全 文 ：2.1　样品的制备测定结果准确与否和样品的初始状态有极大关系 , 样品启封后需尽快处理 , 一般当天启封当天处理。棒曲霉素在碱性条件下极不稳定 ,因此碱洗(净化)操作要迅速 , 碱洗和蒸干会使待测物有损失。在 pH 3-4 之间 , 预处理过的样品在 0℃储存 1个月仍很稳定 , 峰形及峰面积基本保持不变。
2.2　线性关系及最小检出量:在本法确定的实验条件下 ,棒曲霉素在 1-10ng范围内进行峰面积测定。棒曲霉素浓度(mg
L)和峰面积(mV.s)有很好的线性关系。其回归方程为 Y=
0.636X-0.834 , Y为棒曲霉素浓度 , X为峰面积 ,其相关系数 R=0.9980(n=12)。本方法最小检出量为 10μg L。
2.3　加样回收率:向水及浓缩苹果汁中定量加入棒曲霉素标准品 , 按上述方法提取 、净化 、测定 , 计算回收率 , 重复 3 次 , 求平均值 ,结果如表 1。 由表 1 可以看出棒曲霉素回收率较高 ,说明该方法准确可靠。表 1　回收率实验
试样 加入 patulin量(μg) 回收 patulin量(μg)回收率(%)
二次蒸馏水 75 71.85 99.8
无 patulin的苹果汁 100 99.2 99.2
2.4　精密度:制备样品 , 上样 ,重复进样 5 次 ,根据测得棒曲霉素浓度计算其 RSD为 0.4%。
2.5　识谱:在浓缩苹果汁中 ,HMF含量很高 , 其峰形与棒曲霉素相似 ,通过与标准溶液的峰相比较 ,认真识别试样溶液的棒曲霉素峰。
3　结论用高效液相色谱测定浓缩苹果汁中棒曲霉素的含量 , 可操作性强。该方法准确可靠 ,回收率高达 99%以上 ,结果精密度高 ,重现性好 , RSD为 0.4%, 灵敏度高 ,对于 5ml的浓缩苹果汁 ,其检测极限为 10μg L, 可作为广大浓缩苹果汁生产厂测定苹果汁中棒曲霉素含量的准确定量方法。参考文献:[ 1] Steyn Ps ,Vleggear.RMycotoxinsand Phycotoxins[M] .London:Academic
Press , Pall Krogh.1987.[ 2] Tanenbaum S , Bassett E.Occurrence of patulin in apple juice[ J] .Bioche-
mistry Biophysics Actaliment , 1958 , 28(4):21-25.[ 3] Geogre M ,Ware T.High press liquid chromatography method for the deter-
mination of patulin in apple juice[ J] .Journal of the Association of Official
Analytical Chemists, 1975 ,58(4):754-758.[ 4] Helge Stary.High press liquid chromatography method for the determination
of patulin in apple juice[ J] .Journal of the Association of Official Analytical
Chemists , 1978 , 61(6):1359-1362.买麻藤挥发油成分分析刘建华 ,高玉琼 ,霍昕(贵州省生物技术研究基地 , 贵州 贵阳 550002)
摘要:目的:分析买麻藤(Gnetum montanum Markgr.)中的挥发性成分。方法:采用水蒸汽蒸馏法提取买麻藤挥发油 ,用GC-MS进行分离测定。结果:得到83个化合物的峰,鉴定出52个化学成分,占挥发油总量的 87.895%。结论:含量最高的化合物为β -桉叶油醇(14 484%),含量大于 4%的有6个化合物。关键词:买麻藤;水蒸气蒸馏;挥发油;气相色谱-质谱联用 中图分类号:R284　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2003)01-0019-02
收稿日期:2002-09-11;修回日期:2002-12-06基金项目:贵州省跨世纪科技人才工程专项基金资助项目[ 黔科合人专字(2000)9816]作者简介:刘建华(1958-),男 ,副研 ,从事生物制药研发 , 主持完成项目 5项 ,发表论文十余篇 ,获省奖 3项 、地市奖 2项。
　　买麻藤科植物买麻藤 Gnetum montanum Markgr.,主要分布于我国的福建 、广东 、海南 、广西 、云南等地 , 性味苦 、温 , 祛风
