全 文 ：2 5 ( 2 ) 1 54
一 15 9 中 t目生物防治 C h in e se Jo u rn a l o f B io lo gi e a l C o n湘 l 2 0( 拍 年 5 月
马唐草新月弯抱生物学特性
及其代谢产物活性测定
杨 叶’ , 胡美妓2 , 王兰英’
( 1
. 海 南大学环境与植物保 护学院 , 循州 , 7 17 3 7 ;2 . 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 , 偷州 571 73 7)
摘要 : 对马唐草新月弯抱霉 C “ 。 以 a ira lu na ta (W ak ke r) Boe d ij n 菌株 M T 一01 1 的生物学特性测定
结果表 明 : 该菌株致病性强 , 菌丝体 生长最适温度 30 ℃ , 致死 温度 65 ℃ l/ o m in , 最适 p H 值 7 ,
碳源以 D一果糖最佳 , 氮源以硝酸钠最佳 。 产生分 生袍子最适温度 为 30 ℃ , 最适 p H 值 9 ,碳 源
以蔗糖产袍 t 最大 , 氮源 以赖氨酸产抱量最高 。 分 生袍子萌发 温度 在 2 0 一 40 ℃ 之 间没有差
异 , 萌发率均达 9 0 % 以上 ; 最适 p H 值 7 ; 光暗交替为最佳光照条件 。 除赖氨酸外所有供试碳
源和氮源的袍子萌发率都很高 , 处理之间没有差异 。 M T一01 1 菌株产生的活性 物质作用于马唐
草 , 可使 叶片黄化或枯死脱落 , 与用菌体接种时造成大量叶片黄化或枯萎的症状极 为相似 。 代
谢产物对指示植物柱花草 、 辣椒和玉米的种子发芽后的根茎生长都有明显的抑制作用 , 抑制率
达 83 . 2 7% ,表现 出很好除草活性 。
关 键 词 : 马唐草 ; 新月弯袍霉 ; 生物学特性 ; 除草活性
`卜图分类号 : 54 51 ; 54 76 . 19 文献标识码 : A 文章编号 : 10 5一92 61 (2 《X旧 ) 02 一01 59 一06
收稿 日期 : 2X() 8一05 一 12
基金项 目 : 海南省自然科学基金项 目 ( 30 305 ) ; 华南热带农业大学自然科学基金项 目 ( 2田 3)
作者简介 : 杨叶 (一9 70 一 ) . 女 , 硕士 , 副教授 , 电话 : 13 97硼 55 6 2 ; E 一 ma i l : 册 2 1@ t o m · c o m 。
115 1
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:
35 3 一 3 57
.
、 .J,.
,且2,儿`
r
l
Les
15 4
DOI : 10. 16409 /j . cnki . 2095 -039x . 2009. 02. 011
第 2期 杨叶等 : 马唐草新月弯抱生物学特性及其代谢产物活性测定
C h ar a ct eri s ti s cn adH er bi ei d目 A eti vi ty o f M ets bo l i t ePr o du c edy b
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( 1
.
E n v i or n m e n t a n d lP an t rDP
t e e it o n C o lle罗 , H a in a n U n iv e sr iyt , Da n z h o u 5 7 一7 37 ;
2
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E n v i or n m e n t an d P l
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A b s atr
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.
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.
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s 30 ℃ an d t h e l e t h al t e m p e art u er w as 6 5℃ / 10 m i n ; a m o n g e a ht o n a n d n i t or g e n
s o u代 e s , D 一 fur e t o s e a n d N a N 0 3 w e er b e s t fo r m y e e l iu m 脚wt h . hT e o p tim u m t e m p e ar t u er fo r s p o ur l a t io n
w as 30 ℃ , t h e o p t i m u m p H v al u e fo r s卯ur l a ti o n w as 9 . hT e s u e or s e a n d ly s i n e w e er g o o d fo r s p o ur la ti ( ) n .
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.
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,
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p at h o罗 n i ts e l f . hT e m e t ab o l i te e hx i bi t e d e xc e l le n t h e ht i e id al ac t iv it y a g a i n s t th e i n d i e a to r p l a n t s u e h a s
s ty l o s a n t h e s
, e a Ps i e u m an d e o m
,
an d th e i n hi b i ti o n pe 比 e n tag e w as 83 . 2 7 % .
