全 文 ：第３４卷 第４期　　　　　 　　　　　 渔　业　科　学　进　展　 Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．４
２　０　１　３ 年 ８ 月　　　　　　　　ＰＲＯＧＲＥＳＳ　ＩＮ　ＦＩＳＨＥＲＹ　ＳＣＩＥＮＣＥＳ　 Ａｕｇ．，２０１３
大叶藻ＥＳＴ－ＳＳＲ标记开发及其在
大叶藻群体遗传多样性研究中的应用
刘福利１　刘　坤１，２　王飞久１＊　孙修涛１　汪文俊１　梁洲瑞１　马兴宇１，２
（１农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛２６６０７１）
（２上海海洋大学水产与生命学院，２０１３０６）
摘　要　　本研究从ＮＣＢＩ的ＥＳＴ数据库中下载大叶藻ＥＳＴ序列共计１０　６５９条，从中得到ＳＳＲ位
点共６５个，ＳＳＲ发生频率为１．７％，平均分布距离为２１．７ｋｂ。其中三核苷酸为优势重复类型，占
４９．２％，二核苷酸数量仅次于三核苷酸，占３３．８％。基于６５条含有ＳＳＲ的ＥＳＴ序列，设计并合成了
３０对引物，其中２６对引物的扩增产物单一，片段大小与预测的相近或较大。在由１６个大叶藻个体
组成的群体中，其中８对引物的扩增条带具有多态性。利用这８对引物对青岛汇泉湾大叶藻自然群
体进行了遗传多样性分析，结果表明，８个ＳＳＲ共检测出３３个等位基因，平均每个ＳＳＲ能检测出４．１
个等位基因，多个遗传多样性参数表明，青岛汇泉湾大叶藻群体具有较高的遗传多样性（Ｈｏ＝０．５３８
２；Ｈｅ＝０．５７７　６；Ｉ＝０．５６０　７）。本研究开发的ＥＳＴ－ＳＳＲ标记，可进一步丰富大叶藻ＳＳＲ标记信息，
为大叶藻分子生态和群体遗传研究提供更多的标记选择。
关键词　　大叶藻　　ＥＳＴ　　ＳＳＲ　　遗传多样性
中图分类号　Ｑ９４８．８　　文献识别码　Ａ　　文章编号　１０００－７０７５（２０１３）０４－００９１－０７
国家公益性行业（农业）科研专项（２０１００３０６８）资助
＊通讯作者。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｆｊ＠ｙｓｆｒｉ．ａｃ．ｃｎ，Ｔｅｌ：（０５３２）８５８３８６７３
收稿日期：２０１２－０７－１２；接受日期：２０１２－１２－０４
作者简介：刘福利（１９８３－），男，博士，助理研究员，主要从事经济海藻研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｆｌ＠ｙｓｆｒｉ．ａｃ．ｃｎ，Ｔｅｌ：（０５３２）８５８３８６７３
ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａｒｉｎａ
ＬＩＵ　Ｆｕ－ｌｉ　１　ＬＩＵ　Ｋｕｎ１，２　ＷＡＮＧ　Ｆｅｉ－ｊｉｕ１＊　ＳＵＮ　Ｘｉｕ－ｔａｏ１　
ＷＡＮＧ　Ｗｅｎ－ｊｕｎ１　ＬＩＡＮＧ　Ｚｈｏｕ－ｒｕｉ　１　ＭＡ　Ｘｉｎｇ－ｙｕ１，２
（１　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，
Ｙｅｌｏｗ　Ｓｅａ　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｆｉｓｈｅｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６０７１）
（２　Ａｑｕａｔｉｃ　ａｎｄ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｈｏｏｌ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１３０６）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ　　Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　１０　６５９　Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａｒｉｎａ　ＥＳＴ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｏｗｎｌｏａｄ－
ｅｄ　ｆｒｏｍ　ＮＣＢＩ　ｄａｔａｂａｓｅ，ｆｒｏｍ　ｗｈｉｃｈ　６５ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｌｏｃｉ　ｗｅｒｅ　ｓｅａｒｃｈｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ
１．７％ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｎｇ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　２１．７ｋｂ．Ｏｕｔ　ｏｆ　ａｌ　ｔｈｅ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｍｏｔｉｆｓ，ｔｈｅ　ｔｒｉ－
ｍｅｒ　ｗａｓ　ｄｏｍｉｎａｎｔ　ａｔ　ａ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　４９．２％，ｆｏｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｄｉｍｅｒ　ａｔ　ａ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　３３．８％．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ
ｓｅａｒｃｈｅｄ　６５ＥＳＴ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，３０ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ，ｏｆ　ｗｈｉｃｈ　２６
