全 文 ：收稿日期:2012 － 05 － 30 修回日期:2012 － 09 － 06
基金项目:云南省自然科学基金资助项目(2009CD073) ;国家林业局“948”技术引进基金资助项目(2008 － 4 － 30) ;云南省中青年学术技术
带头人后备人才培养基金资助项目(2010CI016)。
作者简介:孙瑞明(1988 －) ，女，硕士研究生，从事竹类研究。通讯作者杨宇明(1955 －) ，男，教授，从事竹类研究。E-mail:yymbamb@
yahoo． com． cn。
香竹愈伤组织诱导研究
孙瑞明1，王 娟1，陈 芳2，彭桂莎1，杨宇明2，徐 田2
( 1．西南林业大学，国家林业局西南生物多样性保育重点实验室，云南 昆明 650224;
2．云南省林业科学院，云南 昆明 650204)
摘要:以香竹种子为培养材料进行愈伤组织的诱导和增殖，分析了不同激素组合对愈伤组织诱导和增殖的影响，并比较了
香竹的种子、无菌幼根、无菌幼茎和无菌幼叶 4 种不同外植体诱导愈伤组织生成的效果。结果表明:香竹种子诱导愈伤组
织较合适的培养基为 MS + 3．0 mg·L －1 2，4-D + 0．5 mg·L －1 6-BA;香竹增殖愈伤组织较适合的培养基为 MS + 1．0 mg·L －1
2，4-D +1．0 mg·L －1 6-BA +0．5 mg·L －1 KT;无菌幼根的根冠部位比幼茎和幼叶更易产生愈伤组织，而种子作为外植体效果最佳。
关键词:香竹;愈伤组织;诱导;增殖
中图分类号:Q813．1 文献标识码:A 文章编号:1001 － 389X(2013)01 － 0048 － 04
Study on callus inducement of Chimonocalamus delicates
SUN Rui-ming1，WANG Juan1，CHEN Fang2，PENG Gui-sha1，YANG Yu-ming2，XU Tian2
(1． Southwest Forestry University，Southwest Biodiversity Conservation Key Laboratory of State Forestry Administration，
Kunming，Yunnan 650224，China;2． Yunnan Academy of Forestry，Kunming，Yunnan 650204，China)
Abstract:Based on murashige and skoog (MS)medium，induction and proliferation of callus under different concentration of
2，4-D，KT，and 6-BA were used for the evaluation of the effect of callus． Seeds，sterile roots，sterile stems and sterile leaves were
used as explants for evaluation of the callus induction efficacy of Chimonocalamus delicatus． The results showed that MS +
3．0 mg·L －12，4-D + 0． 5 mg·L －1 6-BA was an optimum medium for callus inducing with different conditions． 1． 0 mg·L －1 2，4-D
coordinated with 1．0 mg·L －1 6-BA and 0．5 mg·L －1 KT in MS，were more suitable for callus proliferation of C． delicatus． The root
cap could be easier to induce callus formation than stem and leaves． However，seeds are the most proper explants to induce the
callus formation．
Key words:Chimonocalamus delicatus;callus;induction;proliferation