K e y wo
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: C u二 u la ir a l u an t a (W a k k e r ) Boe d ij n ; b io lo ig e al e h a acr t e ir s ti e s ; he r b i e id a l a e t i v i ty
禾本科的马唐草 [ D衫 at ir a as gn iu an ils ( L . ) S co p」是世界性 的恶性杂草 。 海南由 于特殊的
气候条件 , 马唐草一年 四季均可生长 、 随处可见 ,给热带农业生产造成极大危害 ,并给人们生活
带来不便 。 同时 ,海南高温潮湿 的气候非常适宜于病原菌的发生 , 是微生物天然宝贵的资源
库 。 而杂草病原真菌作为杂草的天敌 ,对于生物除草剂的开发具有重要的研究价值 。 直接利
用活体微生物是传统生物除草剂的主要开发途径 , 即采用对杂草有强致病 力菌株的抱 子为有
效成分加工成制剂 。 在马唐生物防除研究方 面 , 有报道利用 4 隔膜 中间型弯抱霉 ( cu 二 ul ar i(l
而 enerZ d i。 )及马唐黑粉 菌 ( us it la g o 3yn the 心~ )作为马唐生防菌剂 〔’
,
2 )
。 但随着杂草微生物防
治研究的不断深人 ,许多学 者发现一些杂草病原菌所产生的代谢 产物 具有很 高的除 草活性
对杂草病原菌产生的代谢产物的除草活性及毒素分离纯化等方面进行研究分析 , 从病原 真菌
中寻找除草活性物质开发抗生素除草剂或 以其为模板进行仿生合成 , 已 成为除草剂研 究开发
的热点 。 如姜述君等 f ’ 」研究 了画眉草弯抱霉 ( c 渭怂g 阳“ ids )毒素对马唐 的抑制作用 ; 李海涛
等 [ 4 ]研究发现麦瓶草寄生疫霉 ( hP ” op ht ho ar aP o it ic 。 )的无菌培养滤液具有开发为微生物除 草
剂的潜力 。 因此 ,研究病原菌代谢产物的除草活性具有重大意义 , 以其开发的微生物源 (抗生
素 )除草剂 ,还可克服病菌活体应用中的不足 ,具有生产流程相对简单 、易操作 的特点 。
从 2 0 3 年开始 ,作者对海南常见杂草病原真菌资源进行调查 , 获得具有强致病力的菌株
M T
一
01 1
, 鉴定为新月弯抱霉 [ uC 二“ al ir a lu耐 a ( Wak ker ) oB de ijn 〕, 并进行生物学特性及代谢产
物除草活性等研究 , 对其生防价值进行初步评估 , 为今后进一步深人研 究 、 开发出具有实用价
值的微生物源除草剂提供依据 。
15 5
中 国 生 物 防 治 第 25 卷
1 材料与方法
1
.
1 马唐草叶斑病菌菌株的致病性测定
将野外健康的马唐草幼苗连土挖 回实验室 ,移栽于花盆中种植 20 一 3d0 后备用 。
1
.
1
.
1 菌丝块的致病性测定 用金刚砂将马唐草叶子轻轻磨伤 , 在培养 d7 的 M不 0 1 菌落边
缘打取菌块 (直径 6 m m )并接到磨伤处 ,接无菌的培养基块为对照 ,共接种 5 盆 马唐草 ,每盆至
少接种 2 0 点 。 采用套塑料袋的方式进行保湿 。 d2 后开始检查发病情况 。
1
.
1
.
2 袍子悬浮液的致病性测定 分别将 l x l护 / inl 的抱子悬浮液喷雾接种到健康马唐草上
(共接 16 盆 ) 。 用清水喷雾为对照 。
1
.
1
.
3 代谢产物的致病性测定 将菌块接种到 PD A 液体培养基 ( 10 耐 / 瓶 ) ,每瓶接 10 块 , 共
接 巧 瓶 。 置于 28 ℃恒温箱中振荡培养 7 d 后 ,将菌丝体挑出滤纸过滤 , 过滤液再用微孔滤膜过
滤 ,得到不含菌体的代谢产物滤液 。 然后喷雾接种到健康马唐草 (共接 16 盆 ) , 其他 同上 。
1
.
