 15℃ ~ 45℃温度范围内,
随着温度的上升解吸液的吸光值升高,45℃解吸解
吸液的吸光度为 0. 981,50℃解吸解吸液的吸光度
值为 0. 846,较前者低 13. 761% . 45℃解吸解吸液的
吸光度较 40℃与 50℃解吸解吸液的差异均极显著
(p > 0. 01).
图 4 不同温度对解析效果的影响系
2. 6 pH对解吸的影响
pH7 时解吸液静态解吸 DS401 吸附的原花青
素,溶液的吸光值 1. 171,为各处理间的最大吸光
26 嘉应学院学报(自然科学) 2014 年 11 月
度,与其余处理吸光度的差异极显著,结果表明中
性条件有利于 DS401 吸附的短穗鱼尾葵果实原花
青素的解吸,与文献报道原花青素以洗脱液
pH =6. 3为适宜洗脱条件的结果相似[14].
图 5 不同 pH值对解析效果的影响系
2. 7 乙醇浓度对解吸的影响
从图 6 看出,乙醇体积分数在 30% ~ 70%范围
内,解吸液吸光值变化明显,各处理的吸光值差异
显著(p > 0. 05),而乙醇体积分数在 70% ~90%后
吸光值增加不明显,结果表明乙醇体积分数 70%解
吸原花青素的效果最佳.
图 6 不同浓度洗脱液的解析效果
2. 8 静态解吸正交试验结果
根据单因子试验结果,以解吸温度、乙醇浓度
及解吸液 pH值进行 3 因素 3 水平正交试验. 结果
表明极差最大的是解吸液乙醇的浓度,即是不同浓
度乙醇解吸效果差异最大,其次是解吸的温度. 试
验结果显示,静态解析最优条件组合为 A3B2C2,即
在乙醇浓度为 80%、温度 45℃及洗脱液 pH = 8(表
3).虽此解吸条件的解吸效果为佳,但若解吸液直
接干燥,因除去溶剂后 NaOH仍存留于干燥物内,干
燥物将为强碱性对提取的原花青的稳定性极为不
利,因而干燥前解吸液的 pH应先以 HCl调为中性.
表 3 原花青素解吸正交试验结果
试验号
A B C
温度 /℃ 乙醇浓度 /% PH值
A546nm
1 35 70 7 0. 387
2 35 80 8 1. 128
3 35 90 9 0. 568
4 40 70 8 0. 413
5 40 80 9 1. 127
6 40 90 7 1. 259
7 45 70 9 0. 428
8 45 80 7 1. 175
9 45 9 8 1. 325
k1 0. 694 0. 409 0. 940
k2 0. 933 1. 143 0. 955
k3 0. 976 1. 051 0. 708
R 0. 282 0. 734 0. 247
2. 9 动态解吸试验结果
吸附原花青素的树脂装入层析柱内,洗脱液流
速与原花青素的解吸效果如图 7 所示.洗脱速率越
小原花青素的洗脱峰越窄,洗脱效果越好. 以0. 5倍
柱床体积流速洗脱中第 7 ~ 10 流份的流出液中原花
青素的共 842. 61mg,占 15 流份原花青素总
936. 30 mg的 89. 99%,且洗脱峰无明显拖尾,主峰
洗脱总体积约为柱床体积的 2 倍,至第 10 流份洗脱
液收集结束的洗脱耗时 5h.而 0. 75BV /h 积流速洗
脱中第 5 ~ 9 流份的洗脱液原花青素的共 879.
24mg,占 15 流份原花青素总 936. 31mg的 93. 90%,
主峰洗脱总体积为柱床体积的 2. 5 倍,至第 9 流份
洗脱液收集结束的洗脱耗时 4. 5h,其原花青素的洗
脱峰形亦较好,仅稍有拖尾. 而 1BV /h、1. 25 BV /h
及 1. 5BV /h洗脱的都拖尾明显. 流速 0. 75BV /h 的
36第 32 卷第 11 期 张 镜,刘少娜,黄思梅 短穗鱼尾葵果实原花青素粗提物的树脂纯化
洗脱峰形虽较 0. 5BV /h 的宽,但解吸的时间较短,
且原花青素的回收率较高,因而解吸流速以
0. 75BV /h较为理想.
