全 文 ：孜然芹子叶愈伤组织诱导及继代培养研究
陈小华 ,高 杰
(新疆农业大学园艺学院 ,乌鲁木齐　830052)
摘　要:探讨孜然芹种子表面消毒的适宜方法 , 以孜然芹无菌苗子叶为外植体 , 研究最适宜愈伤组织诱导及继
代培养的激素种类及浓度 。结果表明:孜然芹种子经70%酒精10 s+0 .1%升汞50 s , 2 0d萌发率可达
97.70%, 污染率 11.11%;子叶切段在光照时间 16 h/ d ,MS+2 , 4-D 2 mg/ L的愈伤组织诱导启动培养基中 , 30
d 愈伤诱导率达 100%, 继代培养在 MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/ L培养基中光照 16 h/ d 培养 20 d , 愈
伤组织增殖率达 67%, 愈伤组织在同种继代培养基中暗培养 20 d ,增殖率达 80%。
关键词:孜然芹;愈伤组织;继代培养
中图分类号:S636.903.52　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-4330(2007)03-0344-05
Research on the Callus Culture Induction and the Secondary Culture
from Cotyledon of Cuminum cyminum L.
CHEN Xiao-hua , GAO Jie
(College of Horticulture , Xinjiang Agricultural University , Urumqi 830052 , China)
Abstract:The ways of the sterilization from the seeds of Cuminum cyminum L.were researched , the
callus were induced from Cotyledon culture in Vitro of Cuminum cyminum L., the secondary culture from
the callus were studied.Germination percentage of the seeds was 97.78%, and contamination percentage was 11.
11% after being sterilized in 70%alcohol for 10 s , and in 0.1%HgCl2 for 50 s .The rate of the callus induction
of Cotyledon culture was 100% following a period of 30 d with 16 hour photoperiod everday on MS basal medium
supplemented with 2 ,4-D 2mg/L.The proliferation rate of callus induction was 67%.The secondary culture was
illuminated for 16 h/d on MS basal culture medium supplemented with NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L to be
cultured 20 d.The rate of growth of callus could be up to 80%after being cultured in a dark condition for 20 d with
the same secondary culture medium.
Key words:Cuminum cyminum L.;callus induction;secondary culture
孜然芹(Cuminum cyminum L.),俗称孜然 ,属伞形科孜然芹属 ,为 1年生或 2年生草本植物 ,原产埃
及 、埃塞俄比亚 。孜然芹属仅有2个种 ,我国有 1种 ,新疆是最主要的产地 ,主要分布在南疆塔里木盆地
西南缘 ,喀什 、和田两地区有大面积商品生产[ 1] 。孜然芹是维吾尔 、哈萨克 、回 、克尔克孜族等各族群众
喜爱的调味品 ,尤其是新疆风味烧烤中的主要调料。此外 ,孜然芹可作药用 ,其入药味辛 ,性温 ,有散寒
止痛 、理气调中的功能[ 2] 。近年来 ,随着需求量的不断增加 ,种植面积也逐年增大 ,但孜然芹的育种工作
却极为滞后 ,现有的品种存在品质差 ,产量低 、品种单一混杂等缺点[ 3] 。与其他多数作物相比 ,孜然芹良
