全 文 ：第28卷 第 4期 高 师 理 科 学 刊 Vol. 28 No.4
2008 年 7 月 Journal of Science of Teachers′College and University Jul. 2008
文章编号：1007-9831（2008）04-0062-04
从美国扁柏中分离内生菌
刘军1，2，曹迪 1，赵凯 1 ，平文祥 1 ，周东坡 1
（1. 黑龙江大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150080；2. 齐齐哈尔大学 生命科学与工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006）
摘要：由内生菌生产天然源药物或杀虫剂对人类或畜类大多无毒或低毒，而且不会造成环境污
染．目前国内外已有大量的微生物研究工作集中在植物内生菌上．美国扁柏具有抗腐蚀、抗白蚁
等特性，从美国扁柏中分离到80余种内生菌，经过初筛，确定有抑菌作用的内生菌24株，希望通
过进一步实验，筛选到具有抗菌或抗白蚁作用的高效内生菌．
关键词：美国扁柏；内生菌；分离
中图分类号：Q93-331 文献标识码：A
1 植物内生菌
目前国内外已有大量的研究工作集中在植物内生菌上．随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不断深
入，植物内生菌所发挥的重要生态和生理作用及其作为潜在的生防资源和外源基因载体，日益受到重视，
而且内生菌在农业和医药领域中有着巨大的应用潜力，对植物内生菌的研究已成为国内外研究的热点．
关于内生菌（endophyte）的概念范畴一直有很大的争议，1991 年，Petrini 在 Carroll 和 Clay 提出的概
念范畴基础上进一步扩展，将内生菌定义为：内生菌包括那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织
内，对植物组织没有引起明显病害症状的菌，该定义还包括了那些在其生活史中的某一阶段营表面生的腐
生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根菌[1]．内生菌可通过组织学方法和严格表面消毒的植物
组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物 DNA 的方法来证明其内生[2]．在内生菌的研究中，Petrini 提
出的内生菌的概念被人们广泛地接受．内生菌对于宿主植物而言，通过接种内生真菌可以提高宿主的抗病
能力，还有一些内生真菌可以限制病原菌的发展[3-4 ]．
1993 年，美国学者 Stierle 等首次从短叶紫杉（Taxus brevifolia）的韧皮部中分离出一种新的内生真菌
（Taxomyces andreanae）[5]，可在半合成培养液中产生抗癌药物紫杉醇和紫杉烷类化合物，这一发现为使用
微生物发酵法生产紫杉醇以解决紫杉醇药源危机提供了一条新途径．此后，诸多学者都参与了分离产生紫
杉醇内生菌的工作，并取得了突破性的进展[6-10]．
美国扁柏（Port-orford-cedar）具有抗白蚁、抗腐蚀等特性，Carter和Smythe在研究了11种抗白蚁针叶树
后，发现美国扁柏的浸液对白蚁的毒杀效果最好[11]，而且有学者从美国扁柏中分离到香榧醇、香柏酮等10
多种具有抗白蚁作用的物质[12]．据推测树木的基因可以和内生菌的基因相互传递，生活在植物体这一特殊
环境中的内生菌能产生与宿主相同或相似的代谢产物，所以可以推测美国扁柏的抗腐蚀、抗白蚁化合物可
能由内生菌产生．
2 实验材料与方法

收稿日期：2008-05-20
基金项目：中美国际合作项目（SRS-03-IC-11330131-025）；黑龙江省国际合作重点项目（WB06B11）
作者简介：刘军（1971-），男，黑龙江齐齐哈尔人，讲师，硕士，从事微生物遗传及生物制药研究．E-mail：liujun3117@163.com
通讯作者：周东坡（1941-），男，黑龙江齐齐哈尔人，教授，从事微生物制药研究．E-mail：zhoudp2003@yahoo.com.cn
第 4期 刘军，等：从美国扁柏中分离内生菌 63
2.1 实验材料
美国扁柏（Chamaecyparis lawsoniana）（取样于美国俄勒冈州）；黑翅土白蚁（Odontotermes formosanus）
（取样于武汉市珞珈山）；台湾乳白蚁（Coptotermes formosanus）（取样于美国路易斯安娜州）；指示菌（白
蚁后肠内的分解纤维素、木质素共生菌，本实验从白蚁体内分离）：HDB-II-003，HDB-II-005（来源于黑
翅土白蚁）；HDB-II-L２，HDB-II-L11，HDB-II-L12（来源于台湾乳白蚁）．
2.2 培养基
2.2.1 分离培养基 树木浸汁（树木浸汁的制作：用灭过菌的解剖刀将 5ｇ美国扁柏木材切成小块，加入
100 mL 水，煮沸 30 min 即得树木浸汁）20 mL，琼脂 20 g，水 980 mL，pH 自然．1.05 kg/cm2 灭菌 20 min．
2.2.2 真菌分离培养基 酵母膏 1 g，树木浸汁 20 mL，琼脂 20 g，链霉素终质量分数 30.0 µg/mL，水 980