2 环境条件及营养对 M T 一 o n 菌株的影响
1
.
2
.
1 光照 取直径 6 m m 的菌块 , 放在 P D A 培养基的中央 ,分别置于连续光照 、 光暗交替和
完全黑暗 3 种光照条件下 ,置于 28 ℃恒温培养箱 中连续培养 。 d3 后用十字交叉法测量菌落直
径 , 培养 d6 后 ,用血球计数板法测量其产抱量 。 每个处理 3 个培养皿 ,试验重复 3 次 。
把熔化的 l %琼脂在灭菌载玻片上涂片 ,凝 固备用 。 每支菌种加入 2耐 0 . 1% 吐温溶液 (无
菌水配制 )洗下抱子 ,抱子悬 浮液浓度 以 巧 0 一 2 0 个 /而 为宜 ,将 其涂在有琼脂 的载玻 片上 。
分别设全光照 、 全黑暗和光暗交替 3 种处理 , 放人 28 ℃培养箱中保湿培养 4 . h5 。 每个处理 3
个玻片 , 试验重复 3 次 。 每个玻片上检查抱子 10 个左右 ,检查之前先滴希尔液固定 。
1
.
2
.
2 温度 将菌块分别置于 20 、 25 、 30 、 35 和 40 ℃的恒温培养箱中培养 d3 后 ,用十字交叉法
测量菌落直径 。 培养 d6 后 , 用血球计数板法测量产抱量 。 每处理 3 皿 ,试验重复 3 次 。
同 1 . 2 . 1 方法配抱子悬浮液 ,涂抹于带琼脂的载玻片上 ,再分别放置在 20 、 25 、 30 、 35 、 40 ℃
恒温培养箱 中保湿培养 4 . h5 。 每个处理 3 个玻片 ,试验重复 3 次 。
菌丝致死温度的测定 : 移取 l 个菌块到无菌试管中 ,加人 Z iln 灭菌水 ,置 于 40 、 45 、 50 、 5 、
60
、
65 ℃的恒温水浴锅中加热 10 而 n ,取出后立 即在冰水 中冷却至室温 。 将处理后的菌块接种
到 PD A 平板上 ,置于 28 ℃恒温培养箱中培养 d3 后 ,用十字交叉法测量菌落直径 。 培养 d6 后 ,
用血球计数板法测量其产抱量 。 每处理 6 个菌块 ,试验重复 3 次 。
1
.
2
.
3 p H 值 用 l mo l / L 的 N a o H 和 H C I ,将 DP A 培养基的 p H 值分别调节为 4 、 5 、 6 、 7 、 s 、 9 、
10
, 制成不 同 p H 值的固体平板备用 。 将 0 . 1% 吐温溶液用同样方法将 p H 值分别调为 4 、 5 、 6 、
7
、
8
、
9
、
10
。 在每支菌种分别加 Zd 不 同 p H 值 的溶液 , 将抱子洗下配制成抱子悬浮液 , 充分振
荡后倒入灭菌小烧杯中备用 。 其他 同上 。
1
.
2
.
4 碳源 以 c az pe k 培养基为基础 ,用含有相同质量碳元素的甘油 、 葡萄糖 、 果糖和木糖取
代其中的蔗糖 , 做成不同碳源固体培养基 , 以不加碳源作为对照 。 其他同上 。
分别将蔗糖 、 葡萄糖 、 果糖 、木糖和甘油溶解于灭菌水 , 配成碳源为 5 % 的营养液 , 将抱子
洗下配制成抱子悬浮液 , 充分振荡后倒人灭菌小烧杯中备用 。 其他同上 。
1
.
2
.
5 氮源 以 c az pe k 培养基为基础 ,用含有相同质量氮元素的蛋白陈 、 甘氨酸 、 赖氨酸和抓
化按取代其中的硝酸钠 , 以不加氮源作为对照 ,制成不同氮源的固体培养基 。 其他同上 。
分别将硝酸钠 、 蛋 白脉 、 甘氨酸 、 赖氨酸和氯化按溶解于灭菌水 中 , 配成氮源为 5% 的营养
15 6
第 2 期 杨叶等 : 马唐草新月弯抱生物学特性及其代谢产物活性测定
液 ,将饱子洗下配制成抱子悬浮液 , 充分振荡后倒人灭菌小烧杯 中备用 。 其他同上 。
1
.