种选育依赖于传统的育种手段 ,其利用范围及育种手段的局限性已日益明显 。实验利用孜然芹离体子
叶培养诱导产生愈伤组织 ,为进一步研究其胚状体的发生 、不定芽产生打下基础 ,也为拓宽变异谱进而
开展优良品种选育奠定基础条件。
1　材料与方法
1.1　材 料
供试材料系 2005年 9月采收的孜然芹种子 ,为托克逊农家品种托克逊孜然 。
1.2　方 法
收稿日期:2006-11-17
基金项目:国家教育部“春晖计划”项目(Z2005-1-65004)
作者简介:陈小华(1979-),男 ,山东人 ,在读硕士生 ,研究方向为蔬菜遗传育种
通讯作者:高杰(1963-),男 ,天津人 , 副教授 ,硕士生导师 ,研究方向为蔬菜种质资源及遗传育种 ,(Tel)0991-8759305 ,(E-mail)gjxjau@
sina.com;ofc111@163.com
新疆农业科学　2007 ,44(3):344-348
Xinjiang Agricultural Sciences
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
1.2.1　建立无菌体系
取粒大饱满无病虫害的孜然芹种子 ,先用 0.1%的抑菌型洗洁精溶液浸泡 20 min ,然后分别用 70%
酒精 、0.1%升汞消毒处理 ,具体为 Ⅰ:70%酒精 30 s+0.1%升汞 5 min;Ⅱ:70%酒精 30 s+0.1%升汞 1
min;Ⅲ:70%酒精 20 s+0.1%升汞 4 min;Ⅳ:70%酒精 10 s+0.1%升汞 1 min;Ⅴ:70%酒精 10 s+0.1%
升汞 50 s;Ⅵ :70%酒精 10 s+0.1%升汞30 s。无菌水冲洗 4 ～ 5次 ,每次 1 min ,接种于 MS+3%蔗糖+
0.6%琼脂 ,pH 5.8的基本培养基上 ,培养温度为 15℃,全黑暗条件下诱导萌芽[ 4] 。每处理 90粒种子 ,
每瓶 15粒 ,2瓶为一次重复 ,三次重复 ,接种 15 d转入 16 h/d光照培养 ,光照强度 2 000 lx 。20 d后统计
发芽率 、污染率 。
发芽率=(发芽种子数/接种种子数)×100%。
污染率=(污染种子数/接种种子数)×100%。
1.2.2　愈伤组织的诱导
将 20 d苗龄的孜然芹无菌苗子叶切成长约 0.5 mm的小段 ,平置于含不同激素组合的MS诱导愈伤
组织培养基(A1:2 ,4-D 0.3 mg/L 、A2:2 ,4-D 0.5mg/L 、A3:2 ,4-D 1.0mg/L 、A4:2 , 4-D 2.0mg/L 、A5:
2 , 4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L、A6:2 ,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L 、A7:2 ,4-D 2.0 mg/L+6-
BA 1.0mg/L 、A8:2 ,4-D 5.0 mg/L 、A9:2 ,4-D 8.0 mg/L 、A10:NAA 0.3 mg/L、A11:NAA 0.5 mg/L 、A12:
NAA 1.0 mg/L)上 ,pH 5.8 ,琼脂 0.6 %,蔗糖 3%。培养温度 27℃±1℃、光照强度2 000 lx 、光照 16 h/d。
每处理30个外植体 ,每瓶 5个 ,2瓶为一次重复 ,三次重复 ,每 3 d观察记录 ,30 d统计愈伤组织诱导率。
诱导率=(产生愈伤组织的外植体数/接种外植体数)×100%。
1.2.3　愈伤组织的继代
将培养30 d的愈伤组织切成直径为3 ～ 4mm的小块接入含不同激素及浓度组合的MS +琼脂
0.6%+蔗糖 3%,pH 5.8的培养基上 ,实验不同激素及激素浓度组合对愈伤组织增殖的影响 。培养温
度27℃±1℃、光照强度 2 000 lx 、光照 16 h/d 。愈伤组织每 15 ～ 20 d继代一次。每处理 30个外植体 ,每
种培养基接6瓶 ,每瓶 5个愈伤组织块 ,2瓶为一次重复 ,三次重复 ,每 7 d观察记录 ,20 d统计愈伤组织
的增殖率 。
增殖率=[(接种 20 d后的愈伤组织直径-初接种的愈伤组织的直径)/初接种的愈伤组织的直径]
×100%。
将同一水平下的愈伤组织切成直径约 1 cm 的小块接入MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.2mg/L+3%
蔗糖+0.6%琼脂 , pH 5.8培养基上暗培养 7 、10 、15和 20 d ,温度 27℃±1℃,实验不同暗培养时间对愈
伤组织增殖的影响 。每处理 30个外植体 ,每种培养基接6瓶 ,每瓶 5个组织块 ,2瓶为一次重复 ,三次重