竹子开花周期长，且花期不一致，大部分竹子很难产生大量有生命力的种子，常规方法进行遗传变异
研究和育种改良有较大的难度，而采用传统无性繁殖的方法虽然能在一定程度上选出较好的品系，但周期
长、速度慢，不能及时满足生产的需要，且长期的无性繁殖会导致竹种退化，在很大程度上限制了竹种的引
种、推广和应用。基因工程将是解决这些问题的有力手段，通过基因转移，能有效地获得优良新品种，改善
竹类植物的经济性状，而愈伤组织诱导和再生植株是植物转基因研究的基础。
竹类组织培养的研究始于 20世纪 80年代，人们先后对刚竹属(Phyllostachys)、牡竹属(Demdrocalamus)、
麻竹亚属(Sinocalamus)、赤竹属(Sasa)、泰竹属(Thysostachys)和刺竹属(Bamabusa)等 20 余属 70 多个竹
种开展了组织培养研究［1］。分别以种子的种胚及胚状茎轴、嫩梢竹枝小段、侧嫩梢顶芽、茎节间组织切
段、空心茎休眠芽、幼竹笋叶箨基部小块、花药花序等为外植体，添加了不同浓度激素的 MS 或改良 MS 培
养基、改良 White［2］、BM［3］和 B5
［4］培养基，通过固体或液体悬浮培养或原生质体培养等方法，诱导出愈伤
组织或丛芽，在多个竹种上培养出小植株，并对某些竹种的试管开花进行了研究［5］。香竹(Chimonocalamus
delicatus Hsueh et Yi)为禾本科(Gramineae)竹亚科(Bambusoideae)香竹属(Chimonocalamus)植物，是云南优良
经济竹种及特有珍贵竹种之一［6 － 7］。目前对香竹的研究在组培方面仅见丛生芽诱导及再生植株的报
道［8］，其他方面仅见栽培技术和种质资源的珍贵性方面的报道［9］。研究香竹的愈伤组织诱导和增殖，为
福建林学院学报 2013，33(1) :48 － 51 第 33 卷 第 1 期
Journal of Fujian College of Forestry 2013 年 1 月
DOI:10.13324/j.cnki.jfcf.2013.01.009
下一步转基因奠定基础，对香竹的新品种开发、种质资源保护和经济价值开发具有深远意义。笔者对诱导
香竹愈伤组织及其增殖过程中的外植体选择、激素的使用浓度配比进行了探讨。
1 材料与方法
1．1 供试外植体
外植体源自云南省金平县采集的香竹当年生种子，采后通风干燥并置于 4 ℃冰箱中塑料袋封存。无
菌幼根、幼茎、幼叶均取自种子诱导出的无菌苗。
1．2 外植体消毒
挑选种胚完好、颗粒饱满、无病虫害的种子，剥掉种子内外稃片，用剪刀去除种子远胚端，先用洗洁精
进行表面初步清洁 3 次，每次清洁后均用流水冲洗 5 min，然后用 10%次氯酸钠 + 4 滴吐温 20 不停震荡 2
h，最后用 0．1%氯化高汞浸泡 15 min，在超净工作台上用无菌水冲洗 5 次，接种入培养基。
1．3 形成愈伤组织的外植体及培养基配方优化
MS基本培养基含 30 g·L －1糖，6 g·L －1琼脂，pH 5．8 － 6．0。不同部位外植体诱导愈伤组织的试验:将
不同部位的外植体(种子、无菌幼根、无菌幼茎和无菌幼叶)接入 MS + 3． 0 mg·L －1 2，4-D + 0． 5 mg·L －1
6-BA培养基中，20 d后观察愈伤组织诱导情况;每个处理 10 瓶，每瓶接入 3 个外植体。以种子为最优外植
体诱导愈伤组织的试验:设 7 种培养基(MS +2．0 mg·L －1 2，4-D;MS +3．0 mg·L －1 2，4-D;MS +4．0 mg·L －1
2，4-D;MS +3．0 mg·L －1 2，4-D +0．5 mg·L －1 KT;MS +3．0 mg·L －1 2，4-D +2．0 mg·L －1 6-BA;MS +3．0 mg·L －1
2，4-D +1．0 mg·L －1 6-BA;MS +3．0 mg·L －1 2，4-D + 0．5 mg·L －1 6-BA) ;每个处理 30 瓶，每瓶接入 4 粒种
子，7 d后每天观察记录愈伤组织诱导的情况。
1．4 愈伤组织增殖培养基的优化
愈伤组织增殖培养基中各激素组合分别为:1．0 mg·L －1 2，4-D + 0．5 mg·L －1 6-BA + 0．5 mg·L －1 KT;
2．0 mg·L －1 2，4-D +0．5 mg·L －1 6-BA +0．5 mg·L －1 KT;3．0 mg·L －1 2，4-D +0．5 mg·L －1 6-BA +0．5 mg·L －1
