全 文 ：第 2 6卷第 4期 华中师范大学学报 (自然科学版)
19 92年 12月 JoUR NAL O FCE T NR ALC l l l NAR O N MAL U NE V IR SI T Y (Nat· Se i·)
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19 92
马唐愈伤组织不同发育期生理变化的研究 ’
杨和平 程井辰
(生 物 系)
摘 要 马唐幼穗愈伤组织诱导期 、 增殖期和分化期可溶蛋白质含量均呈双峰曲线变化 ,即分别
在第 7 天和第 14 天出现两个高峰 ,但分化期维持在较高水平 . 在外植体启动 、 愈伤组织形成及球
形胚分化时 ,分别有新的蛋白质及过氧化物酶 、 酷酶和淀粉酶同工酶带出现 ,这些带可作为有关形
态变化的分子标记 . 各个时期的代谢活性先高后低 ,就不同时期代谢活性而言 ,分化期高于诱导
期 , 诱导期高于增殖期 .
关键词 马唐 ;愈伤组织 ,蛋白质 `淀粉酶
植物组织培养中外植体的启动 , 细胞的脱分化 ,愈伤组织的形成 、增殖和再分化 ,是一个复
杂的形态学变化过程 . 这个过程的生理变化 ,包括代谢方向相反而又相互关联的两个阶段 . 揭
示这一形态学变化的生理生化背景 ,有助于从分子水平探讨愈伤组织的特性 、 植物细胞脱分化
和再分化之机理 . 已有的研究表明 , 蛋白质的合成对于愈伤组织的形成极为重要 .l[ ` · ’ · `之] ;在愈
伤组织形成 、 增殖及分化中 ,光合作用与呼吸作用途径有所改变比 ’ · “ 习 ;同工酶谱变化与形态
学变化有关联 〔` 一 ` · ` ’〕 . 上述工作多以双子叶植物为材料 ,而对单子叶植物 ,尤其是禾本科植物
愈布组织生 长与分化中代谢变化的研究尚不多见 . 因此 ,本文分析了马唐幼穗愈伤组织诱导
期 、 增殖期和分化期蛋白质及过氧化物酶 、 酷酶和淀粉酶同工酶之变化 .
1 材料和方法
1
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1 实验材料
供试材料为马唐 ( D匆`t a : i a , 。 , u i n a z i; (乙 . ) s e即 . )幼穗 , 采自华中师大校园 .
1
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2 实验方法
1
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2
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1 诱导培养 取马唐愈幼穗表面灭菌后切成小段 , 接种于 N 。+ 2 , 4一D 2 . 5 m s / L 培养基
上 ,诱导愈伤组织 .
1
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2
.
2 增殖培养 取诱导培养 15 d 的愈伤组织 , 接种于 N 。十 2 , 4一 D 2 m s / L 十 K T I m g / L 培
养基上 , 扩增愈伤组织 .
1
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2
.
3 分化培养 取诱导培养 15 d 的愈伤组织 ,接种于 N 。 + K T I m s/ L 固体培养基上 ,使之
分化 .
上述诸培养均在 25 士 2℃ 、 每天 10 ~ 12 h 2 0 0 0 L u x 弱散光条件下进行 .
1
.
2
.
1 可溶性蛋白质含童的浏定 采用 L o w yr 法 9[] , 经 F ol li n 一酚试剂与样品进行双缩脉反
应 , 产生蓝 色物质 , 再在 7 21 型分光度计上 6 50 o m 波长处 比色 , 测得光密度值 , 即可在标准
本文 29 9 0 一 1 1一 3 0收到 .
, 国家自然科学基金资助课题 .
第 4 期 杨和平等 :马唐愈伤组织不同发育期生理变化的研究
曲线上查出样品的可溶性蛋白质含量 .
l
·
. 2 5可溶性蛋白质的 S D S一 P AC E 采用不连续 S D S一 P AC E 垂直板型系统[s1 分离可溶性蛋
白质 . 浓缩胶为 3% , 分离胶为 10 % , 电极缓冲液为 s D s 一T r is 一甘氨酸系统 , 点样量为 50 o L ,
低温电泳 3 ~ 4 h , 考马斯亮蓝染色显带 .
1
.
.2 6 同工酶的 P A C E 采用不连续 P A c E 垂直板型系统分离同工酶 s1[ . 浓缩胶为 3% , 分
离胶为 10 % . 电极缓冲液为 p H 6 . 3 的 T r is 一甘氨酸溶液 , 上样量为 30 o L , 低温电泳 3~ 4 h ,
按常规方法 5[] 分别染色显带 .