复 ,20 d统计愈伤组织的增殖率。
增殖率=[(接种 20 d后的愈伤组织直径-初接种的愈伤组织的直径)/初接种的愈伤组织的直径]
×100%。
2　结果与分析
2.1　种子萌发与外植体消毒
过长的消毒时间是孜然芹种子萌发率低的主要原因 。70%酒精与 0.1%升汞之间的交互作用对种
子萌发率的影响有极显著的差异 , Ⅴ和 Ⅵ消毒方法萌发率最高 ,分别为 97.7%和 88.9%,二者之间无显
著差异。两种灭菌方法对种子污染率亦有不同影响:Ⅴ污染率为 11.1%, Ⅵ 为 25.6%,可见Ⅴ灭菌方法
较之Ⅵ 更为适宜 。孜然芹种子在接种 15 d后即可萌发出芽 ,转入光下培养 5 d后可获得绿色健壮的无
菌苗子叶 。表 1
2.2　愈伤组织的诱导
孜然芹无菌苗子叶接种 10 d ,子叶切段均发生卷曲并伸长变宽 ,体积增大为原来的 2 ～ 3倍 ,颜色变
为淡黄绿色 ,部分子叶的叶尖及切口处略带紫红色 。接种 15 d ,在A1 、A2 、A3 、A4 、A8 、A9 、A10 、A11 、A12号培
养基中的外植体切口端膨大 ,而A5 、A6、A7号培养基中外植体无明显变化 。接种30 d A1 、A2、A3 、A4 号培
养基中愈伤组织大量形成 ,其中A4号培养基愈伤组织诱导率为 100%。表 2
·345·3期　　　　　　　　　陈小华等:孜然芹子叶愈伤组织诱导及继代培养研究　　　　　　　　　　
表 1　不同消毒时间的灭菌效果
Table 1　The sterilization effect of different sterilization time
编号
Number
消毒方法
Sterilization method
接种数
No.of inoculation
污染率(%)
Rate of contaminat ion
萌发率(%)
Rate of germination
Ⅰ 70%酒精 30 s+0.1%升汞 5min
70% Spirit 30 s+0.1 Mercuric chlorde 5 min 90 0 0
Ⅱ 70%酒精 30 s+0.1%升汞 1min
70% Spirit 30 s+0.1 Mercuric chlorde 1 min 90 0 35.6
Ⅲ 70%酒精 20 s+0.1%升汞 4min
70% Spirit 20 s+0.1 Mercuric chlorde 4 min 90 3.3 36.7
Ⅳ 70%酒精 10 s+0.1%升汞 1min
70% Spirit 10 s+0.1 Mercuric chlorde 1 min 90 8.9 52.2
Ⅴ 70%酒精 10 s+0.1%升汞 50 s
70% Spirit 10 s+0.1 Mercuric chlorde 50 s 90 11.1 97.7＊＊
Ⅵ 70%酒精 10 s+0.1%升汞 30 s
70% Spirit 10 s+0.1 Mercuric chlorde 30 s 90 25.6 88.9＊＊
　　注:不同组合间进行双因子方差分析(邓肯氏新复极差法测验)
Note:Variance analysis of double factors with different component(Range Method of Dengkenshi)
2.2.1　不同质量浓度2 , 4-D对孜然芹无菌苗离体子叶愈伤组织诱导的影响
2 ,4-D在愈伤组织诱导过程中起的主要因素 。孜然芹离体子叶切段只有在 2 ,4-D的诱导下才产
生愈伤组织 ,2.0 mg/L 2 ,4-D是诱导子叶愈伤组织的最适宜浓度 ,诱导率可达 100%,颜色淡黄色质地
较疏松 ,高浓度的2 , 4-D对愈伤组织的诱导有明显的抑制作用 , 5 mg/L 以上浓度的 2 , 4-D抑制愈伤
组织形成 ,接种的子叶块呈灰白色水浸或褐色水浸状 ,2 , 4-D与 6-BA之间存在负交互作用 ,在添加不
同浓度6-BA的培养基(A7 、A8 、A9)中愈伤组织诱导率为0。表 2
2.2.2　NAA对孜然芹无菌苗子叶愈伤组织诱导的影响
任何浓度的 NAA均不能诱导出愈伤组织。子叶切段在 A10 、A11 、A123种培养基中接种 15 d ,外植体
卷曲 ,切口端及叶尖有不均匀的紫红色 ,接种 30 d颜色转为深褐色质地坚硬 ,失去生活力 ,无愈伤组织
形成 ,只有 A11 、A12号培养基中的外植体在切口端有少量白色须根发生 。表 2
表 2　不同种类及浓度的激素对孜然芹子叶愈伤组织诱导的影响
Table 2　Effect of hormone on callus induction from cotyledons of Cuminum cyminum L.