KT;1．0 mg·L －1 2，4-D + 1． 0 mg·L －1 6-BA + 0． 5 mg·L －1 KT;1． 0 mg·L －1 2，4-D + 1． 0 mg·L －1 6-BA +
1．0 mg·L －1 KT;1．0 mg·L －1 2，4-D +1．0 mg·L －1 6-BA +1．5 mg·L －1 KT。每个处理 5 瓶，每瓶接入 4 粒直
径为 1 cm的愈伤组织，20 d后观察记录愈伤组织增殖的情况，筛选出较优增殖培养基。
1．5 培养条件
培养温度为(25 ± 2)℃，愈伤组织诱导培养阶段的前 15 d为暗培养，之后各阶段均为光培养，光照强
度为 1 500 － 2 000 lx，光照时间为 12 h·d －1。
1．6 数据分析
数据计算与统计采用 Excel 2003;数据统计分析则采用 PASW Statistics 17． 0 进行单因素方差
(One-way ANOVA)分析;不同处理间多重比较采用 Duncan新复极差方法、t检验(P ＜0．05)和相关性分析方法。
2 结果与分析
2．1 不同部位外植体的愈伤组织诱导
表 1 不同部位外植体在愈伤组织诱导培养基中的愈伤情况
Table 1 Conditions of callus formation in the induced
medium by different explants
供试材料 出愈率 /% 愈伤组织质地及色泽
种子 20．3 多数愈伤质量好，偏黄绿色或紫色
无菌幼叶 0．0 －
无菌幼茎 6．2 愈伤极易褐化死亡
无菌幼根 17．6 多数愈伤水渍化，少量愈伤偏黄绿色或紫色
不同部位外植体在愈伤组织诱导培养基
中的愈伤情况见表 1。由表 1 可见，种子的
出愈率为 20．3%，是所有外植体材料中出愈
率最高的，为较优外植体，且诱导出的愈伤组
织偏黄绿色或紫色，最适合进行增殖分化;无
菌幼根虽然出愈率较高，但是大多数愈伤组
织呈黏稠水渍化，不利于增殖和分化;无菌茎
段在此培养基中诱导出的愈伤组织褐化严
重;无菌幼叶没有愈伤组织产生。
·94·第 1 期 孙瑞明等:香竹愈伤组织诱导研究
2．2 不同生长调节剂对愈伤组织诱导的影响
2，4-D是香竹种子诱导产生愈伤组织的主要生长素，在 2．0 － 4．0 mg·L －1的浓度范围内均可以诱导出
愈伤组织，但是当浓度为 2．0 和 4．0 mg·L －1时，愈伤组织褐化严重，只有在浓度为 3．0 mg·L －1时，才能够形
成偏灰色的愈伤组织，在此基础上加入细胞分裂素 6-BA，当 6-BA浓度为 0．5 － 1．0 mg·L －1时，可以诱导出
淡黄色或紫色结节状的致密型愈伤组织，并且当 6-BA浓度为 0．5 mg·L －1时为较优诱导组合。相反，加入
KT则容易使愈伤组织水渍化。因此，3．0 mg·L －12，4-D +0．5 mg·L －16-BA 是诱导具有分化能力的愈伤组
织的较好培养基(表 2)。
表 2 不同生长调节剂对愈伤组织诱导的影响
Table 2 Effects of the concentration variations of different growth regulator factors on callus induction
生长调节剂
诱导率
% 愈伤组织诱导情况及性状描述
2．0 mg·L －1 2，4-D 13．4 平均 13 d出现愈伤组织，大部分褐化，转接后几乎全部褐化死亡
3．0 mg·L －1 2，4-D 20．6 平均 7 d出现愈伤组织，多数愈伤质量差，偏灰色
4．0 mg·L －1 2，4-D 17．2 平均 9 d出现愈伤组织，但褐化严重，几乎全部褐化死亡
3．0 mg·L －1 2，4-D + 0．5 mg·L －1 KT 18．9 平均 8 d出现愈伤组织，多数愈伤组织水渍化
3．0 mg·L －1 2，4-D + 2．0 mg·L －1 6-BA 18．2 平均 8 d出现愈伤组织，多数愈伤为柔软易碎的松散型愈伤组织，老化严重
3．0 mg·L －1 2，4-D + 1．0 mg·L －1 6-BA 19．5 平均 7 d出现愈伤组织，多数愈伤为柔软易碎的松散型愈伤组织，少数偏黄绿色或紫色
3．0 mg·L －1 2，4-D + 0．5 mg·L －1 6-BA 20．3 平均 7 d出现愈伤组织，多数愈伤质量好，偏黄绿色或紫色