除湿 、活血散瘀[ 1] 。 该品的非挥发性成分研究已有报道[2 ,3] ,而挥发性成分未见报道。作者利用气相色谱-质谱-计算机联用系统对买麻藤根茎挥发油化学组成进行了定性定量研究。确定了 52个化合物 , 占挥发油成分的 87.895%。为进一步开发其药用价值及制定其药用标准提供一定的实验数据。
1　仪器 、试剂与材料
1.1　试剂与材料:药材:买麻藤 Gnetum montanum Markgr.(广西产), 一等品 ,买麻藤根茎干品 , 购于贵州中药材医药公司。所用试剂均为国产分析纯。
1.2　仪器:美国惠普公司(Hcwlctt Packard)HP-6890 HP5973
GC-MS 气质联用仪;挥发油提取仪。
2　实验方法
2.1　买麻藤挥发油的提取:取买麻藤干燥藤茎 300g , 粉碎 , 用
10 倍量的水进行水蒸汽蒸馏 , 收集上层油状物 , 得油状物
0.2ml , 收率为 0.067%
2.2　买麻藤挥发油定性定量分析:取买麻藤水蒸气蒸馏提取物适量 ,用乙醚稀释后用 GC MS 进行分离测定。
图 1　买麻藤GC MS图谱
　　气相色谱条件:SE-30弹性石英毛细管柱 30m×250μm×
0.25μm。柱温:50℃, 以 5℃ min 升温至 220℃, 再以 20℃ min升温至 280℃;汽化室温度 250℃;载气:99.999%的氦气;柱前压:52.6kPa;载气流量:1.0ml min;进样量:1μl(乙醚溶液);流速:1ml min;分流比:40 :1。质谱条件:离子源:EI源;离子源温度:230℃;四级杆温度
150℃;电子能量:70eV;发射电流:34.6μA;倍增器电压:1
388V;接口温度:280℃;溶剂延迟:5 min;质量范围 10 ～
550amu。 表 1　买麻藤挥发油的化学成分
序号 保留时间(min) 化合物 分子量 相对百分含量(%)
1 5.88 α-崖柏烯(α-thujene) 136 0.078
2 6.06 α-蒎烯(α-pinene) 13 6 9.281
3 6.41 莰烯(camphene) 136 1.428
4 6.54 马鞭草烯(verbenene) 134 0.077
5 7.11 β-蒎烯(β -pinene) 136 1.994
6 7.48 β-月桂烯(β -myrcene) 136 0.274
7 7.83 α-水芹烯(α-phellandrene) 136 0.374
8 8.38 对聚伞素(P-cymene) 134 0.994
9 8.50 β-水芹烯(β -phellandrene) 136 1.428
10 8.56 1 , 8-桉叶素(1 , 8-cineole) 154 0.228
11 10.47 L-芳樟醇(L-linalool) 154 1.537
12 11.58 松香芹醇(pinocarveol) 152 0.089
13 11.74 樟脑(camphor) 152 0.223
14 12.34 L-龙脑(L-borneol) 154 0.329
15 12.66 萜品烯-4-醇(terpinen-4-o l) 154 0.080
16 13.04 α-萜品醇(α-terpineol) 154 0.134
17 13.26 蒿脑(estragole) 148 3.799
18 14.07 甲酸龙脑酯(bornyl fo rma te) 182 0.555
19 15.65 乙酸龙脑酯(bornyl acetate) 196 0.149
20 17.34 α-毕澄茄油烯(α-cubebene) 204 0.089
21 18.04 α-枯杷烯(α-copaene) 204 0.451
22 18.45 β-榄香烯(β -elemene) 204 1.430
23 18.75 甲基丁香酚(methyl eugenol) 178 0.238
24 18.91 α-古芸烯(α-gurjunene) 204 0.111
25 19.17 β-石竹烯(β - cary ophyl lene) 204 3.234
26 19.40 吉马烯-D(germacrene-D) 204 0.331
27 19.49 γ-榄香烯(γ-elemene) 204 0.119
28 20.02 α- 草烯(α-humulene) 204 0.741
29 20.20 异香橙烯(allourormadendrene) 204 0.240
30 20.55 γ-蛇床烯(γ- se linene) 204 0.972
31 20.83 β-蛇床烯(β - selinene) 204 1.061
32 21.04 α-蛇床烯(α-selinene) 204 3.857