ｐａｉｒｓ　ｈａｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ｕｎａｍｂｉｇｕｏｕｓ　ｂａｎｄｓ　ａｔ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｏｒ　ｌａｒｇｅｒ　ｓｉｚｅ　ｔｈａｎ　ｅｘｐｅｃｔｅｄ．
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　渔　业　科　学　进　展 第３４卷　
Ｕｓｉｎｇ　ｅｉｇｈｔ　ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｉｎ　ａ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　１６ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ，ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ　Ｚ．ｍａｒｉｎａｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｈｕｉｑｕａｎ　Ｂａｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ．Ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　３３ａｌｅｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂ－
ｔａｉｎｅｄ　ａｔ　ａｎ　ａｖｅｒａｇｅ　ｏｆ　４．１ａｌｅｌｅｓ　ｐｅｒ　ｌｏｃｕｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｐｏｐｕｌａ－
ｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｈｉｇｈ（Ｈｏ＝０．５３８　２；Ｈｅ＝０．５７７　６）．Ｔｈｅ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｉｎ
ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｗｉｌ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｄａｔａ　ｆｏｒ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｚ．ｍａｒｉｎａ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ　　Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａｒｉｎａ　　ＳＳＲ　　ＥＳＴ　　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
大叶藻隶属于沼生目 Ｈｅｌｏｂｉａｅ、大叶藻科Ｚｏｓｔｅｒａｃｅａｅ、大叶藻属Ｚｏｓｔｅｒａ，生长于低潮带和潮下带浅海区，
是北半球沿海分布最广泛的一类海草，在我国广泛分布于山东、河北、辽宁沿海。作为海草的一个优势种，大叶
藻可形成海草场，是近海典型生态系统之一，具有重要的生态和经济价值（Ｏｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ．　２００６；Ｈｅｍｍｉｎｇａｅｔ
ａｌ．　２０００）。然而，由于人为因素干扰和气候变化（Ｗａｙｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ．　２００９），在全球范围内大叶藻正经历着严
重的衰退（Ｓｈｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６）。近年来有关大叶藻自然群体衰退原因的探究渐渐成为近海生态系统研究的
焦点之一。生物群体的遗传结构和遗传多样性，既是生物群体对环境长期适应的结果，也是影响生物群体对环
境适应力的关键影响因子。因此，应用分子生态学和群体遗传学的原理和方法，研究大叶藻群体遗传结构和遗
传多样性与环境间的相互作用，对解析大叶藻衰退原因具有重要意义。
作为第二代分子标记的代表，简单重复序列（Ｓｉｍｐｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）又称微卫星（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ）
标记，具有高丰度、高重复性、多等位基因和共显性遗传等优点，一直是分子生态学和群体遗传学的首选标记
（Ｐｏｗｅｌ　ｅｔ　ａｌ．　１９９６；Ｎｙｂｏｍ　２００４）。根据来源不同，ＳＳＲ标记可分为基因组ＳＳＲ（Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＳＳＲ）和表达序
列标签ＳＳＲ（ＥＳＴ－ＳＳＲ），前者需要建库和测序导致成本较高（Ｚａｎｅ　ｅｔ　ａｌ．　２００２），而随着公共数据库里ＥＳＴ
数据的积累，ＥＳＴ序列渐渐成为开发ＳＳＲ标记的重要资源。相对于Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＳＳＲ，ＥＳＴ－ＳＳＲ具有开发成本
低、可在近缘物种中交叉使用和可作为功能性标记等优点（Ｖａｒｓｈｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．　２００５）。对大叶藻而言，Ｒｅｕｓｃｈ
等（１９９９、２０００）应用富集文库的方法开发了１２个Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＳＳＲ；Ｐｅｎｇ等（２０１２）应用富集文库的方法开发了１９
个Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＳＳＲ标记；Ｏｅｔｊｅｎ等（２００７）利用他们构建的ＥＳＴ数据库中的１　１０３条序列开发了１４个ＥＳＴ－ＳＳＲ
标记。此后，又有一批新的ＥＳＴ数据被添加到公共数据库（Ｒｅｕｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ．　２００８；刘利民等　２０１０），截止２０１２
年６月，ＮＣＢＩ数据库中大叶藻的ＥＳＴ序列已高达１０　６５９条。为了进一步丰富大叶藻ＳＳＲ标记信息，增加
ＳＳＲ标记在大叶藻基因组的覆盖度，为大叶藻分子生态和群体遗传研究提供更多的标记选择，最终为更全面
地了解大叶藻遗传多样性和遗传结构服务，本研究利用最新的大叶藻ＥＳＴ信息，从中开发一批新的ＥＳＴ－ＳＳＲ
标记，并应用这些ＥＳＴ－ＳＳＲ标记分析评价了山东省青岛市汇泉湾大叶藻群体的遗传多样性。
１　材料与方法
１．１　大叶藻样本
本研究所应用的大叶藻样品，于２０１１年６月１７日采自山东省青岛市汇泉湾。随机取样，样本间至少间隔
２ｍ，样本量为２４个个体。采集好的样品用海水初步清洗，装入封口袋，做好标记带回实验室，用灭菌海水清
洗，彻底清除附着物，于－２０℃保存以备基因组ＤＮＡ提取。
１．２　大叶藻基因组提取
大叶藻基因组ＤＮＡ采用ＴｉａｎＧｅｎ植物基因组提取试剂盒（ＴｉａｎＧｅｎ生物技术有限公司，北京）进行提取，
具体步骤参见其说明书。应用电泳和ＤＮＡ定量仪两种方法检测基因组ＤＮＡ的质量。
１．３　大叶藻ＥＳＴ－ＳＳＲ标记开发
大叶藻的 ＥＳＴ 来自 ＮＣＢＩ（美国国家生物技术信息中心）数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
２９
　第４期 　　刘福利等：大叶藻ＥＳＴ－ＳＳＲ标记开发及其在大叶藻群体遗传多样性研究中的应用
ｄｂＥＳＴ）。从数据库直接获取的ＥＳＴ中包含一些低质量片段，在搜索ＳＳＲ前应对这些ＥＳＴ进行预处理，然后
应用在线软件ＳＳＲＩＴ（ｈｔｔｐ：／／ａｃｏｒｎ．ｃｓｈｌ．ｏｒｇ／ｄｂ／ｓｅａｒｃｈｅｓ／ｓｓｒｔｏｏｌ）搜索ＥＳＴ中的ＳＳＲ序列。搜索的标准为：
重复序列不少于１８～２０核苷酸，即二核苷酸（Ｄｉｍｅｒ）重复至少１０次，三核苷酸（Ｔｒｉｍｅｒ）至少重复６次，四核苷
酸（Ｔｅｔｒａｍｅｒ）至少重复５次，五核苷酸（Ｐｅｎｔａｍｅｒ）至少重复４次，六核苷酸（Ｈｅｘａｍｅｒ）至少重复３次以上。应
用引物设计软件Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０设计引物，扩增片段长度在１５０～３５０ｂｐ之间，最长不超过５００ｂｐ，引物
由上海生工生物技术有限公司合成。
ＰＣＲ反应体系和程序参考Ｏｅｔｊｅｎ等（２００７），不同引物对的退火温度不同，具体参考表格２。ＰＣＲ扩增产
物应用８％的聚丙烯酰胺凝胶进行分离，电泳结束后参照Ｂａｓｓａｍ等（１９９１）的方法进行银染显色。
１．４　青岛汇泉湾大叶藻群体遗传多样性的ＥＳＴ－ＳＳＲ分析
利用筛选的８对大叶藻ＥＳＴ－ＳＳＲ标记，对青岛汇泉湾大叶藻自然群体（ｎ＝２４）进行基因分型，评价其遗传
多样性水平。
１．５　数据处理
ＥＳＴ－ＳＳＲ标记开发成功的标准为：ＥＳＴ－ＳＳＲ标记的引物对能在ＰＣＲ反应中扩增出单一的目的条带，没
有或仅有微弱的非特异性扩增，并且在检验群体中表现出一定的多态性。利用ＰＯＰＧＥＮＥ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．３１（Ｙｅｈ
ｅｔ　ａｌ．　１９９９）软件计算群体的遗传多样性参数：等位基因数Ｎａ、有效等位基因数Ｎｅ；Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数Ｉ；
观察杂合度Ｈｏ；期望杂合度Ｈｅ。应用在线软件Ｇｅｎｅｐｏｐ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｐｏｐ．ｃｕｒｔｉｎ．ｅｄｕ．ａｕ／）检验各ＥＳＴ－ＳＳＲ
标记位点是否在大叶藻群体中遵循 Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡，检验ＥＳＴ－ＳＳＲ标记位点间是否存在连锁不平衡。
２　结果
２．１　基因组ＤＮＡ质量检测
电泳检测所提取基因组ＤＮＡ样品的质量，结果显示每一样品在电泳时均形成明显的一条主带，与分子量
标准对照，大小约为２３ｋｂ。ＤＮＡ定量仪测定所得的ＤＮＡ溶液ＯＤ值在１．６～１．８之间，所得ＤＮＡ样品的浓
度在２０～５０ｎｇ／μｌ左右。电泳和定量仪的检测结果均表明所获得大叶藻基因组ＤＮＡ样本质量较高，可以用
于下游的实验。
２．２　大叶藻ＳＳＲ在ＥＳＴ中的分布特征
从ＮＣＢＩ的ＥＳＴ数据库中下载大叶藻ＥＳＴ序列共计１０　６５９条，经过预处理后，选择其中高质量的、无冗
余ＥＳＴ序列３８２３条用于ＳＳＲ搜索，结果共搜索得到６５个ＳＳＲ，ＳＳＲ在ＥＳＴ序列中的发生频率为１．７％（含
有ＳＳＲ的ＥＳＴ与无冗余ＥＳＴ总数之比），ＥＳＴ－ＳＳＲ的平均分布距离为２１．７ｋｂ。在６５个大叶藻ＥＳＴ－ＳＳＲ
中，其中二核苷酸共有２２个，三核
表１　大叶藻ＥＳＴ－ＳＳＲ中不同重复单元及其频率
Ｔａｂｌｅ　１　Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｍｏｔｉｆ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｉｎ　Ｚ．ｍａｒｉｎａ
重复单元 Ｍｏｔｉｆ　　　
数量
Ｎｕｍｂｅｒ
比例
Ｒａｔｉｏ（％）
单元类型数
Ｎｏ．ｏｆ　ｍｏｔｉｆ
最大重复数
Ｍａｘｉｍｕｍ　ｒｅｐｅａｔ
二核苷酸 Ｄｉｍｅｒ　 ２２　 ３３．８　 ６　 ３６
三核苷酸 Ｔｒｉｍｅｒ　 ３２　 ４９．２　 １９　 １０
四核苷酸 Ｔｅｔｒａｍｅｒ　 ８　 １２．３　 ６　 ８
五核苷酸Ｐｅｎｔａｍｅｒ　 ２　 ３．１　 ２　 ６