2 结果与分析
根据愈伤组织的不同发育时期之细胞组织学特征 , 可将其分为诱导期 、 分裂 (增殖期 ) 和
分化 (器官分化或胚胎发生 ) 期 sj[ . 实际上 , 诱导期十分短促 , 通常在几天之内完成 , 同时 ,
此期也有细胞的增殖 ; 增殖与分化也互有交错 , 因此难以绝对确定愈伤组织处于何时期 . 为
方便起见 , 本文视诱导 、 增殖和分化培养中的愈伤组织 , 分别为诱导期 、 增殖期和分化期愈
伤组织 . 马唐幼穗愈伤组织在不同发育期组织学差异 , 本研究表明 , 这种差异是以生理差异
为基础的 .
2
.
1 马唐幼穗愈伤组织不同发育期可溶性蛋白质之变化
2
.
1
.
1 含童变化 从图 1 可以看出 ,马唐愈伤组织诱导期 、增殖期及分化期蛋白质含量变化
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图 l 马唐愈伤组织诱导期 (一 . 一 ) 、增殖期 (一 。 一 )及分化期 (一卜 )蛋白质含t 的变化
趋势是 : 各个时期蛋白质含量均呈双峰曲线变化 l[] , 其中诱导期和增殖期的蛋白质变化曲线极
为相似 , 都在第 7 天和第 14 天出现高峰 , 只不过增殖期的变化幅度较小而 已 . 而分化期的第
一个高峰提早到第 3天出现 , 然后下降 , 在第 7 天达最低水平 , 再回升 , 于第 14 天出现第二
个高峰 , 此后又稍有下降 , 但比诱导期和增殖期之后期蛋白质含量下降较慢且少 , 并维持在
较高水平 , 这是因为分化期出现器官分化及胚胎发生 , 开通 了较多的代谢途径 , 蛋白质
(酶 ) 的合成旺盛 , 含量较高 , 为形态发生提供足够的催化剂与结构物质 l[, ’〕 . 分化期第一峰可
能与球形胚的出现相对应 ; 第 3~ 7夭含量的下降 , 可能是由于器官分化的出现 , 结构蛋白质
合成渐占优势的缘故 ; 第二峰可能是由于胚体分化业已完成 , 开始积累贮藏蛋白的结果 . 诱
导期前 3夭蛋白质含量低于幼德中蛋白质含量 , 是因为此时外植物处于启动状态 , 细胞吸水
膨胀 、 含水较多 , 故蛋白质相对含量降低 , 即所谓稀释效应 , 随后蛋白质含量增加 , 说明蛋
华中师范大学学报 (自然科学版 )第 26 卷
白质有新的合成 , 保证形成愈伤组织对于蛋白质 (酶 ) 的需求 ; 结合显微观察分析 , 诱导期
第一峰可能与愈伤组织的出现有关 , 第二峰则与愈伤组织对数增长期相对应 ; 因此 , 蛋白质
的合成对于愈伤组织的形成是十
分重要的 〔` 〕 . 增殖期前 3天 , 愈伤
组织尚处于延滞期 , 合成代谢速
率慢 , 蛋白质含量低 , 随后进入
对数增长期 , 所以蛋白质含量也
渐渐升高 , 并在第 7 天出现第一
峰 , 此后又下降 , 说明愈伤组织
进入稳定增加期 , 第 14 天出现的
第二峰的发育生理学意义有待探
讨 . 三个时期蛋白质含量在第 14
夭之后均下降 , 这是因为培养基
中养分的消耗 、 细胞内或培养基
中有害或抑制物质的积累 、 微生
态环凌 (如培养基的酸碱度 ) 的
变化所至 .
2
.
1
.
2 种类变化 图 2表明 ,诱
导初期 , 蛋白质带增加 , 在第 3
天和第 7 天分别出现 R f ~ 0 . 63 ,
。 . 48 两种蛋白质 , 分别与外植体
启动和愈伤组织的形成有关 , 本
文称之为 “ 启动蛋白 ” 和 “ 愈伤
组织蛋白 ” . 之后 , R f一 0 . 2 9那条
带消失 . 这一变化趋势与有关文
献 , ’ 〕报道相似 ,进一步说明新蛋
白质合成对于愈伤组织的形成极
为重要 , 可以把新蛋白质作为愈
伤组织形成的信号 . 增殖期蛋 白
质谱带变化不大 , 是因为增殖期
除细胞分裂外 , 愈伤组织没有开
通其它代谢及分化活动 . 分化期
第 3 、 7 、 10 天 , 分别重新出现或
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图 2 马唐愈伤组织诱导期 l( ~ 6 ) 、增殖期 (7 ~ 10) 及分化期
( l一 14 )可溶性蛋白质 s D S 一 p ^ e E 图谱
1一幼穗 , 6一诱导期第 15 天 , 2 , 7 , 1 一第 3 天 ; 3 , 8 , 1 2一第 7天 .
