全 文 ：静息细胞连续两批次生物催化生产氢化可的松
易奎星!，杨亚力"，杨顺楷"
!
，肖 勇"，王忠彦!
（" #中科院成都生物研究所，成都 $"%%&"；! #四川大学生命科学学院，成都 $"%%$&）
摘 要：以新月弯孢霉（!"#$"%&#’& %"(&)&）的!级培养 "’ (的活菌丝作为 )"" 位羟基化生物催化剂，在选定的含有微
粒结晶甾体底物（% *!+，质量分数）",#，!"-二羟基孕甾-&-烯-.，!%-二酮的磷酸缓冲液（% *%/ 012 3 4，56 $ *%）介质体系
中，在经过连续两批次约 // (的转化反应，底物转化率可维持在较高水平，产物氢化可的松净收率可达 $%+；从菌
丝回收的底物 78可再利用。此工艺提高了生物催化剂的利用率，具有工业应用价值。
关键词：新月弯孢霉；氢化可的松；连续两批次生物转化；化合物 8；)"" -羟基化
中图分类号：79,, #" 文献标识码：: 文章编号："$,! ; .$,’（!%%/）%& ; %%&% ; %/
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氢化可的松（6LNV1S1VP@O1BM，6)）不仅是重要的
抗炎皮质甾体激素药物，还可作为制造其它几种高
效泼尼松龙皮质甾体药物的起始原料［"］，其生物合
成须经过 )"" -羟基化反应。)"" -羟基化反应在甾
体化合物生物合成中占有重要地位，也是最难以实
现的微生物转化过程之一。长期以来，国内外人们
怀着强烈的兴趣致力于甾体 )"" -羟基化的研究，以
求提高氢化可的松的产率，但成效不明显［!］。
我们在前一报道的工作基础上［.］，选用新月弯
孢霉（!"#$"%&#’& %"(&)& :8 . *&.’"）菌株和国内目前
一般采用的蓝色犁头霉（ ,-.’/’& 012#"%2& :8 . *$/）菌
株在 ! 4发酵罐进行一批式转化的比较实验（如图
"），获得 6) 收率前者为 $" *9+（对底物 78 计），高
于后者的 && *,+（对底物 78: 计），结果同前苏联学
! 收稿日期：!%%/-%9-!/
基金项目：云南丽江映化集团药业公司资助
作者简介：易奎星（"9’"-），男，硕士研究生，研究方向：工业微生物。
联系人：杨顺楷（"9&.-），男，研究员，从事工业微生物转化及酶法合成和加工过程研究。Z-0F@2：LFBCOG[ S@Y* FS * SB
D1U # !%%/
·&%·
生 物 加 工 过 程
)(@BMOM \1?VBF2 1Q R@15V1SMOO ZBC@BMMV@BC
第 . 卷第 & 期
!%%/ 年 "" 月
万方数据
者 !"#$%&%’(#)*)［+，,］，-./0’%1)［2，3］等的报道一致，在
此基础上，我们继续以新月弯孢霉菌株对 43!，546二
羟基孕甾6+6烯67，586二酮（化合物 !，9!）的 :44"6羟
基化过程进行深入研究，着重突出转化工艺过程的
改进，实施以静息细胞在磷酸缓冲液介质体系中的
连续两批次生物催化生产氢化可的松的新工艺过程
研究，有效地提高了该新月弯孢霉作为生物催化剂
使用的生产性能，具有可操作性。现将实验研究结
果报告如下。
图 4 氢化可的松发酵生产示意图
;?$ @)A %B B0C@0.>)><%. %B $*&C%?%C><(%.0
! 材料与方法
4 =4 菌 种
新月弯孢霉（ !"#$"%&#’& %"(&)&）-! 7 =+7D4，购自
中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
（:EF::）。
4 =5 培养基
平板及斜面培养基：马铃薯 588 /，葡萄糖 58 /，
琼脂 5, /，自来水 4 888 @G，AH自然。发酵培养基：
黄豆粉 , /，葡萄糖 58 /，氯化钠 , /，酵母膏 , /，磷酸
氢二钾 , /，自来水 4 888 @G，AH 2 =4。
4 =7 甾体药品
9!-和氢化可的松样品由湖北制药厂及云南映