33 21.15 α-紫穗槐烯(α-muurolene) 204 0.754
34 21.31 α-榄香烯(α-elemene) 204 0.362
35 21.53 γ-荜澄茄烯(γ-cadinene) 204 0.943
36 21.61 二氢 -β -沉香呋喃(dihydro -β -agaro fu-
ran) 222 0.320
37 21.71 δ-荜澄茄烯(δ-cadinene) 204 3.341
38 21.92 荜澄茄-1 , 4-二烯(cadina-1 , 4-diene) 204 0.146
39 22.18 α-白菖(α-calaco rene) 200 0.371
40 22.34 榄香醇(elemol) 222 4.694
41 22.52 吉马烯-(germacrene-B) 204 0.636
42 23.17 石竹烯氧化物(caryophy llene oxide) 220 7.349
43 23.53 绿花醇(vi ridiflorol) 222 0.679
44 23.99 1-丙基-2 , 4 , 5-三甲氧基苯烯(1-pro-peny l-2 , 4 , 5-trimethoxybenzene) 208 0.794
45 24.26 γ-桉叶油醇(γ-eudesmol) 222 4.271
46 24.42 苍术醇(hinesol) 222 0.923
47 24.50 香榧醇(torreyol) 222 2.468
48 24.72 β-桉叶油醇(β-eudesmol) 222 14.484
49 24.78 α-桉叶油醇(α-eudesmol) 222 7.237
50 25.39 3 , 8-Dimethyl-5-(1-methy lethy lidene)-
1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 ,8-Octahydroazulene-6-one 218 1.005
51 31.05 十六烷酸(n-hexadecano ic) 256 1.174
52 34.24 (Z , Z)-9 ,12-十八二烯酸(9 , 12-oc tadec-adienoic acid(Z ,Z) 280 0.019
　　定性分析:通过HP MSD化学工作站检索 Nist98 标准质谱图库和WILEY275 质谱图库 , 同时结合有关质谱图文献解析 ,确认买麻藤挥发性物质的化学成分。定量分析:并通过 HP MSD 化学工作站数据处理系统 , 按峰面积归一化法进行计算 , 求出各化学成分的峰面积相对百分含量。
3　结果　　买麻藤化学成分及各化学成分的峰面积相对百分含量见表 1、图 1。
4　讨论在买麻藤药材挥发性成分的研究中 , 检出的 52 个化合物中含有萜类 、酯类 、醇类及少量的酸类化合物。含量最高的物质为
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β-桉叶油醇 14.484%, 其次为α-蒎烯 9.281%, 石竹烯氧化物
7.349%,α-桉叶油醇 7.237%, 橄香醇 4.694%,γ-桉叶油醇
4.271%,α-蛇床烯 3.857%, 蒿脑 3.799%, δ-荜澄茄烯
3.341%,β-石竹烯 3.234%, 香榧醇 2.468%, 香榧醇 2.468%,β-蒎烯 1.994%, L-芳樟醇 1.537%, β-榄香烯 1.430%, 莰烯
1.428%,β -水芹烯 1.428%, 十六烷酸 1.174%, β -蛇床烯
1.061%, 3 , 8-Dimethyl-5-(1-methy lethylidene)- 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,
6 , 7 , 8-Octahydroazulene-6-one 1.005%等。作者首次对买麻藤挥发性成分进行研究 ,虽分离出 83 个组分 , 但只鉴定了 52个成分 ,其余的化学成分有待于进一步研究。参考文献:[ 1] 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草[M] .上海:上海科学技术出版社 , 1999 ,2.358-360.[ 2] 江苏新医学院.中药大词典(上册)[ M] .上海:上海科学技术出版社 , 1986.990.[ 3] 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编(上册)[M] .北京:人民卫生出版社 , 1975.90-91.