编号
Number
激素浓度(mg/ L)
Hormone concentration
2, 4-D BA NAA
接种数
Number of
inoculation
愈伤数
No.of explants
growing calls
愈伤率(%)
Callus ind-
uction rate
颜色　　　　　　
Color　　　　　　
A1 0.3 30 15 50 黄色 Yellow
A2 0.5 30 24 80 黄色
A3 1.0 30 8 26.7 黄色
A4 2.0 30 30 100 黄色
A5 2.0 0.2 30 0 0 白色 White
A6 2.0 0.5 30 0 0 白色
A7 2.0 1.0 30 0 0 灰白 Greywhite
A8 5.0 30 0 0 灰白水浸 Greywhite water logging
A9 8.0 30 0 0 灰白水浸
A10 0.3 30 0 0 略带紫红色 Slight ly purplish red
A11 0.5 30 0 0 褐色 Brown
A12 1.0 30 0 0 褐色
2.3　激素种类及浓度对愈伤组织继代培养的影响
接种 20 d后的愈伤组织块在不同继代培养基中增殖的结果表明:不同浓度及不同激素对愈伤组织
增殖存在着较大的差异。
愈伤组织在含NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L和 2 ,4-D 0.3 mg/L 培养基中均有较高的增殖率 ,
均为 67%。含NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L培养基其愈伤组织的质地为瘤状疏松组织 ,颜色为黄绿
色 ,较之含 2 ,4-D 0.3 mg/L培养基中的淡黄 、疏松愈伤组织具有更强的再增殖及分化潜力 ,因此愈伤
组织在继代培养时选用含 MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L 的培养基为宜 。表 3
·346·　　　　　　　　　　　　　　　新疆农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　44卷
表 3　不同种类及浓度的激素对孜然芹子叶愈伤组织继代的影响
Table 3　Effect of hormone on callus division from cotyledons of Cuminum cyminum L.
激素浓度(mg/ L)
Hormone concentration
2 ,4-D NAA IBA BA
接种直径(mm)
Inoculum
diameter
愈伤质地　　　
Cal lus 　　　
quality　　　
愈伤颜色　　　
Callus 　　　
color　　　
增殖直径
(mm)
Proliferation
增殖率
(%)
Proliferation
rate
0.5 3 致密 Close 黄绿 Yellow-green 4 25
0.3 0.2 3 疏松 Loose 淡黄 Light yellow 3 0
0.3 3 疏松 淡黄 5 67＊＊
0.5 0.2 3 瘤状疏松 Tumour like loose 淡黄绿色 Light yellow green 5 67＊＊
0.5 3 疏松 淡黄 4 25
0.3 3 疏松 黄色 4 25
0.1 3 疏松 淡黄 3 0
0.4 0.1 3 疏松 黄绿 4 25
0.3 0.2 3 瘤状疏松 褐绿 Brown-green 4 25
0.4 0.1 3 瘤状 黄绿 4 25
4 疏松 淡黄色 5 25
　　注:不同组合间进行双因子方差分析(邓肯氏新复极差法测验)
Note:Variance analysis of double factors with different component(Range Method of Dengkenshi)
2.3.1　继代过程中愈伤组织的形态结构的变化
继代过程中愈伤组织的颜色 、形态及结构也在发生着变化 ,大致可分为以下 4种类型:(1)愈伤组
织呈淡绿色或绿色 ,结构致密 ,表面呈干燥 ,生长速度慢 ,增殖能力差 。(2)愈伤组织呈淡绿色或绿色 ,结
构疏松 ,表面有许多突起 ,松散水浸状颗粒生长速度较慢 。(3)愈伤组织呈黄绿 、绿色或黄白色 ,结构致