图 7 不同流速对解析效果的影响
3 讨论与结论
3. 1 短穗鱼尾葵原花青素纯化静态吸附为宜
以乙醇浸提短穗鱼尾葵果实原花青素,当除去
提取液有机溶剂后具较多的溶性沉淀.若提取液以
大孔吸附树脂动态吸附分离原花青素,需要在回收
溶剂后先离心、或过滤进行固液分离,然后才能将
液体上柱.以静态吸附法分离原花青素不仅可在溶
剂回收后的提取液直接加入树脂进行吸附,而且更
容易控制吸附体系的温度,提高树脂原花青素的吸
附量. 所以,短穗鱼尾葵果实原花青素提取液原花
青素的分离纯化以树脂静态吸附的工艺更适.
3. 2 短穗鱼尾葵原花青素树脂纯化参数
研究表明 DS401 弱极性大孔吸附树脂对短穗
鱼尾葵果实原花青素的吸附量最高、解吸效果最
佳,是短穗鱼尾葵果实原花青树脂纯化的适宜树
脂. DS401 树脂静态吸附短穗鱼尾葵原花青素在
45℃、pH =5 下吸附 4. 5h 时的吸附饱和. 树脂吸附
的原花青素以 80% 乙醇、pH = 8、温度 45℃、
0. 75VB /h解吸效果最好,从流出解吸液体积达柱床
体积 2. 5 ~ 4. 5 倍内的洗脱液,原花青素的回收率为
93. 90% .
3. 3 短穗鱼尾葵原花青素性质的特殊性
DS401 大孔吸附树脂在 25℃下对短穗鱼尾葵
原花青素的饱和吸附量,较 AB - 8 相同温度对山竹
壳原花青素的态饱和吸附量低 40. 72%[8];大多数
文献报道的植物活性物质要吸附效果以较低的 pH
下更好[11、12],DS401 树脂吸附短穗鱼尾葵原花青素
在吸附液 pH = 5 时量最大,而且 pH = 9 的吸附量
pH =5 时吸附量仅低 7. 93%,而高于 pH 值为 6 ~ 8
内的吸附.原花青素的稳定性受 pH影响,在碱性条
件下不稳定,随着 pH 的升高易发生分解[13],而
DS401 树脂对短穗鱼尾葵原花青素的吸附量在 pH
=9 时大于 pH = 7 的吸附量.以上结果表明短穗鱼
尾葵原花青素可能其性质与常见报道的其它原花
青的性质与结构有较大的差别.
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责任编辑:钟福生
Purification of Crude Procyanidins Extract from Caryota Mitis Lour Fruit by
Absorption Resin
ZHANG Jing,LIU Shao - na,HUANG Si - mei
(School of Life Sciences,Jiaying University,Meizhou 514015,China)
Abstract:Caryota mitis bears a lot of fruit annually and proanthocyanidins is full in the fruit yield. The research on
the purification technology of the crude procyanidins extract with resin is to provide the experimental basis for the
development and utilization. Procyanidins adsorption capacity of the DS401 rmacroporous resins was 45. 42mg g,
the desorption rate of 89. 91% with five kinds of macroporous resins for the tested at 25℃ . The optimal conditions
of DS401 adsorption of the procyanidins are pH 5,45℃ for 4. 5h. The optimal desorption conditions of the procya-
nidins on DS401 are with 80% ethanol as desorption agent,pH 8. 0 at 45℃ . The dynamic desorption procyanidin
was using 80% ethanol solution as desorption agent,flow rate 0. 75BV /h and pH 5. 0. The procyanidin recovery
was 93. 90% in the 2. 5 BV times main peaks,and desorpted for 4. 5h.
Key words:C. mitis;fruits;crude procyanidins extract;macroporous resin;purification
56第 32 卷第 11 期 张 镜,刘少娜,黄思梅 短穗鱼尾葵果实原花青素粗提物的树脂纯化