六核苷酸 Ｈｅｘａｍｅｒ　 １　 １．５　 １　 ４
苷酸共有３２个，四核苷酸共有８个；五
核苷酸和六核苷酸分别共有２个和１个
（表１）。其中三核苷酸为优势重复类
型，共占ＥＳＴ－ＳＳＲ总数的４９．２％，二核
苷酸数量仅次于三核苷酸，占３３．８％，
而六核苷酸重复类型最少，仅有１个，仅
占１．５％（表１）。共检测到３４个重复单
元类型，二核苷酸到六核苷酸中检测到
重复单元类型分别有６、１９、６、２和１个
（表１）。二核苷酸至六核苷酸平均基元
３９
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　渔　业　科　学　进　展 第３４卷　
长度变化范围差异很大，二核苷酸的最大重复次数最大，可达３６次，六核苷酸的最大重复次数最小，只有４次
（表１）。
２．３　大叶藻ＥＳＴ－ＳＳＲ标记引物设计和筛选
基于搜索得到的６５条含有ＳＳＲ的大叶藻ＥＳＴ序列，设计并合成了３０对引物（表２）。随机取４个大叶藻
个体，对３０对引物进行初步筛选。结果表明３０对引物均有扩增产物，其中有４对引物非特异性扩增较多，目
的条带不明确，将这些引物对舍弃；其余２６对引物的扩增产物单一，片段大小与预测的相近或较大，保留这些
扩增产物清晰、明亮的引物对，并将它们作为成功开发的大叶藻ＥＳＴ－ＳＳＲ标记（表２）。然后，随机取１６个大
叶藻个体，筛选在１６个个体间具有多态性的引物对，结果表明其中８对引物对的扩增条带具有多态性（表２），
每对引物在１６个个体中最多能扩增出５个等位基因，最少能扩增出两个等位基因，共扩增出２８个等位基因，
平均每对引物扩增出３．５个等位基因。其余１８对引物在１６个个体中都能扩增出清晰明亮的预期条带，但是
都不具有多态性，至于它们是否确实不具多态性还需要在其他大叶藻群体中进一步检验。
表２　大叶藻ＥＳＴ－ＳＳＲ标记的引物信息
Ｔａｂｌｅ　２　Ｐｒｉｍｅｒ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ＥＳＴ－ＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　Ｚ．ｍａｒｉｎａ
编号
Ｎｕｍｂｅｒ
序列号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．
序列（５′－３′）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
重复单元
Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｕｎｉｔ
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
产物长度
Ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ
ａｍｐｌｉｃｏｎ
多态性
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
１ ＨＳ０９０９６７ ＧＡＡＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＴＣＡＣＴＣ　 ＡＧ　 ６２．５　 ３７９ 无 Ｎｏ
ＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＣＣＧＡＡＣＡ　 ６０．６
２ ＡＭ７６８８８９ ＴＧＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡＣＴＴＡＣＧＣ　 ＴＣ　 ５０　 ２１７ 无 Ｎｏ
ＴＧＡＣＣＧＣＡＡＴＡＧＧＡＣＡＡＣＣＡ　 ５０
３ ＡＭ４０８８４３ ＣＧＴＡＧＡＴＡＡＣＧＡＣＣＧＣＡＧＡＧ　 ＣＴＴ　 ５６．１　 １９４ 有 Ｙｅｓ
ＧＡＧＧＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧ　 ５８．３
４ ＨＳ０９１４４１ ＧＣＣＡＣＴＣＡＡＡＡＣＡＴＡＣＡＡＡＡ　 ＴＣＴ　 ５１．１　 １６６ 有 Ｙｅｓ
ＡＴＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧＡＴ　 ５１．２
５ ＡＭ７６６５９０ ＴＡＡＣＴＣＴＧＣＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧ　 ＴＴＣ　 ５５．３　 ３５５ 无 Ｎｏ
ＡＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＡＴ　 ５５．６
６ ＡＭ７６８７９９ ＣＧＴＣＴＴＣＡＴＣＣＣＴＡＣＣＡＣＣＡ　 ＴＴＣ　 ５８　 １０４ 有 Ｙｅｓ
ＡＴＴＣＧＴＴＴＧＣＴＧＴＣＧＴＣＣＴＣ　 ５７．５
７ ＡＭ７６７３２６ ＧＧＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＡＴＡＡＡＣＧＧＡＣＡＡ　 ＡＴＡＧ　 ６０．４　 ３５２ 有 Ｙｅｓ
ＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡ　 ６０．１
９ ＨＳ０９０２９０ ＴＣＴＣＣＡＡＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＧ　 ＴＡ　 ６２．３　 ６４８ 无 Ｎｏ
ＣＡＡＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＡＡＧＴＣＣＧ　 ５２．９
１０ ＡＭ７７２５８７ ＴＣＡＧＴＣＡＣＧＧＴＴＣＣＣＴＡＣＧＡ　 ＧＡＣ　 ５８．５　 ２３１ 无 Ｎｏ
ＡＴＡＣＧＧＧＣＴＡＣＣＣＡＣＴＣＴ　 ５９．２
１１ ＡＭ７７０３１０ ＡＧＧＴＴＴＧＡＣＣＡＡＣＧＧＡＧＡＴＴ　 ＴＣＴ　 ５５．８　 ２５４ 无 Ｎｏ
ＧＡＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡ　 ５６