月, g , 1 3一第 一。天 , 5 , 1 0 , 2 4一第 l刁天 ,
一强带 尸二弱带 ; R f : 迁移率 . (图 3~ 5 同此 )
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图 , 马唐愈伤组织诱导期 (1 ~ 6) 、 增殖期 (7 ~ 10) 及分化期
( 1 ~ 14) 过权化物的酶同工酶图谱
新增 R f一 0 . 29 , .0 26 , 0 . 34 的蛋白质带 , 分别与体细胞胚胎发生的诱发 、 球形胚的形成及其
分化相关 .
2
.
2 马唐幼穗愈伤组织不同发育期同工酶的变化
2
.
2
.
1 过或化物畴同工晦的变化 从图 3 可以看出 , 诱导期过氧化物酶活性及同工酶带数不
断增加 , 在第 10 天达到高峰 , 其后开始下降 . 在细胞脱分化 、 外植体启动时出现一条带 ( R f
= 0
.
39 )
. 而当细胞分裂和愈伤组织形成时也有一条带 ( R f一 0 . 1 7) 出现 . 第 10 夭又出现三
第 4期 杨和平等 :马唐愈伤组织不同发育期生理变化的研究
条带 ( Rf ~ 0 .6 5, .0 59 , .0 61 ) , 它们可能与细胞的快速增殖有关 , 当愈伤组织老化时 , 其中
二条带 ( R f ~ 0 . 59 , 0 . 61 ) 消失 . 在增殖期 , R f一 0 . 71 , 0 . 73 , 0 . 79 的三条带并未出现 , 看
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亡Je
来它们与生殖生长有关 , 因为它
们存在于幼穗中 , 在分化期亦重
新出现 , 至于诱导期中这些带的
存在 ,可能来源于接种物的残余.
增 殖 期第 10 夭 出现 的一 条带
( R f = .0 23 )
, 可能与细胞快速增
殖相对应 . 分化期过氧化物酶活
性增加 , 并在第 7 夭新增一条带
( R f 一 .0 80 ) , 这条带与球形胚
的分化相对应 , 第 10 夭后 , 有三
条带 ( R f 二 0 . 5 6 , 0 . 5 9 , 0 . 6 1 )
消失 , 这标志着体细胞胚逐渐成
熟 .
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2
.
2
.
2 能酶同工酶 的变化 如 图 。
图 4所示 , 马唐愈伤组织各时期
酷酶活性均呈升高趋势 , 而其同
工酶带数却呈下降趋势 . 诱导期
第 7 天新增一条带 ( R f ~ 0 . 6 9 ) ,
而在第 10 天之后 , 有一条带 ( R f
“ 0 . 28 ) 消失 . 增殖期第 7 天有
两条带 ( R f一 0 . 4 3 , 0 . 4 ” 消失 .
同时有一条新带 ( R f一 0 . 64 ) 出
现 . 分化期醋酶同工酶变化情况
与增殖期类似 , 但在第 7 天多出
一条带 ( R f ~ 0 . 28 ) , 它可能与球
形胚的分化有关 .
2
.
2
.
3 淀粉 晦同工晦的变化
图 5 表明 , · 马唐愈伤组织诱导期
淀粉酶活性及其同工酶带数均呈
增加趋势 . 在幼穗中未鉴测到淀
粉酶这有利幼穗中积累碳水化合
马唐愈伤组织诱导期 (l ~ 6) , 增殖期 (7 ~ 10) 及分化期
( 一z~ 一` ) 能酶同工酶 P ^ e E 图谱
口口口口I 口口二I }…〔二二厂一 , 仁二仁二〕
图 s 马唐愈伤组织诱导期 l( ~ 6) 、 增殖期 (7 ~ 10) 及分化期
川 ~ l一) 淀粉酶同工酶 ( p A e E 图谱 )
物 , 维持适当的 c / N , 以满足生殖生长的物质与能量需要 . 在外殖体启动和愈伤组织形成时 ,
分别出现两条带 ( R f ~ 0 . 86 , O , 7 6 ) , 说明愈伤组织形成之时 , 细胞呼吸作用加强 , 开始水解
淀粉 , 为生物大分子合成及细胞分裂提供碳源和能量 . 增殖期淀粉酶活性又升高 , 并在第 3 天
和第 7 天分别出现一条带 ( R f二 0 . 73 , 0 . 80 ) , 这适应愈伤组织快速增殖对于物质与能量之需
求 . 分化期淀粉酶活力进一步升高 , 这有利于水解更多的淀粉 , 给形态建成提供碳链骨架和
能量 .