2．3 不同培养基对愈伤组织增殖的影响
愈伤组织的增殖是决定能否实现愈伤状态的初步统一化的比较关键的阶段。在增殖阶段，愈伤组织
对 2，4-D的依赖没有诱导阶段强，但仍需维持在一定浓度，当 2，4-D浓度为 1．0 mg·L －1时，愈伤组织不容
易褐化死亡且增殖倍数最高;低浓度的 KT对愈伤的增殖有良好的效果，当 KT浓度超过 0．5 mg·L －1时，愈
伤组织严重水渍化;6 组生长调节剂的组合对香竹愈伤组织都有所增殖，其中 1． 0 mg·L －1 2，4-D + 0． 5
mg·L －1 6-BA +0．5 mg·L －1 KT、2．0 mg·L －1 2，4-D +0．5 mg·L －1 6-BA +0．5 mg·L －1 KT、1．0 mg·L －1 2，4-D
+1．0 mg·L －1 6-BA +1．0 mg·L －1 KT、1．0 mg·L －1 2，4-D + 1．0 mg·L －1 6-BA + 1．5 mg·L －1 KT 培养基组合
增殖的愈伤维持在原状态，基本没有分化现象，而 1．0 mg·L －1 2，4-D + 1．0 mg·L －1 6-BA + 0．5 mg·L －1 KT
相对其他试验组合具有较高的增殖倍数，是香竹较适合的愈伤组织增殖组合(表 3)。
表 3 不同培养基对愈伤组织增殖的影响
Table 3 Effects of different medium on callus proliferation
培养基
2，4-D
mg·L －1
6-BA
mg·L －1
KT
mg·L －1 增殖倍数
差异显著性
(P ＜ 0．05)
1．0 mg·L －1 2，4-D + 0．5 mg·L －1 6-BA + 0．5 mg·L －1 KT 1．0 0．5 0．5 1．938 ± 0．129 b
2．0 mg·L －1 2，4-D + 0．5 mg·L －1 6-BA + 0．5 mg·L －1 KT 2．0 0．5 0．5 1．683 ± 0．099 c
3．0 mg·L －1 2，4-D + 0．5 mg·L －1 6-BA + 0．5 mg·L －1 KT 3．0 0．5 0．5 1．244 ± 0．064 e
1．0 mg·L －1 2，4-D + 1．0 mg·L －1 6-BA + 0．5 mg·L －1 KT 1．0 1．0 0．5 2．283 ± 0．169 a
1．0 mg·L －1 2，4-D + 1．0 mg·L －1 6-BA + 1．0 mg·L －1 KT 1．0 1．0 1．0 1．434 ± 0．056 d
1．0 mg·L －1 2，4-D + 1．0 mg·L －1 6-BA + 1．5 mg·L －1 KT 1．0 1．0 1．5 1．219 ± 0．047 e
表 4 不同生长调节剂对愈伤组织增殖倍数的相关性分析1)
Table 4 The correlation analysis between multiplication
rate and different growth regulator factors
增殖倍数相关性分析 2，4-D 6-BA KT
皮尔逊相关系数 － 0．402＊＊ 0．030 － 0．566＊＊
显著性 0．000＊＊ 0．741 0．000＊＊
协方差 － 0．123＊＊ 0．003 － 0．086＊＊
1)* 表示在 0．01 水平上达极显著相关。
各生长调节剂对香竹愈伤组织增殖的影响作用
顺序为:KT ＞2，4-D ＞ 6-BA，其中，2，4-D 和 KT 的用
量与增殖倍数呈极显著相关性，而且都是负相关，即
浓度越高愈伤组织的增殖倍数越低。因此，应尽量
降低 2，4-D和 KT的浓度(表 4)。
3 结论与讨论
香竹的愈伤组织诱导单纯从生长调节剂因素来
考虑，可以通过 2，4-D和 6-BA组合来实现，试验中可以产生 3 种不同类型的愈伤:Ⅰ型为增殖和分化的最
佳愈伤，其形态呈松散颗粒状，结构致密，色泽鲜亮，多为黄绿色或紫色;Ⅱ型为浅褐色的粘性愈伤，此类愈
伤在出愈的最初阶段多易发生，愈伤为团状，水渍化，无法分离;Ⅲ型为褐色致密愈伤，愈伤坚硬且褐化严
·05· 福 建 林 学 院 学 报 第 33 卷
重，出愈后不久便死亡。王海波［10］又将以上 3 种类型的愈伤组织称为保守分裂型或易分化型(Ⅰ型) ，亢
进分裂型或旺盛分裂型(Ⅱ型) ，衰败型(Ⅲ型)。愈伤组织的这 3 种状态与之后的愈伤分化成芽的情况紧