１２ ＨＳ０９１７４１ ＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣＣＧＡＴＣＣＴＡＧ　 ＴＧＡ　 ５３．５　 １８１ 无 Ｎｏ
ＴＴＣＡＧＡＴＴＣＣＴＴＴＣＣＣＡＣＡＡ　 ５５．３
１４ ＦＣ８２２５４１ ＴＴＴＣＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＣＣＣＡＣＣ　 ＡＧ　 ５７．３　 ３９４ 无 Ｎｏ
ＡＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＣＡＡＡＣＣＴＡ　 ５７．２
１５ ＦＮ４３５３３８ ＧＣＣＡＣＴＴＣＣＧＴＡＧＴＴＧＣＴＧＴ　 ＡＧ　 ５７．７　 ３９１ 有 Ｙｅｓ
ＡＣＡＡＡＴＡＣＧＡＣＣＣＡＡＡＣＴＧＣ　 ５５．２
４９
　第４期 　　刘福利等：大叶藻ＥＳＴ－ＳＳＲ标记开发及其在大叶藻群体遗传多样性研究中的应用
　　续表２
编号
Ｎｕｍｂｅｒ
序列号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．
序列（５′－３′）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
重复单元
Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｕｎｉｔ
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
产物长度
Ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ
ａｍｐｌｉｃｏｎ
多态性
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
１６ ＡＭ７６８８９６ ＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＴＧＧＴＴＧＣ　 ＴＡ　 ５６．２　 ２０２ 无 Ｎｏ
ＣＣＴＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＴＧＡＡＡＡＴ　 ５３．３
１８ ＡＭ７７１９６９ ＡＧＡＡＧＣＧＴＣＴＣＣＣＴＡＡＧＣＡＡ　 ＡＡＧ　 ５７　 １１３ 无 Ｎｏ
ＡＡＣＣＴＧＣＴＴＧＡＧＡＡＣＣＴＴＧＡ　 ５４．７
１９ ＡＭ７６９４４４ ＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＧＡＴ　 ＡＡＧ　 ６１　 １９１ 无 Ｎｏ
ＧＣＧＡＣＧＧＴＣＡＧＡＣＴＣＣＡＡＡＴ　 ５９．８
２０ ＨＳ０９１７２２ ＣＴＡＣＣＧＴＣＡＧＧＴＴＴＣＴＡＣＴＴ　 ＡＡＴ　 ４８．８　 ９９ 无 Ｎｏ
ＡＣＴＡＡＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＣ　 ５１．６
２１ ＡＭ７６９８４５ ＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＣＧＡＡＡＣＴＣＣＧ　 ＡＧＡ　 ５５．９　 ２３３ 无 Ｎｏ
ＣＡＡＧＧＣＡＴＣＣＡＴＴＣＴＴＡＣＴＣＡＧ　 ５６．９
２２ ＡＭ７６９７６７ ＡＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＴＧ　 ＣＣＡ　 ５２．２　 １５４ 无 Ｎｏ
ＡＴＧＴＧＧＴＴＧＡＣＴＣＧＧＴＡＧＡＡ　 ５２．５
２４ ＡＭ７６６９１４ ＧＧＧＡＣＴＣＡＡＴＡＡＴＴＣＡＣＡＧＡＧＡ　 ＡＧ　 ５３．７　 ２２１ 无 Ｎｏ
ＡＴＧＧＧＣＴＡＣＣＡＧＡＣＧＡＡＡＣＴ　 ５６．３
２５ ＡＭ７６６３１６ ＧＧＧＧＡＣＴＣＡＣＴＣＡＡＴＡＡＴＴＣＡＣ　 ＡＧ　 ５５．５　 ２２４ 有 Ｙｅｓ
ＡＴＧＧＧＣＴＡＣＣＡＧＡＣＧＡＡＡＣＴ　 ５６．３
２６ ＡＭ７６６３７３ ＡＣＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＴＴＴＡＣＣＧ　 ＧＧＡ　 ５７．３　 ２３９ 无 Ｎｏ
ＴＣＣＴＴＣＡＣＡＡＧＣＧＡＡＧＣＡＣＡ　 ６０
２７ ＡＭ７６７８８９ ＧＡＧＡＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＣＣＡＡＧＡＣＡ　 ＴＴＴＧＡ　 ５４．１　 １８１ 无 Ｎｏ
ＴＧＡＣＡＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＡＡＴ　 ５４．７
２８ ＡＭ７７２８５０ ＧＧＧＧＡＣＧＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＴ　 ＣＴ　 ６２．２　 ３７７ 有 Ｙｅｓ
ＴＣＡＡＣＣＣＴＧＧＧＡＡＴＡＣＣＡＴＣＴＴ　 ６０．１
２９ ＡＭ７７１４１１ ＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＴＡＴＣＡＡＣ　 ＡＴＣ　 ４８．６　 ２９４ 有 Ｙｅｓ
ＣＡＧＴＡＣＡＧＧＧＴＴＴＡＧＴＴＴＡＧＡＴ　 ４８．４
３０ ＨＳ０９０３９０ ＴＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＴＡＴＣＴＣＣＡ　 ＴＧＧＣ　 ５２．５　 ３５３ 无 Ｎｏ
ＡＡＣＣＡＣＡＧＡＴＣＡＡＡＴＣＴＡＡＧＡＣ　 ５０．６
１～２１：其中２１个大叶藻个体；Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ
１～２１：２１　Ｚ．ｍａｒｉｎａｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ；Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ
图１　引物对２９在汇泉湾大叶藻群体中的扩增电泳
Ｆｉｇ．１　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｆ　Ｚ．ｍａｒｉｎａ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．２９
２．４　青岛汇泉湾大叶藻群体遗传多样性的
ＥＳＴ－ＳＳＲ分析
　　利用筛选出来的８对大叶藻ＥＳＴ－ＳＳＲ
引物，对２４个个体组成的青岛汇泉湾大叶藻
自然群体进行遗传多样性分析。结果表明，
这些ＳＳＲ标记中，最多能检测出５个等位基
因，最少能检测出３个等位基因，８个ＳＳＲ共
检测出３３个等位基因，平均每个ＳＳＲ能检
测出４．１个等位基因。图１为其中第２９号
引物对在大叶藻自然群体中的扩增电泳图。
利用ＰＯＰＧＥＮＥ软件计算了青岛汇泉湾大
叶藻自然群体的等位基因数（Ｎａ）、有效等位
基因数（Ｎｅ）、Ｓｈａｎｎｏｎ多样性指数（Ｉ）、观察
５９
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　渔　业　科　学　进　展 第３４卷　
杂合度（Ｈｏ）、期望杂合度（Ｈｅ）（表３）。这些参数揭示出青岛汇泉湾大叶藻自然群体具有较高的遗传多样性。
这些ＥＳＴ－ＳＳＲ位点在青岛汇泉湾大叶藻自然群体中符合 Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡，并且这些位点相互独立，彼
此间处于连锁平衡状态（Ｐ＜０．０１）。
表３　青岛汇泉湾大叶藻自然群体的遗传多样性
Ｔａｂｌｅ　３　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｚ．ｍａｒｉｎａｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｈｕｉｑｕａｎ　Ｂａｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ
Ｎａ Ｎｅ　 Ｉ　 Ｈｏ　 Ｈｅ
４．１２３　５±０．２４０　５　 ３．９８７±０．４１４　６　 ０．５６０　７±０．１０８　０　 ０．５３８　２±０．０３８　９　 ０．５７７　６±０．０２３　１
３　讨论
由于Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＳＳＲ开发过程繁杂、成本较高，大叶藻Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＳＳＲ分子标记罕有报道（Ｒｅｕｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ．　
１９９９、２０００；Ｐｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．　２０１２）；对ＥＳＴ－ＳＳＲ而言，虽然公共数据库中已有大量的大叶藻ＥＳＴ（Ｒｅｕｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ．
　２００８；刘利民　２０１０），但是目前仅有Ｏｅｔｊｅｎ等（２００７）利用他们构建的ＥＳＴ数据库中的１　１０３条序列开发了
１４个ＥＳＴ－ＳＳＲ标记。本研究利用最新的大叶藻ＥＳＴ信息，从中开发了２６个新的ＥＳＴ－ＳＳＲ标记，可进一步
丰富大叶藻ＳＳＲ标记信息，增加ＳＳＲ标记在大叶藻基因组的覆盖度，为大叶藻分子生态和群体遗传学提供更
多的标记选择，从而服务于大叶藻遗传多样性和遗传结构等相关研究。
大叶藻ＥＳＴ序列中含ＳＳＲ的比率１．７％，稍微偏离了ＥＳＴ文库中大约２％～１１％的ＥＳＴ序列中含有
ＳＳＲ的推测（Ｃｏｒｄｅｉｒｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００１）。大叶藻ＥＳＴ序列平均每２１．７ｋｂ含有一个ＳＳＲ，故其ＥＳＴ－ＳＳＲ的密度
高于玉米（２８．３ｋｂ）和大豆（２３．８ｋｂ）（Ｇａｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００３），而低于拟南芥（１４．９ｋｂ）、小麦（１５．６ｋｂ）、棉花
（２０．０ｋｂ）、水稻（１１．８ｋｂ）、大白菜（１０．３ｋｂ）和油菜（４．３４ｋｂ）（李永强等　２００４；葛　佳等　２００５；李小白等　
２００７）。值得注意的是，不同的研究者得到的ＥＳＴ－ＳＳＲ密度存在差异，这可能与ＥＳＴ的数量、搜索ＳＳＲ软件
的算法与ＳＳＲ标准的参数设定等多种因素有关。
大叶藻ＥＳＴ－ＳＳＲ中三核苷酸重复所占的比例最高为４９．２％，与已报道的甘蔗、棉花、水稻、玉米、小麦、大
白菜、番茄、香蕉和拟南芥中三核苷酸类型所占比例最高的结果一致（Ｃａｒｄｌｅ　ｅｔ　ａｌ．　２０００；王静毅等　２００８）。
在所有大叶藻重复单元类型中，出现频率最高的是ＡＡＧ／ＣＴＴ，占所有三核苷酸重复类型总数的２６．３％，与甘
蓝、大白菜、油菜、拟南芥和大豆中都是ＡＡＧ／ＣＴＴ出现频率最高的结果相一致。Ｇａｏ等（２００３）推测双子叶植
物中ＡＡＧ／ＣＴＴ重复丰度很高，尽管大叶藻属于单子叶植物，但是其ＡＡＧ／ＣＴＴ重复类型频率最高，这可能
提示单子叶植物中也具有高丰度的ＡＡＧ／ＣＴＴ重复。
利用本研究筛选的８个ＥＳＴ－ＳＳＲ标记分析评价了青岛汇泉湾大叶藻自然群体的遗传多样性，结果表明该
大叶藻群体具有较高的遗传多样性（Ｈｏ＝０．５３８２；Ｈｅ＝０．５７７６）。另外，刘志鸿等（１９９８）、李　渊等（２０１１）分
别应用同工酶和ＡＦＬＰ技术研究，表明青岛地区大叶藻种群具有较高的遗传多样性，与本研究结果相一致。
这些研究都证明了青岛大叶藻群体具有较高的遗传多样性水平，暗示其具有较强的环境适应力。然而，近年来
青岛地区的大叶藻群体却有衰退趋势，这可能因为生境条件变化幅度超出了大叶藻的适应范围。引起生境条
件变化的因素很多，包括气候变化、海洋酸化，尤其是人为因素的影响，如近海污染、围海造田和近岸工程等。