华中师范大学学报 (自然科学版) 第2 6 卷
3 讨论
从培养时间上看 , 不论诱导期 、 增殖期 , 还是分化期 , 其早期代谢活性均比晚期要高 , 生
理代谢变化比较复杂 , 这与培养物的生理年龄 、 培养基的营养条件及内外源激素水平有关 , 也
反映其细胞学变化的复杂程度 . 就蛋白质含量及代谢活性而言 , 分化期高于诱导期 , 而诱导
期又高于增殖期 , 这是因为分化期正进行胚胎发生与器官分化 , 代谢途径多 ; 诱导期正经历
从分化状态经脱分化回复到分生状态 , 并从自养转向异养为主的激烈变化过程 , 故代谢比较
复杂 ; 而增殖期只行细胞增殖 , 故代谢较为单一 、
诱导 、 增殖及分化三个时期的培养条件 , 除使用的激素种类及剂量不同之外 , 其它方面
基本一致 , 却具有各自不同的细胞组织学特征 , 其生理变化情况也不相同 . 这说明生长素 、 细
胞分裂素或其配合使用时 , 所引发的形态学事态不同 , 归根到底是因为各自引发的生理生化
反应不同 ; 生长素 、 细胞分裂素及其组合对过氧化物酶 、 酷酶和淀粉酶同工酶谱都有影响 , 但
效应各不相同 .
同工酶在植物不同发育阶段 、 不同器官 、 甚至不同组织或细胞中表现出不同谱带 , 可作
为研究分化和发育基础变化的灵敏指标 l[ 〕 . 大量研究表明 , 过氧化物酶 、 醋酶及淀粉酶活性
及同工酶 , 在愈伤组织生长发育中亦被调节 , 且呈规律性变化 , 一 ` · ` ,〕 . 本文研究也表明 , 在马
唐幼穗启动 、 愈伤组织形成及球形胚分化时 , 都有相应的新的蛋白质或同工酶带出现 . 这是
遗传信息在内外源因子调节下在不同时空内选择转录 、 代谢功能顺序表达的体现 , 因此这些
新带可作为相应的形态变化的分子标记 .
参 考 文 献
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39 2~ 403
第4 期 杨和平等 :马唐愈伤组织不同发育期生理变化的研究4 81
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A b s t r a e t T h e s o l u b le P r o t e i n e o n t e n t w a s d e t e t m i n e d
, a n d s o l u b l e P r o t i e n ,
Pe r o x id a s e
, e s t e r a s e a n d d i a s t a s e i s o e n z y m e s w e r e i d e n t i f le d i n t h e e x t r a e t s o f e a l l u s
d e r i v e s f r o m y o u n g i n f l o r o s e e n e e o f D i g i t a r i a s a n g u i n a l i s ( L
.
) s e o P
.
T h e r e s u l t s a r e
a s fo l lo w s : T h e c o n t e n t s o f s o l u b l e P r o t e i n i n i n d u e i n g P e r l o d
, P r o if e a t i n s P e r i o d a n d
d i f fe r e n t i a t i n s p e r i o d e h a n s e d i n t h e fo r m o f
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d i f fe r e n t i a t i n s P e r i o d
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.
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, s e V e r a l n e w P r o t e i n a n d i s o e n z y m e s a P P e a r e d
·
T h e y m i g h t P l a y im P o r t a n t r o l e s i n t h e m o r P h o l o g i e a l e h a n s e s , a n d e o u ld b e
e o n s i d e r e d a s m o l e e u l a r m a r k e r s o f t h e m o r P h o l o g i e a l e h a n g e s
·
T h e m e t a b o l i e
a e t i v e t y w a s h i g h e r i n t h e e a r l y s t a g e t h a n i n t h e l a t e s t a g e o f e i t h e r i n d u e i n g ,
P r o l i if e a t i n g o f d i fe
r e n t i a i t i n s P e r i o d
·
T h e e l e c t o r P h o r e t i e b a n d n u m b e r s o f s o l u b l e
P r o t e i n
,
P e r o x i d a s e , e s t e r a s e a n d d i a s t a s e i s o e n z y m e s , a n d t h e m e t a b o l i s m a e t i v i t y
i n d ife
r e n t a t i n g P e r i o d w e r e h i s h e r t h a n i n in d u e i n g P e r io d
·
A n d t h e m e r a b o l is m
a e t iv i t y i n P r o l i f i e a t i n g P e r io d w a s t h e l o w e s t
·
K e y w o r d s D 落夕 t` a 于`a 战夕 . 葱、 a l`s ( L · ) S C即 ; e a l l u s ; P r o t i e n ; d i a s t a s e