mL，pH 4.8．1.05 kg/cm2 灭菌 20 min．
2.2.3 细菌分离培养基 牛肉膏 1 g，蛋白胨 1 g，树木浸汁 20 mL，制霉菌素终质量分数 30 µg/mL，琼
脂 20 g，水 980 mL，pH 7.0~7.6．1.05 kg/cm2 灭菌 20 min．
2.2.4 放线菌分离培养基 酵母膏 1 g，树木浸汁 20 mL，CaCO3 0.5 g，琼脂 20 g，水 980 mL，pH
7.2~7.4．1.05 kg/cm2 灭菌 20 min．
2.2.5 牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，水 1 000 mL，pH 7.0～7.2．1.05 kg/cm2
灭菌 20 min．
2.2.6 查氏培养基 蔗糖 30 g， NaNO3 2 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，水 1 000
mL， pH 自然．1.05 kg/cm2灭菌 20 min．
2.2.7 高氏 1 号培养基 可溶性淀粉 20 g，KNO3 1 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4
0.01 g，琼脂 20 g，水 1 000 mL，pH 7.2~7.4．1.05 kg/cm2 灭菌 20 min．
2.3 实验方法
2.3.1 从美国扁柏中分离内生菌 以树皮下韧皮部分为好，切成厚约 5 mm、长宽约 1.0～1.5 cm 的小块，
用 0.1%的升汞（或者 75%的乙醇）处理树木小段 3～5 min，再用无菌蒸馏水清洗 5次除去残留的升汞．把
处理过的小木块接入含有树木浸汁的水琼脂培养基，大约 3～5 d 后在水琼脂培养基上长出菌，然后用三区
划线法把菌接入培养基，分离出单菌落．另取处理过的木块，作为对照组，在培养基表面滚动并轻轻擦拭
后取出，也和实验组同时培养，同样观察确认所分菌是否是从树木中分到的内生菌．实验组中菌落长出后，
从菌落形态上初步分为细菌、真菌、放线菌 3类，分别接入牛肉膏蛋白胨培养基、查氏培养基、高氏培养
基斜面．
2.3.2 用牛津杯法作抑菌实验 以从白蚁体内分离到的有木质素、纤维素分解能力的共生菌作为指示菌，
以树木内生菌作为功能菌进行抑菌实验．
（1）制备素琼脂平板 1 000 mL 水加 20 g 的琼脂，灭菌，倒平板，每个平板倒 10～15 mL 的素琼脂．把
牛津杯插在素琼脂平板上．
（2）取 5 mL 无菌水，加到指示菌保藏管的斜面，在斜面上用接种环轻刮，再用无菌移液管吸打混匀，
吸出备用．
（3）取查氏、牛肉膏蛋白胨液体培养基，加入 0.75%的琼脂制备半固体培养基．
（4）取 20 mL 半固体培养基加入小锥形瓶中，待冷却至 50℃时倾入 2 mL 指示菌悬液，混匀，倒入插
有牛津杯的素琼脂平板上．
（5）待培养基凝固后拔出牛津杯，用移液枪向小孔中加入 100μL 内生菌发酵液，在 4℃冰箱中放置
过夜，使发酵液充分扩散到培养基中，然后细菌在 37℃，真菌在 28℃下培养 72 h，观察并用游标卡尺测定
抑菌圈直径以确定功能菌的抑菌作用．
3 实验结果
通过观察，发现对照培养基上没有生长任何微生物，证明分离到的微生物为植物的内生菌．本试验从
美国扁柏中分离到树木内生菌 80 余株，通过对指示菌的抑菌实验初筛，确定有抑菌作用的内生菌 24 株，
根据参考文献[13-17]的方法初步鉴定，结果见表 1．
64 高 师 理 科 学 刊 第 28 卷
表１ 具有抑菌作用的菌株
菌 株 菌 株
解藻朊类芽孢杆菌（Paenibacillus alginolyticus） +++ 灿烂类芽孢杆菌（Paenibacillus lautus）+++
链球菌 （Streptococcus sp.）+++ 沙雷氏菌 （Serratia sp.）+++
坚硬芽孢杆菌 （Bacillus firmus）++ 侧孢芽孢杆菌 （Bacillus laterosporus）+
枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）+ 酿脓链球菌 （Streptococcus pyogenes）++
青霉属（Penicillium.sp.）+++ 黄曲霉 （Aspergillus flavus）+++
黑曲霉 （Aspergillus niger）++ 赭曲霉 （Aspergillus ochraceus）++
尖镰孢 （Fusarium oxysporum）++ 球孢镰孢 （Fusarium sphaerosporum）++
绿僵菌 （Metarhizium sp.） ++ 红曲菌 （Monascus anka）++
紫红曲霉 （Monascus purpureus）++ 拟葡孢毛霉 （Mucor botryoides）+
指状青霉 （Penicillium dititatum）++ 戴尔根霉 （Rhizopus delemar）++
少孢根霉 （Rhizopus oligosporus）+ 头孢霉属 （Cephalosportium sp.）++
交链孢属 （Alternaria sp.）++ 镰刀菌 （Fusarium sp.）++
注：“+”多少表示功能菌对指示菌的抑菌能力．
4 讨论