化集团药业公司提供。
4 =+ 甾体底物的制备
将 43!6羟 基 孕 甾6+6烯67，586二 酮6546醋 酸 酯
（9!）化学水解为化合物 !，以适量丙酮热溶，转入磷
酸二氢钾 I 氢氧化钠缓冲液（8 =8, @%’ J G，AH 2 =8）体
系中，减压浓缩回收丙酮，制成甾体底物微粒结晶溶
液备用。
4 =, 培养及转化条件
4 =, =4 摇床实验
将菌种斜面用无菌水制成孢子悬浮液，接入装
有 ,8 @G 培养液的 ,88 @G 三角瓶中，5D K，4D8 C J
@<.培养约 72 $，然后以 48L的接种量接入#级培
养基，相同条件下培养约 4D $，过滤菌丝，投入含微
粒结晶性底物 9! 的磷酸缓冲液（5 / J G，质量浓度），
转化约 55 $，过滤；再将菌丝投入含同样底物的磷酸
缓冲液中，相同条件下继续转化约 75 $，过滤；菌丝
再投入磷酸缓冲液中淘析转化约 7 $。
4 =, =5 5 G发酵罐中静息细胞连续两批次生物转化
,88 @G的摇瓶装有 4,8 @G 培养基作为$级种
子，培养约 72 $，接入装有 4 7,8 @G发酵培养基的 5
G发酵罐中，在上述条件下培养约 4D $，过滤，菌丝
投入约 4 =, G含 8 =5L微粒结晶性甾体底物 9! 的磷
酸缓冲液，构成首批次转化体系；转化 55 $，过滤，再
将菌丝投入 4 =5 G含同样浓度微粒结晶性底物的磷
酸缓冲液中继续进行第二批次转化，持续 75 $。转
化结束后经过滤分离，菌丝再放入磷酸缓冲液中继
续淘析转化约 7 $，将菌丝吸附的甾体析出进入液
相，回收甾体底物。
4 =2 转化率的测定
4 =2 =4 薄层层析法（MG:）
用硅胶 E;5,+ 制成薄板于 448 K活化 4 $，取发
酵液 7 @G以乙酸乙酯（4 N 4）提取，在板上点样 ,%G，
以以下 7 组溶剂系统展开：-= 氯仿 I 丙酮（7 N 4）；O=
氯仿 I 无水乙醇（P N 4）；:= 苯 I 丙酮（7 N 4）；样品层
析图谱在波长 5,+ .@的紫外分析仪下检测。
4 =2 =5 高效液相色谱法（HQG:）
取发酵液 7 @G 以乙酸乙酯（4 N 4）萃取，取澄清
有机层烘干，然后以少量乙醇溶解，取 5%G 进样，使
用 !QR648-SQ 型 液 相 色 谱 仪 检 测，色 谱 柱
H*&C%(A$0C0 :4D（! + =2 @@ T 5,8 @@，,%@），甲醇6水
（38 N 78）为流动相，流速 4 @G J @<.，检测波长 5,+ .@。
峰面积归一化法定量评估。
4 =2 =7 提取分离及精制
转化结束后的发酵液于 D8 K加热 78 @<.，冷却
至室温，以乙酸乙酯萃取 7 次。萃取后有机相真空
浓缩至较小体积，冷却结晶，结晶产物经重结晶精
制，烘干至恒重。
588, 年 44 月 易奎星等：静息细胞连续两批次生物催化生产氢化可的松 ·+4·
万方数据
! 结果与讨论
! "# 静息细胞转化工艺［$，%］
菌丝培养到 #& ’ #% ( 后，菌丝量达到最大值，
菌丝处于对数生长期末，此时菌丝体内羟化酶酶活
性最高［)］。将菌丝过滤，加入等体积的磷酸缓冲液
反应介质体系中，菌丝细胞在甾体底物 *+ 存在下，
促使 ,##!-羟化酶诱导酶的合成，在缺乏外源性营养
源的“饥饿”介质中进行 ,##!-羟基化，该体系呈现较
好的酶促稳定性。甾体底物 *+ 本身即是良好的诱
导剂，可诱导菌丝体合成额外数量的 ,##!-羟基化羟
化酶，以保持 ,##!-羟基化过程较稳定地进行。此工
艺的特点是反应介质中已无外源性营养成分，菌丝
体细胞代谢呈现“饥饿”状态，故反应过程中不易染
杂菌，且有利于后续分离提取［.］。以经筛选获得的
一株新月弯孢霉为试验菌株，对静息细胞转化法和
发酵液转化法作比较实验，结果表明静息细胞转化
法转化率显著高于发酵液转化法（表 #）。
表 # 静息细胞转化法和发酵液转化法转化率的比较
/0123 # ,45607894: 4; <(3 =4:>37984: 4; *+ 1?