密 ,表面瘤状 ,增殖速度快 。(4)愈伤组织呈灰色或褐色 ,无增殖能力。选择继代培养时应选择(2)和(3)
型愈伤组织 ,其中(3)型的愈伤组织是增殖率最高的和具有分化潜力的愈伤组织类型。
2.3.2　暗培养时间对孜然芹愈伤组织增殖的影响
暗培养 20 d能显著提高子叶愈伤组织的增殖率 ,愈伤组织的质地松脆 ,颜色深黄略带少许白色。多次
继代的结果表明这种愈伤组织具有可持续增殖及分化的潜力。暗处理 30 d以上 ,愈伤组织的体积未见明
显增加 ,且愈伤组织颜色变白质地类似棉絮状 ,愈伤组织块褐化现象严重 ,基本失去生活力。表4
表4　暗培养时间对孜然芹愈伤组织增殖的影响
Table 4　Effect of dark culture on callus proliferation from
cotyledons of Cuminum cyminum L.
暗培养时间(d)
Dark culture days
接种直径(cm)
Inoculum diameter
愈伤质地
Callus quality
愈伤颜色
Callus color
增殖直径(cm)
Proliferation
diameter
增殖率(%)
Proliferation
rate
7 1 瘤状疏松 Tumour like loose 淡黄绿色 Light yellow-green 1.2 20
10 1 瘤状疏松 淡黄绿色 1.3 30
15 1 瘤状疏松 深黄微绿 Dark yellow ligth green 1.5 50
20 1 松脆 Loose 淡黄白色 Light yellow white 1.8 80
30 d以上 More than 30 d 1 较硬 Comparatively hard 白色或褐色 White or brown 1.8 80
3　结论
3.1　不同的植物在诱导愈伤组织时所用激素的种类和浓度是不同的 ,如毛莨科乌头属的黄花乌头在
MS+2 ,4-D 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L 培养基中有较好的愈伤率[ 5] ,乔纳金苹果的叶片在 MS+BA 1.0
mg/L+IAA 0.2 mg/L +2 ,4-D 0.8 mg/L 时诱导率可达 100%[ 6]等等 。在孜然芹的组织培养过程中 ,外
源激素 2 ,4-D是愈伤组织发生的重要条件 。植物生长素 NAA在孜然芹愈伤组织的增殖中是必需因
素 ,细胞分裂素在愈伤组织的增殖过程中起协同作用 。诱导培养基与继代增殖培养基所用的激素种类
及浓度是有差异的 ,2 ,4-D适合愈伤组织的启动培养却不是增殖培养基的最佳激素 。NAA适宜愈伤组
织的增殖 ,却诱导不出愈伤组织 ,生长素与细胞分类素组合在愈伤组织启动培养中是负相关的 ,二者配
合使用抑制愈伤组织的诱导 ,这与马骥[ 7] 、乔琦[ 8]等人的研究结果是一致的 。
3.2　愈伤组织在多次继代及暗培养过程中有褐变现象产生。褐变是由于组织中的酚类物质经氧化后
·347·3期　　　　　　　　　陈小华等:孜然芹子叶愈伤组织诱导及继代培养研究　　　　　　　　　　
产生棕褐色的醌类物质造成的 。这类物质可抑制细胞中其他酶的活性 ,影响细胞的正常代谢 ,严重时可
导致组织的死亡[ 9] 。也有些学者认为 ,产生褐变的原因是由于 PPO(多酚氧化酶)作用与天然底物酚类
物质引起的[ 10] 。GEORGE[ 11] 、刘艳梅[ 12]等人认为 ,通过改变培养条件可以减少褐化的发生 ,如暗中培
养 、连续转移等等。HADRAMI等人通过在培养基中加入抗氧化剂和其他抑制剂来抑制褐化的产生[ 13] 。
有关孜然芹愈伤组织褐化的产生和解决办法还有待探讨。
3.3　适当的暗处理对孜然芹愈伤组织的继代是十分必要的 。实验结果表明:适宜的暗培养时间可以显
著提高愈伤组织的增殖率及改善愈伤组织的质量 。
3.4　有资料显示不同的激素及浓度 、糖浓度[ 14] ,继代培养时间[ 15] 、低温处理[ 16] 、外植体的幼嫩程度[ 17]
等对愈伤组织胚性细胞的形成及分化均有影响 ,有关影响孜然芹离体子叶胚性愈伤组织的形成和分化
还有待进一步探讨。
参考文献:
[ 1] 王济宪.新疆孜然芹[ J] .特种经济动植物 , 2002 ,(7):39.