内生菌作为微生物中的重要类群，其种、属的数量庞大．有数据显示，51%的从植物内生菌发酵液中
分离的生物活性物质是以前没有发现的化合物，而从土壤微生物发现的新物质仅为 38%．由此可见，研究
植物内生菌，寻找具有药用活性的次生代谢产物是研发新型药物或抗白蚁制剂的重要途径．目前工作的重
点是筛选能产生与树木相同或相似次生代谢产物的菌株，经过遗传育种或改进发酵工艺，有望通过微生物
菌株的发酵产生具有高效生物活性的代谢物以生产新型药物或抗白蚁制剂．
天然药物的筛选已成为现今的一个研究热点，植物是天然药物的主要来源之一．生活在植物组织中的
植物内生菌与植物的关系密切，产生丰富多样的次生代谢产物具有多种生物活性，从中发现新的有潜在应
用价值的化合物切实可行．利用微生物发酵法生产抗菌药物或抗白蚁药剂，具有生产的可重复性，而且具
有微生物生长速率较高、代谢速度快、发酵生产的技术已比较成熟等优点，因此具有极大生产开发优势．随
着科学技术的进步，生物型抗菌剂和白蚁防治剂的开发潜力巨大，虽然其目前仍处于研究的初级阶段，离
实际应用还有相当长的时间，但这种药剂无公害的特点决定了其美好的前景，尤其是从具有抗腐蚀、抑虫、
杀虫作用植物中分离相关内生菌应用于实践，将是世界开发新型环保型抗菌剂和白蚁防治剂的重要领域．本
实验首次从美国扁柏中分离到了细菌、放线菌、真菌共 80 余株，体现了美国扁柏中内生菌的多样性，经过
初筛，确定有抑菌作用的菌 24 株，对以上菌株进行进一步抑菌和杀白蚁试验，希望筛选到高效菌株，为白
蚁的生物防治开辟一条崭新的途径[18]．
参考文献：
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（下转第88页）
88 高 师 理 科 学 刊 第 28 卷
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⎜
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−
110
1912
0812
01
21
20
X ， 解 方 程 得
⎟⎟⎠
⎞
⎜⎜⎝
⎛ −=
046
110
X ．
参考文献：
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The solution of matrix equation AX=B with A singular
GUO Ji-jun1，WANG Wei-bao2
（1. Zhangqiu Branch of Jinan Radio and TV University，Zhangqiu 250200，China；2. Teachers Advanced Study School of Zhangqiu，Zhangqiu 250200，China）
Abstract：Given the method to judge whether the matrix equation BAX = has any solution and how to get the solution
on condition that A is singular．
Key words：singular A；matrix equation；the solution of matrix equation
（上接第64页）
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2005-04-27.
Separating endophytes from port -orford-cedar
LIU Jun 1.2，CAO Di 1，ZHAO Kai 1，PING Wen-xiang 1，ZHOU Dong-po 1
（1. School of Life Science，Heilongjiang University，Harbin 150080，China；
2. School of Life Science and Engineering，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China）
Abstract：Considerable research has focused on endophytes. Natural source pesticides or medicine have the character
of non-toxic，high-effective，non- pollution. Chamaecyparis lawsoniana have the individuality of corrosion proof and
anti-termite. This study has obtained more than 80 strain endophytes from Chamaecyparis lawsoniana and we found
that 24 strains of them can restrain the endogenesis microbes separated from the termite.
Key words：Chamaecyparis lawsoniana；endophyte；separating