“739<8:@ =322”0:A 1? ;3753:<0<84: 174<(
方法 B批次 # ! $ C D 平均值
静息细胞转化法 &% "C &D "D .$ ". && "$ &. "% &% "$
发酵液转化法 D$ ". D# "$ DD "! C) "& DE "% D! "#
注：转化率的测定以 FGH,峰面积归一法计算（下同）
! "! 首批次转化投料时间的确立［C，D］
投料时间一般选择在菌丝处于对数生长期末，
或稳定期之初。此时生物量最大，细胞总酶活性最
高，有利于转化反应的进行。我们通过对溶氧浓度
（!"#）的观察，发现在菌丝培养过程中，!"# 值在
经过一段时间的明显下降之后，在 #& ’ #% ( 之间趋
于稳定，此时投入底物进行反应，目标产物 F, 的转
化率最高。结果见表 !。
表 ! 投料时间对转化率的影响
/0123 ! I;;3=< 4; <853 4; 9J19<70<3 0AA8<84: 4: =4:>37984:02 70<84
$（投料）B ( #! #C #& #% !E !!
转化率 B K &# "D &$ "% .# "$ .! "& &% ". &. "$
! "$ 首批次转化时间对转化率的影响
传统工艺大多以一步发酵法转化约 DE ( 后结
束。我们采用连续两批次转化，目的是充分利用作为
生物催化剂使用的菌丝体的羟化酶活性，操作的要旨
是首批次转化时间既不能太短，以致底物未充分转
化，又不能太长，以致酶活性衰减。通过对液相反应
混和物中目标产物的积累及底物的消失的比较分析，
发现首批次转化约 !! (时底物已经剩余不多，液相中
也已经积累了相当数量的目标产物 F,；此时适时操
作进入第二批次转化比较合适。结果见图 !。
—!—氢化可的松；—"—底物；—#—副产物
图 ! 首批次底物 *+转化时程曲线
L8@ "! /853 =4J793 4; =4564J:A + =4:>37984: 1?
#%&’%()&*) (%+)$) 8: *MN #
! "C 首批次投料浓度对转化率的影响
研究表明，氢化可的松的生成过程存在底物抑
制现象［#E］。底物质量浓度对转化反应的影响比较
大，当投料浓度太高时，产物生成率下降，转化时间
延长，导致副反应的发生。实验结果首批次投料质
量浓度为 ! @ B H 时氢化可的松的相对收率较好，如
表 $ 所示。
表 $ 首批次投料质量浓度对转化率的影响
/0123 $ I;;3=< 4; =4:=3:<70<84: 0AA3A 9J19<70<3
4; *MN # 4: =4:>37984:02 70<84
#（投料）B
（@ B H）
,（氢化可的松）B
K
,（剩余底物）B
K
,（副产物）B
K
# "EE .C "C! # "$. !C "!#
! "EE .$ "&$ # "CC !C ")$
$ "EE &$ "D. % ")D !. "C%
C "EE DD ".. #$ "&) $E "DC
D "EE C% "#. #% "$$ $$ "DE
! "D 第二批次转化时间对转化率的影响［&］
首批次转化反应结束后，过滤分离液相和菌丝，
菌丝转入含微粒结晶性甾体底物 *+ 的磷酸缓冲液
进入第二批次转化。图 $ 显示实时检测分析结果，
第二批次转化时间应控制在 $& ( 反应达到平衡，氢
化可的松含量达到 &EK以上。如转化时间延长，副
产物的量会显著上升。因此，为尽量控制 #C"-羟基-
*+ 等副产物的形成，反应宜 $& ( 结束。
! "& 第二批次转化投料浓度对转化率的影响
考虑菌丝经过第一批次转化后，催化活性有所
下降，为了减少高值甾体底物的耗量，我们对底物投
·C!· 生物加工过程 第 $ 卷第 C 期
万方数据
加质量浓度从 ! " # $至 % " # $进行了比较考察，结果
如表 & 所示。由此决定选择第二轮转化时投料浓度
为 ! ’( " # $为宜。结果见表 &。
—!—氢化可的松；—"—底物；—#—副产物
图 % 第二批次底物 )*转化时程曲线
+," ’% -,./ 01234/ 15 01.61278 * 0179/34,17 ,7 ):; <