3 除草活性测定
采用种子萌发鉴定法 。 将指示植物玉米 、虹豆 、 黄瓜 、 辣椒 、 柱花草的种子用清水洗净 , 放
人干净的瓷盘中于 28 ℃的培养箱 中保湿催芽 。 待种子萌发露 白后 ,将露 白一致的健康种 子放
人铺有滤纸的培养皿 , 每皿 10 粒 ,滴加代谢产物滤液 (制备方法见 1 . 1 . 3 ) 。 以未接种的液体培
养基为对照 ,每种处理 3 个皿 ,试验重复 3 次 。 置于 28 ℃培养箱 中培养 3 一 d5 , 测量胚根 、 芽 长
及称重 ,计算代谢产物对种子发芽后生长的抑制率 。
2 结果与分析
2
.
1 致病性测定
M -T o l l 菌株分生抱子梭形 ,大小 ( 16 一 2 0产m ) / ( 10 一 12拌m ) (图 一) 。 M T一 0 11 菌株菌丝块接
种马唐草后 2(l 就可观察到轻微病变 ,在接种处变黄 ,随后病斑转变为黄褐色 , 并向四周扩散 ,
病斑中间灰黑色 。 培养 d4 后的平均发病率达 94 . 82 % , 说明此菌对 马唐草具有较强的致病力
(图 2 ) 。 抱子悬浮液接种 3 d 后出现症状 ,在叶片上 出现椭圆形病斑 ,具有明显黄色晕圈 , 严币
时多个病斑汇合成长条状 , 叶片褪绿变黄 ,病情随着培养时间的延长而加重 。
图 1 马唐草叶斑病菌新月弯抱 . 圈 2 M T . o n 菌株 菌丝块致病性侧定 圈 3 M -T o l 菌株代谢产物致病性测定
M T
一
01 1 菌株代谢产物喷施马唐草后 ,第 d3 开始出现受害症状 , 表现为叶片褪绿 、 黄化 , 光
合作用受阻 , 与用菌体接种时造成大量叶片黄化或枯死脱落的症状极 为相似 。 磨伤 与不磨伤
处理之间的差异不大 。 病情随着时间延长加重 , d9 后马唐草逐渐枯死 ( 图 3 ) 。
2
.
2 环境条件及营养对 M -T o n 菌株的影响
2
.
2
.
1 光照 3 种光照处理对 M T 一 0 1 菌株菌丝体生长 、 产抱 的作用差异均不显 著 (表 l ) 。 但
抱子萌发率以光暗交替最高 , 连续黑暗和光暗交替两种处理差异达极 显著 ; 且在形态观察时
发现 ,经光暗交替处理的抱子萌发芽管最长 ,连续黑暗的芽管最短 。
表 l 不同光照对 M-T On 菌株的影响 ( 4 h)
光处理条件 菌落直径 ( c m ) 产抱量 (个 / m l) 抱子萌发率 (% )
连续黑暗 5 . 0 1 以 5 . 6 3 x 一护 a A 82 . 2 5 b B
连续光照 5 . 12 -aA 7 . 77 x l 07 a A 9 2 . 4 3 曲 A B
光暗交替 s l4 aA 2 . 57 x l 07 叭 9 5 . 3 7 a A
注 : 表中小写字毋表示差异显著 ( p < 。 . 0 5 ) ,大写字母表示 差异极 显著 ( p < 0 . 01 ) . 下同 。
2
.
2
.
2 温度 M T 一01 1菌株在 4 0 ℃下不能生长 , 菌丝体生长的最适温度为 30 ℃ , 30 ℃与其他温
度处理存在极显著差异 (表 2 ) ; 最适产抱温度为 30 ℃ ,与其他温度处理达极显著差异 ; 而抱子
萌发在各处理间差异不显著 ,但在 25 ℃时抱子萌发率最 高 ,并且抱子萌发的芽管长度在所有
15 7
中 国 生 物 防 治 第 25 卷
处理中最长 。 由此可见 , 25 ℃为 M T 一 0 1 菌株抱子萌发的最适温度 。
衰 2 不 同沮度对 M T . o l 菌株的影晌
乱度 菌落直径 产抱星 抱子萌发率 } 温度 菌落直径 产, ` , 子萌发率
(℃ ) (《 : m ) (个 / m l ) (% ) } (℃ ) ( c m ) (个 / m l ) (% )
20 3
.