大叶藻组成的海草场是近海典型生态系统之一，具有重要的生态和经济价值。因此，应采取科学有效的保护措
施，一方面通过多种方法提高大叶藻群体自身的环境适应力，另一方面要尽量减少人为干扰，来保育大叶藻群
体，以发挥其重要的生态效应。
参　考　文　献
王静毅，陈业渊，刘伟良，武耀廷．２００８．香蕉ＥＳＴ－ＳＳＲｓ的标记与开发与应用·遗传，３０（７）：９３３－９４０
刘利民，孔凡娜，茅云翔，杨　惠．２０１０．大叶藻全长ｃＤＮＡ文库的构建．中国海洋大学学报，４０（１１）：８５－８９
刘志鸿，董树刚，牟海津，杨永杰，高明君．１９９８．青岛汇泉湾大叶藻种群遗传多样性的研究．海洋水产研究，２（１９）：２７－３２
李　渊．２０１１．大叶藻科的系统发育与大叶藻居群遗传学研究．见：中国海洋大学硕士学位论文
６９
　第４期 　　刘福利等：大叶藻ＥＳＴ－ＳＳＲ标记开发及其在大叶藻群体遗传多样性研究中的应用
李小白，张明龙，崔海瑞．２００７．油菜ＥＳＴ资源的ＳＳＲ信息分析．中国油料作物学报，２９（１）：２０－２５
李永强，李宏伟，高丽锋，何蓓茹．２００４．基于表达序列标签的微卫星标记（ＥＳＴ－ＳＳＲｓ）研究进展．植物遗传资源学报，５（１）：９１－９５
葛　佳，谢　华，崔崇士，洪剑明，马荣才．２００５．大白菜表达序列标签ＳＳＲ标记分析．农业生物技术学报，１３（４）：４２３－４２８
Ｂａｓｓａｍ　ＪＢ，Ｃａｅｔａｎｏ－Ａｎｏｌｅｓ　Ｇ，Ｇｒｅｓｓｈｏｆｆ　ＰＭ．１９９１．Ｆａｓｔ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｉｎ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌｓ．Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９６（１）：８０－
８３
Ｃａｒｄｌｅ　Ｌ，Ｒａｍｓａｙ　Ｌ，Ｍｉｌｂｏｕｒｎｅ　Ｄｅｔ　ａｌ．２０００．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｙｓｉｃａｌｙ　ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔｓ　ｉｎ
ｐｌａｎｔｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１５６（２）：８４７－８５４
Ｃｏｒｄｅｉｒｏ　ＧＭ，Ｃａｓｕ　Ｒ，ＭｃＩｎｔｙｒｅ　ＣＬｅｔ　ａｌ．２００１．Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｒｏｍ　ｓｕｇａｒｃａｎｅ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍｓｐｐ．）ＥＳＴｓ　ｃｒｏｓｓ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ　ｔｏ　ｅｒｉａｎｔｈｕｓ
ａｎｄ　ｓｏｒｇｈｕｍ．Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ　１６０（６）：１１１５－１１２３
Ｇａｏ　ＬＦ，Ｔａｎｇ　ＪＦ，Ｌｉ　ＨＷｅｔ　ａｌ．２００３．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｓ　ｉｎ　ｍａｊｏｒ　ｃｒｏｐｓ　ａｓｓｅｓｓｅｄ　ｂｙ　ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕ－
ｌａｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　１２（３）：２４５－２６１
Ｈｅｍｍｉｎｇａ　Ｍ，Ｄｕａｒｔｅ　Ｃ　Ｍ．２０００．Ｓｅａｇｒａｓｓ　Ｅｃｏｌｏｇｙ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ
Ｎｙｂｏｍ　Ｈ．２００４．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｎｕｃｌｅａｒ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ　ｉｎｔｒａｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ．Ｍｏｌ　Ｅｃｏｌ　１３（５）：１１４３－１１５５
Ｏｅｔｊｅｎ　Ｋ，Ｒｅｕｓｃｈ　ＴＢＨ．２００７．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　１４ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＥＳＴ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｓ　ｉｎ　ｅｅｌｇｒａｓｓ（Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａｒｉｎａ）．Ｍｏｌ
Ｅｃｏｌ　Ｎｏｔｅｓ　７（５）：７７７－７８０
Ｏｒｔｈ　ＲＪ，Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ　ＴＪＢ，Ｄｅｎｎｉｓｏｎ　ＷＣｅｔ　ａｌ．２００６．Ａ　ｇｌｏｂａｌ　ｃｒｉｓｉｓ　ｆｏｒ　ｓｅａｇｒａｓｓ　ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ．ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ　５６（１２）：９８７－９９６
Ｐｅｎｇ　Ｊ，Ｚｈａｎｇ　Ｌ，Ｊｉａｎｇ　Ｘｅｔ　ａｌ．２０１２．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａｒｉｎａａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｃｒｏｓｓ－ｓｐｅｃｉｅｓ　ａｍｐｌｉｆｉｃａ－
ｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｚｏｓｔｅｒａ　ｃａｅｓｐｉｔｏｓａ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　Ｇｅｎｅｔ　Ｒｅｓｏｕ　４（２）：４５５－４５８
Ｐｏｗｅｌ　Ｗ，Ｍａｃｈｒａｙ　ＧＣ，Ｐｒｏｖａｎ　Ｊ．１９９６．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｂｙ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔｓ．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ　１（７）：２１５－２２２
Ｒｅｕｓｃｈ　ＴＢＨ．２０００．Ｆｉｖｅ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ｌｏｃｉ　ｉｎ　ｅｅｌｇｒａｓｓ　Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａｒｉｎａ　ａｎｄ　ａ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｃｒｏｓｓ－ｓｐｅｃｉｅｓ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｚ．ｎｏｌｔｉｉ　ａｎｄ　Ｚ．ｊａｐｏｎｉｃａ．Ｍｏｌ
Ｅｃｏｌ　９（３）：３７１－３７３
Ｒｅｕｓｃｈ　ＴＢＨ，Ｓｔａｍ　ＷＴ，Ｏｌｓｅｎ　Ｊ．１９９９．Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ｌｏｃｉ　ｉｎ　ｅｅｌｇｒａｓｓ　Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａｒｉｎａｒｅｖｅａｌ　ｍａｒｋｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｗｉｔｈ　ａｎｄ　ａｍｏｎｇ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．
Ｍｏｌ　Ｅｃｏｌ　８（２）：３１７－３２１
Ｒｅｕｓｃｈ　ＴＢＨ，Ｖｅｒｏｎ　ＡＳ，Ｐｒｅｕｓｓ　Ｃｅｔ　ａｌ．２００８．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ（ＥＳＴ）ｌｉｂｒａｒｉｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｓｅａｇｒａｓｓ　Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａｒｉｎａ
ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｓｔｒｅｓｓ．Ｍａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１０（３）：２９７－３０９
Ｓｈｏｒｔ　ＦＴ，Ｗｙｌｉｅ－Ｅｓｃｈｅｖｅｒｒｉａ　Ｓ．１９９６．Ｎａｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ　ｏｆ　ｓｅａｇｒａｓｓｅｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｃｏｎｓｅｒｖ　２３（１）：１７－２７
Ｖａｒｓｈｎｅｙ　ＲＫ，Ｇｒａｎｅｒ　Ａ，Ｓｏｒｒｅｌｓ　ＭＥ．２００５．Ｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ：ｆｅａｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　２３（１）：４８－５５
Ｗａｙｃｏｔｔ　Ｍ，Ｄｕａｒｔｅ　ＣＭ，Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ　ＴＪＢｅｔ　ａｌ．２００９．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ　ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｓｅａｇｒａｓｓｅｓ　ａｃｒｏｓｓ　ｔｈｅ　ｇｌｏｂｅ　ｔｈｒｅａｔｅｎｓ　ｃｏａｓｔａｌ　ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ
ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，１０６（３０）：１２３７７－１２３８１
Ｙｅｈ　ＦＣ，Ｙａｎｇ　ＲＣ，Ｂｏｙｌｅ　Ｔ　ａｎｄ　２ｏｔｈｅｒｓ．１９９７．ＰＯＰＧＥＮＥ：ｔｈｅ　ｕｓｅｒ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ　ｓｈａｒｅｗａｒｅ　ｆｏｒ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉ－
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｅｎｔｅｒ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｌｂｅｒｔａ，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ
Ｚａｎｅ　Ｌ，Ｂａｒｇｅｌｏｎｉ　Ｌ，Ｐａｔａｒｎｅｌｏ　Ｔ．２００２．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ：ａ　ｒｅｖｉｅｗ．Ｍｏｌ　Ｅｃｏｌ　１１（１）：１－１６
７９