[ 2] 徐昭玺.百种调料香料类药用植物栽培[ M] .北京:中国农业出版社 ,2003.
[ 3] 刘慧英 ,张凤华 ,吴玲 ,等.孜然的生态适应性与农业技术关系的初步分析[ J] .新疆农业科学 , 2005 , 42(增):28-33.
[ 4] 黄亚军 ,烟彬 ,王美娥.孜然芹种子发芽技术的研究[ J] .种子 , 1997 ,(4):11-12.
[ 5] 李昌禹 ,王英平 ,臧埔 ,等.黄花乌头叶片诱导植株再生研究[ J] .特产研究 , 2005 ,(2):34-37.
[ 6] 于丽艳 ,王志和 ,周波 ,等.苹果离体叶片再生体系两步培养法的研究[ J] .落叶果树, 2005 ,(2):1-4.
[ 7] 马骥 ,乔琦 ,肖娅萍 ,等.防风组织培养中畸形胚状体的发生和控制[ J] .西北植物学报 , 2005 , 25(3):553.
[ 8] 乔琦 ,肖娅萍 ,王哲之.外源激素对防风体细胞胚发生和发育的影响[ J] .西北大学学报 , 2005, 35(3):316-319.
[ 9] HUCY , WANG P J.Handbook of plant cell culture [ J] .Macmillan , 1983 ,(1):177.
[ 10] BHAT S R , CHANDEL K P S.Anovel technique to overcome browning in tissue culture [ J] .Plant Cell Reports ,1991 , 10:358-361.
[ 11] GEORGE E F.Plant propagation by tissue culture part I:The technology Basingsingstoke [M] .UK;Exegtics Ltd , 1993.
[ 12] 刘艳梅 ,张喜春 ,薛玲霞.F1 代番茄的组织培养与植株再生[ J] .蔬菜 , 2000,(3):46.
[ 13] HADRAMI.Efects of gelling agents and liquid medium on embryogenic potential polyami- nes lyamines and enzymatic factors in browning in hevea
brasi liensis calli [ J] .Plant Physiol ,1993 , 141:230-233.
[ 14] 达克东 ,张松 ,李雅志 ,等.苹果离体叶片培养直接体细胞胚胎发生的研究[ J] .园艺学报 ,1996 ,(3):245.
[ 15] 张振霞 ,储成才 ,席嘉宾 ,等.多年生黑麦草种子愈伤组织诱导和植株再生[ J] .草地学报 , 2004,(4):291.
[ 16] 马和平 ,李毅 ,邸利 ,等.枸杞体细胞胚胎发生及植株再生的研究[ J] .甘肃农业大学学报 , 2005 ,(1):29.
[ 17] 任桂芳 ,王建红 ,冯惠 ,等.现代月季(Rosa hybrida)叶片植株再生体系的建立[ J] .园艺学报 , 2004 ,(4):533-535.
·348·　　　　　　　　　　　　　　　新疆农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　44卷