密相关，愈伤组织的分化能力大小为:致密 ＞粘褐 ＞松散［11］。不过 I 型与Ⅱ型之间可以在一定程度上通
过调整互相转变，另外，Ⅲ型细胞也可在一定程度上被控制［10］。
在用无菌茎段诱导愈伤组织时，没有得到Ⅰ型愈伤组织，后来调整 2，4-D浓度至 1．0 mg·L －1时诱导成
功。较幼嫩茎段不易诱导出愈伤组织，当无菌芽长到 4 － 5 cm时，取下端较老的茎段较易诱导出保守分裂
型愈伤组织。无菌根的根冠相较其他部位更易产生愈伤组织。试验中将无菌嫩叶在上端下端和中部 3 个
部位切开诱导愈伤组织，但均无愈伤组织产生，后期应该尝试较老叶片的愈伤诱导实验。
在竹子组织培养中常用 2，4-D + KT 和 NAA + 6-BA 组合来诱导愈伤组织［12］。试验中，2，4-D 浓度为
2．0 － 4．0 mg·L －1时，均能诱导出愈伤组织，但是当浓度为 2．0 和 4．0 mg·L －1时，诱导的愈伤组织极易褐
化，通过调节 2，4-D和 6-BA之间的比例可以对香竹愈伤组织的状态进行调控，并且当 2，4-D 与6-BA比例
为 6∶ 1 时实现了愈伤组织由Ⅲ型向 I型调整。
在增殖阶段，愈伤对 2，4-D 的依赖不再像诱导阶段一样高，但仍需维持在一定浓度，低浓度的 BA 对
愈伤的增殖有良好的效果［13］，试验中，当 6-BA浓度为 2．0 mg·L －1时，诱导形成的愈伤组织老化严重，而当
浓度为 0．5 mg·L －1时，增殖倍数较低，因此仅在浓度为 0．5 － 2．0 mg·L －1范围内寻找低浓度的较优增殖激
素配比。试验中添加 KT对愈伤增殖的影响甚至大于 2，4-D 的影响，但加入浓度过高反而会降低增殖倍
数，故香竹愈伤增殖应该加入低浓度的 KT较好。
参考文献
［1］卓仁英．竹子生物技术育种研究进展［J］．浙江林学院学报，2003，20(4) :424 － 428．
［2］Hassan A A，Debergh P． Embryogenesis and plantlet development in the bamboo Phyllostachys viridis (Young)McClure［J］．
Plant Cell Tissue and Organ Culture，1987，10(1) :73 － 77．
［3］Chambers S，Heuch J，Pirrle A． Micropropagation and in vitro flowering of the bamboo Dendrocalamus hamiltonii Munro［J］．
Plant Cell Tissue and Organ Culture ，1991，27(1) :45 － 48．
［4］Rao I U，Ramanuja R I，Narang V． Somatic embryogenesis and regeneration of plants in the bamboo Dendrocalamus strictus［J］．
Plant Cell Reports，1985，4(4) :191 － 194．
［5］阙国宁，诸葛强．竹子愈伤组织培养与植株再生［J］．竹子研究汇刊，1991，10(4) :79 － 80．
［6］辉朝茂，杨宇明，杜凡，等．云南竹林基地建设应重视注重选择和发展区划问题［J］．云南林业，2004，25(2) :24 － 25．
［7］辉朝茂，杨宇明，杜凡，等．云南竹亚科珍稀种质资源及其开花结实研究［J］．世界竹藤通讯，2007，5(2) :15 － 20．
［8］王光萍，丁雨龙．几种观赏竹种组织培养研究［J］．竹子研究汇刊，2002，21(2) :5 － 9．
［9］谭宏超．香竹栽培技术［J］．农村实用技术，2000，5(6) :13 － 15．
［10］王海波．组织培养中细胞状态的调控［J］．作物杂志，1991，3(1) :3 － 6．
［11］王裕霞，曾庆圣，陈远玲，等．丛生观赏竹的组织微繁殖与诱变个体的初步研究［J］．竹子研究汇刊，2007，26(4) :11 －16．
［12］吴益民．当前竹子的组织培养和植株再生研究［J］．竹子研究汇刊，1999，18(1) :32 － 37．
［13］吴涛，卢娟娟，丁雨龙．金丝慈竹愈伤组织培养及植株再生研究［J］．林业科技开发，2008，22(2) :19 － 22．
( 责任编辑: 江 英)
·15·第 1 期 孙瑞明等:香竹愈伤组织诱导研究