2 4 0
.
369 x l口 c B 9 1 . 6 3 a A
{
, , ` · ` , · , ,” · ,” ’ 阮 B ” · , 6 ·`
2 5 4
.
77 3
.
(巧心 x 107 b B 9
.
38 aA
}
` 0 “ c B % . “ “ `
30 5
.
46 6
.
67 0 x 107
a A 9 7
.
76 aA
菌丝体致死温度的测定 : 经过 60 ℃水浴处理 10 而 n 后 ,菌丝还有活力 ,能在 PD A 上形成菌
落 ,培养 d3 的菌落 直径 3 . o c m ; 而经 65 ℃水浴处理 or m in 后 , 不能在 P D A 上形成菌落 。 说明
M T
一
0 1 1菌株的致死温度 为 6 5 ℃处理 I Om i n 。
2
.
2
.
3 p H 值 M T 一01 1菌株在 p H 值 5 一 8 之间的菌落直径差异均不显著 (表 3 ) 。 菌丝体生长
的酸碱适宜范围是 p H S 一 8 ,最适 p H 值 7 ; p Hg 时产抱最多 ; p H 6 一 8 的抱子萌发率没有显著差
异 。 在形态观察时发现 , p H7 时抱子萌发的芽管长度是所有处理 中最长的 。
衰 3 不同 p H 值对 M-T On 菌株的影晌
二 ,J 菌落改径 产抱 坡 抱子萌发率 二 * 菌落直径 产抱 量 抱 子萌发率
I,” 11 1 (。 m ) ( 个 / m l ) (% ) p” 但 ( 。 m ) (个 / 耐 ) ( % )
4 4
,
8 3 饭 A B C 0 . 69 3 x l 07 b A % . 7 7 b C 8 5 . 3 6 ab A 0 . 7 89 x l07 b A 9 8
.
70 aA B
5 5
.
4 l
a A l
.
07 0 x l 0
7
ab A 96
.
63 b C 9 4
.
5 8
e B C 2
.
[ 40
x l 0 , a A 97
.
38 b B C
6 5
.
3 4
a
l
, A B 0
.
s l l x l 07 b A 98
.
9 8 a A 10 4
.
34
e C 1
.
2印 x l 07 曲 A 9 8 . 62 aA B
7 5
.
4 7
a A 0
.
g lo x l0
7
b A 9
.
O4 aA
2
.
2
.
4 碳源 在供试的 5 种碳源上 , M T 一 o n 菌株都可生长 , 其 中以 D 一果糖的菌 落直径最大 ,
与其他处理之间差异达极显著 ,其中甘油对生长有抑制作用 ; 产抱量最多的是蔗糖 , 与其他碳
源之间达极显著差异 ; 以葡萄糖的抱子萌发率最高 ,但与其他处理间没有显著差异 (表 4 ) 。
裹 4 不同碳派和撅源对 M T . o n 菌株 的影 晌
, , 菌落“ 径 产抱 址 抱子萌发率 } 氮源 菌怂” 11碧悬 抱亏黔率, ` (。 m ) (个 / m l ) (% ) …
I t油 1一。 。 I) 0 . 64 城 10 , e C D 97 .盯 曲 ^ B
{
` 化 ” “ 、 96 d C 。 · B , 9 , · , , · ^
葡萄搪 3 . 67 卜, B 2 . 2 4 x 一07 。 e n 卯 . 2s a^
}资空笋 4万 , “ B ’ ` , , ` ’代ab A g ,朋 aA
I)
一果糖 3 . 96 a A 7 . 4 7 x l0 7 b BC 9 8 . 24 a A }竺翌竺 4 · , , c B 7 4 , x ’代ab A 叭 · 8, aA
I工木械 3 . 3 9 挽 B 1 1 . 70 x l 07 b B 9 8 . 12 a^ {竺赘贾 5 45 “ A “ · 5 3 ` ’ o’ aA 70 42 ” B蔗精 3 , 5 6 玩 B 2 5 50 : 10 , 。 ^ 98 .男 a ^ { 阴酸俐 ” · 7 , “ A “ · 40 x ’ 0’ 曲 A 94 沼 g aA
对照 2 . 2 6 d C o . 16 x 一07 d e 92 · 04 b B } 对照 5石 1 a A 一印 x l 07 阮 ^ B 95 · 3 7 aA
2
.
