全 文 ： 万方数据
万方数据
万方数据
2006年8月 张天智等：新月弯孢霉AS3．4381对新型甾体底物c。。p．羟基化 ‘25‘
果，平台初期副产物较少，底物浓度亦趋于稳定，到
44h终止转化回收产物。经测定产物转化率为40％。
p—cD甲醇(caCl2)乙醇 丙酮
投料方式
-未经超声波处理；口超声波处理
图5投料方式对生物转化率的影响
Fig．5E雎ctsofo曙越c幽Vents肌dpretrea恤1ent
onthebiotlansfbnIlat主on
4 12 20 28 36 44 52 60
椭
一-一产物质量浓度；一◆一底物质量浓度
图6新月弯孢霉C，．卢．羟基化底物I时程曲线
Fig．6TimecourseofcompoundIconversionbycl仉妣f肭
2．2转化产物理化数据分析
2．2．1熔点
采用经典熔点试验检测熔点为264—268℃，符
合Rime砌one标准品溶点文献值258—268℃范围。
2．2．2TLC鉴别试验
采用3种不同的溶剂系统在同等条件下对产
物、底物以及RiHlexolone标准品进行薄层层析试验，
在254咖紫外灯下示踪，计算出各色谱斑点的Rr值
(表2)。
表2表明，产物的荧光层析斑点在3组不同展
开剂系统中R，值始终与标准品斑点尺，值一致，且都
处于0．2～0．8范围内，排除了可能的色谱干扰¨。，
产物较纯，样品适合作进一步光谱分析。同时底物
荧光斑点．R，值明显不同，说明产物与甾体标准品
TLC鉴别特征相同。
表2眦试验数据
Table2 Data0f‘rI￡tests
秽(CH2C12)：甜(Acetone)(4：1)0．86 0．7l 0．7l
F(PetIDleurnether)：口(Acetone)(7：3)0．580．47 O．47
口(cyclohexane)：口(EtoAc)(7：3)—Q堂Q．望 Q：望
2．2．3MS分析
将产物样品及斑mexolone标准品溶解于无水甲
醇，采用Bi0TOFⅢQ(Bmker高分辨质谱仪)进行分
析(MS／Ms)。获得标准品(图7)和产物(图8)的质
谱图，产物样品的质荷比370．5，碳原子数24，可能
的分子式为％H斟03，按照国际相对原子质量计算，
相对分子质量370．53，分子离子峰m，z=393．6—
22．98：370．62。比照标准品图谱，相同条件下谱图
峰位相对丰度一一符合。
409．6
37l6 |lJ_．I||11．．卜．罂s
380 400
礴tfz
图7 RimexolDne标样Ms图谱
ng．7MStestofmmexolone
3936
409，6
．．．．．i． ij．I⋯． 。．h
390 400 410
m，z
图8产物MS图谱
ng．8MStest0fproduct
2．2．4红外光谱
纯化产物和瞰mexolone标样通过红外分光光度
计分析得IR图谱(图9、图10)。比较图9、图10两
钙∞弘∞
巧加
¨m，0
逞糌葚亭毒餐爿
^Jul／暑ul一＼b_×一霉世一q
O
O
O
O
0
O
＆
孓
重
3
2
1
O
5
0
5
0
5
0
撕
加
”
∽
¨
o
一1L鼍Ⅲ)＼b一×一S忆一q
万方数据
·26· 生物加工过程 第4卷第3期
图可知，存在a，卢不饱和共轭系统、不饱和双键、苯 环，基本符合Ⅱ的化学结构式。
40003500 3000 2500 2000 l 500 l OOO 500
A／cm_1
图9产物的红外吸收光谱
Fig．9IRtestofproduct
40003 500 3OOO 25002000 l 500 l 000
A／cm一1
图10Rimexolone的红外吸收光谱
Fig．10IRtestofRirnexolone
2．2．51HNMR
将产物溶解于CDCl，，400MHz1HNMR检测(内标
物’嬲)，得到的核磁共振谱如图11。根据质子化学
位移的计算值和资料数据，可得出产物结构确为
mmexol咖【e。
结合上述几项理化性质及谱学数据分析，该生物
转化产物鉴定为甾体药物陆胞【olone的化学结构。
3结论
利用新月弯孢霉丝状真菌作为酶源菌种，通过
Ⅱ级发酵及磷酸缓冲液“饥饿”介质体系转化甾体底
物在c。位上成功引入一个p位羟基；光谱学结构表
{正结果表明，本工艺所得生物转化产物确证是11口一