< ’= 菌丝对甾体物质的吸附问题［>］
已有文献报道，催化甾体羟基化反应的酶是胞
内酶［?］。反应过程是底物首先被菌丝体吸附，进入
胞内进行生物转化反应，产物再透过胞壁进入液相
的过程。因此反应结束后菌丝体内还吸附着相当数
量的甾体物质，我们将菌丝放入同样的磷酸缓冲液
中继续保温通气搅拌约 % @ 进行处理，可有效回收
被菌丝体吸附的甾体物质。实验结果表明，从菌丝
体内析出的甾体物质约占甾体总量的 !< ’=A。结
果见表 (。
表 & 第二批次投料质量浓度对转化率的影响
-BCD/ & E55/0F 15 0170/7F3BF,17 B88/8 42C4F3BF/ 15
):; < 17 0179/34,17BD 3BF,1
!（投料）#
（" # $）
"（氢化可的松）#
A
"（剩余底物）#
A
"（副产物）#
A
! ’GG >H ’!= % ’?& <= ’H?
! ’(G >( ’?> & ’>& < ’GG >! ’>! H ’?> < ’(G (> ’=G !< ’%% %G ’?=
% ’GG &H ’<( !H ’!& %% ’>!
表 ( 菌丝体吸附的甾体量
-BCD/ ( I.127F 15 4F/31,84 BC413C/8 CJ .J0/D,2.
批号
#（总回收甾体）#
"
#（菌丝吸附甾体）#
"
菌丝吸附甾体量
占总甾体量的比例 # A
#（菌丝干重）#
"
! & ’=( G ’>% !% ’<> !% ’HG
< & ’H? G ’>G !< ’<= !% ’&G
% & ’HG G ’>! !< ’=! !( ’%(
平均值 & ’H! G ’>! !< ’=( !& ’!H
< ’H < $发酵罐制备实验
采用静息细胞连续两批次转化工艺，并优化相
关参数后在 <$发酵罐上做了 % 批放大制备实验，每
次进行连续两批次 (( @ 转化，结果与以上摇瓶实验
数据吻合，结果如图 & 所示。由图可见，经首次批转
化后，酶活下降，第二批次的转化时间拉长，转化率
不如首批次。每批放大实验共投料 ( " 甾体底物
)*，提取得甾体物粗品分别为 & ’=( "、& ’H? " 和 & ’HG
"，粗品收率 ?(A以上。
—!—氢化可的松；—"—底物；—#—副产物
图 & < $发酵罐底物 )*转化时程曲线
+," K& -,./ 01234/ 15 01.61278 * 0179/34,17 ,7 < $ 5/3./7F13
上述粗品经精制重结晶后得 LM样品 H ’>( "，对
)*净收率为 (= ’>A，熔点 (
（M，乙醇），E!ARS&&G；药典［!!］值氢化可的松熔点为 N <<< O，［!］!HP Q !>< N Q !>?（M，乙醇），E!ARS &<< N
万方数据
!!"，检测波长 #!# $%。其他谱学数据（ &’，()，
*(’）均与 +, 标样一致。上述结果表明所得甾体
产物氢化可的松已达到药典标准。
! 结 论
采用静息细胞连续两批次转化方式，液相提取
及菌丝淘析处理方法的组合，提高了生物催化剂（菌
丝）的利用率。通过 # - 实验发酵罐的新月弯胞霉
的制备实验证明，该工艺对目标产物氢化可的松净
收率可达到 ./0，达到目前国外报道先进水平［#］。
此外分离回收未能参与转化的可再利用的高价值的
甾体底物 ’)，可有效提高甾体底物利用率，降低生
产成本。具有工业应用价值。
参考文献：
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G<98C:%<8=> ?:83><=;B3:;，
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［.］ )3VC9E9>@V=D= W]，7$L:>9U= K7，X9@C8C::$V9 X7，:B => 6 )D$BC:@<@ 9A
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·!!· 生物加工过程 第 P 卷第 ! 期
万方数据