2
.
5 氮源 供试氮源对 M T 一01 1菌株菌丝体生长影响较大 ,硝酸钠生长最好 , 但与对照无显
著差异 , 抓化按则有明显抑制作用 ; 除氯化钱处理不产抱外 ,其他处理如蛋白陈 、 甘氨酸 、 赖氨
酸 、硝酸钠之间产抱量没有显著差异 ; 除了赖氨酸的抱子萌发率极显著低于对照及其他处理 ,
其他氮源处理对 M T 一01 1菌株 的抱子萌发与对照之间没有显著差异 。
2
.
3 M -T ol l 菌株代谢产物的除草活性测定
结果 (表 5) 表明 : 含 M T 一 01 1菌株代谢产物的无菌滤液对 5 种供试植物种子发芽后的根茎
生长都有明显的抑制作用 , 特别是对 辣椒根茎 生长的抑制 率超过 83 % , 对重 量的抑 制率为
15 8
第 2期 杨叶等 :马唐草新月弯抱生物学特性及其代谢产物活性测定
4 9
.
8 6%
表 5 M-T ol l 菌株代谢产物对指示植物种子发芽后生长的抑制作用
科名 种名 学名 处理数 (粒 ) 根茎抑制率 (% ) 鲜重抑制率 (% )
89401692犯394豆科
禾本科
葫芦科
豆科
茄科
虹豆
玉米
黄瓜
柱花草
辣椒
价乡犯 s i
sen
自
Z已口 仍口户
C讹州厅山 3以`目“ 比
刘 os a nt肠
。 明 3ic unz 尹田 。 ce 。
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18
.
5 5
28
.
6 1
10 3 6
30
30
7 2 2 8
8 3 2 7
3 结论与讨论
微生物代谢产物开发为除草剂的关键在于大量发酵 的营养 、环境条件要求能否满足 。 试
验表明 M T一 0 1 菌株的生长速度快 、产抱量大 、致病性强 。 光照处理 以光暗交替最佳 , 菌丝体生
长 、 抱子萌发和产抱的温度及 p H 值范围均较广 , 菌丝的致死温度是 65 ℃ / 10 而 n ; 对菌丝生长 、
产抱及抱子萌发综合考虑 , 所有供试碳氮源除甘油和氯化钱不利于 M T 一 0 1 菌株生长繁殖 ,其
他营养物质均可利用 。 在对抱子萌发测定时 , 除了以有无萌发为标准进行显著性分析外 ,还对
抱子萌发后芽管的形态进行观察 ,对没有显著差异的处理进一步分析 ,使结果更加准确 。
前期研究工作发现 M T 一01 1 菌株的寄主范围广 , 对橡胶 、 香蕉等具有较强的致病性 , 因此对
于利用 M T一01 1菌株开发活体微生物除草剂就受到限制 。 然而其代谢产物具有很 高的除草活
性 ,在马唐草上的受害症状与用菌丝块或抱子悬浮液喷雾接种后发病相似 ,使叶片发生黄化甚
至是整株枯死 。 由于采集回来的马唐等杂草种子萌发率极低 ,不适宜于生物测定 ,所以选择一
些作物种子为指示植物 ,结果表明代谢产物对指示植物虹豆 、 玉米 、 柱花草 、辣椒和黄瓜的种子
发芽后的根茎生长都有明显的抑制作用 ,表现出很好 除草 活性 。 总的来说 , M T 一 01 1 菌株易人
工培养 ,对温度 、 p H 、光照及营养元素的要求不高 , 做为制剂开发的一些基本条件 比较容易满
足 , 同时该菌株代谢产物除草活性强 ,对于开发微生物源除草剂显示 良好的生防前景 。
致谢 : 本校植保专业毕业生陈园 、 邓冬贵 、 邢增益 、 尚静 、 黄伟安 、 刘志华 、 陈亚林 、 朱倩倩 、 张玉
檀和保增元做了大量工作 ,在试验过程中文衍堂教授给予细心指导 , 在此一并致谢 !
参 考 文 献
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