羟基一1＆，17p二甲基一17一丙酰基雄甾．1，4．二烯．3一
酮。酶催化c，，p．羟基化转化率达到40％。
经提取分离纯化，目标产物的产率在30％以
上，未转化底物I可以再回收利用。进一步的发酵
转化条件及工艺过程优化研究正待进行。研究结果
表明，使用新月弯孢霉生物转化手段可简化生产眼
科药物利美索龙合成路线，具有实用价值，值得进一
步进行研究开发。
∞
∞
∞
钓
加
0
∞
舳
∞
钾
加
0
口p寸。磊11_暑∞I__日_I一
万方数据
2006年8月 张天智等：新月弯孢霉As3．4381对新型甾体底物C，，p鹄!基化 ·27·
．J、^ 儿 ¨．九舨U
lO 9 8 7 6 5 4 3 2 I
6／cm一6
图11产物核磁共振谱
Fig．11 HNMRofproduct
参考文献：
[1] 肖 骏，魏世辉．糖皮质激素在眼科的应用[J]．中圜实用眼科
杂志，2004，22(12)：960母53．
[2]易奎星，杨亚力，杨顺楷，等．静细胞连续两批次生物催化生产
氢化可的松[J]．生物加工过程，2∞5，3(4)：40硝．
[3]sukhodolskayaGv，AIl{河0mBA，Koshdleenk0KA．PIlysiological
andbioche血calpeculiarities0ftlle(^小础b记f啪n缸脚洲F-644cul—
ture，cap出leofl p—Hyd嗍胁锄ofslemid汕stmle⋯．PriklBio．
khimMikmbiol，1986，22(2)：226．237．
[4]杨顺楷，常高翔，杨磊．白僵菌液体培养物中甾体基质和产
物的薄层色谱及光密度扫描测定[J]．色谱，1989，7(2)：114一
116．
[5]杨顺楷，易奎星，杨亚力，等．甾体微生物转化：cll卢-羟基化的
研究进展[J]．生物加工过程，2006，4(2)：7—14．
[6]sukhod01skayaGV，AngeloIaBA，K0s|lche饥koKA，eta1．synthe8isof
stemid-ll口一Hydr∞碍lase帅dpecIlliarities0f山etra删f0肿ati帆蛐dm-
“曲ilizedmvceli啪0f0删如砌fMd缸BKMF击44[J]．fHl【lBi0_
kkmMihob“，199l，27(5)：701·710．
[7]c轴ncholkarGv，Sul；hodolsI【ayaGV，B枷铀homTG，eta1．fkdi盯一
itiesof血ellp—Hydr∞矾a嘶0fslemidcomp0LmdS bymemyceIium
ofcIl九Ⅱ以口砌乜加缸BKMF．644intIlepresence0f卢一cyclodextrinlJj．
PriI【lBiokhimM kmbiol，19912，28(5)：685-693．
[8]黄淑惠，徐诗伟，法幼华．用新月弯孢霉“_19一羟基化16*甲基
化合物RS．21醋酸酯[J]．微生物学报，1989，29(1)：68—71．
[9] 阳葵，李晓静，冯霞，等．底物的分散和溶解对甾体微生物
酶反应的影响[J]．微生物学通报，2001，28(6)：68—71．
[10]王敏，路福平，蒋岳，等．新月弯孢霉原生质体的形成与
cilp羟基化反应[盯．微生物学杂志，2000，20(9)：35·37．
[11]wilnmskaD，MilcamrekK，RLIr嘀io鸺kaA，eta1．Eli瞄n8tionofby—
pmductsinllp小ydro唧lati帆ofsub咖ncesusing伪棚如如nl，lⅡ地
donesre日enerationfI砌N|IBtreatedpmto-plasts[J]．ApplMicmbio
Biolechn01，1992，37(5)：626_630．
[12jchenKc，weyH c．1lp—hydro)(ylation0fcortexol明bycⅡm如砌
fⅥ删o[J]．En剐mMic加bol’I砒nol，1990，12(4)：305—308．
【13]Davi8PJ．Mic尚allr问eIs0f瑚咖【18li锄dmgH蛐|boli栅，deVelop—
Inent8inindu矗alITd浏)iology，v埘[M]．Editor：GPierce，1988，
197_219
万方数据