收稿日期:2002-09-05;修回日期:2002-11-29作者简介:段启香(1954-),女 ,实验师 ,从事植物解剖学教研工作。
漂白透明法观察荠菜胚胎发育段启香 ,张雅新 ,白琦(四川农业大学基础部 ,四川 雅安 625014)摘要:采用漂白透明法观察荠菜胚珠在子房内的立体形态结构 、胚在胚囊内的发育过程及胚珠在胎座上的分化过程 ,不仅效果好 , 并且制作方法简单 , 易掌握 , 取材方便 , 不受季节限
制。关键词:荠菜胚胎;发育过程;漂白透明法中图分类号:Q949.748.3　　文献标识码:A　　文章编号:1004-
311X(2003)01-0020-01　　荠菜是观察植物胚胎发育的经典材料[1] 。目前观察荠菜
胚胎发育的方法主要有石蜡切片法[ 2] 和整体挤压法[ 3] , 本实验采用漂白透明法 , 用十字花科荠属中的荠菜(Capsella bursa -
pastoris(L.)Medic)[4] 和碎米荠属中的弯曲碎米荠(Cardamine
flexuosa With)[5]为试材 ,与石蜡切片法和整体挤压法做对比。
图 1　示球形胚　　　　　　　　　图 2　示心形胚
图 3　示心形胚　　　　　　　　　图 4　示成熟胚完整胚珠的结构:1.胚;2.珠孔;　　1.胚根;2.胚轴;3.子叶;
3.珠柄;4.胎座;5.合点;6珠被;7.胚乳　　　　　　4.胚芽荠菜胚胎发育图片
1　材料与方法
1.1　材料:生物显微镜 、20%H2O2 、二甲苯 、各种浓度酒精 、加拿大树胶 、不同发育时期的荠菜 、碎米荠果实 ,均来自本地 。
1.2　试剂:FAA 固定液[ 5] :50%酒精 90ml , 冰醋酸 5ml , 甲醛
5ml。 0.5%番红染液[ 2] :70%酒精 100ml ,番红 0.5g。
1.3　将不同发育时期的荠菜 、碎米荠果实放入 FAA 固定液中固定4-24h , 用清水冲洗数次除去材料中的固定液。倒入 5%
NaOH , 放在 35℃恒温箱中处理 30min后 , 用清水冲洗数次。
1.4　倒入 20%H2O2 ,将材料放入 35℃的恒温箱中 , 处理时间根据材料大小而定 , 至果皮呈白色为止。 用清水冲洗数次 , 用
0.5%番红染液 ,染色 10-30min , 用清水除去多余染料。将果皮去掉 , 制成水装片 , 放在显微镜上用低倍镜观看。如需要长期保存 ,果实必须通过 30%、50%、75%、85%、95%和 100%的梯度酒精脱水 ,经二甲苯透明 , 去掉果皮 , 用加拿大树胶封藏制成永久制片。制片时 ,染色时间需延长 , 脱水 、透明时间视材料大小而定。
2　观察结果
2.1　观察到荠菜胚珠呈透明状 ,椭圆形的倒生胚珠 , 胚位于胚珠内的珠孔端 ,胚乳 、珠柄 、内外珠被 、珠孔 、合点等位置清晰可见。荠菜胚的发育过程可为原胚阶段※分化胚阶段※成熟胚
阶段[ 5] 。果柄+果实长度在 1-1.5cm 之间为原胚阶段 , 可看见原胚呈球形 ,胚柄和基细胞也能看到 , 胚乳细胞丰富位于胚的周围如(图 1)。果柄+果实长度在1.51-1.62cm之间为分化胚阶段 ,胚开始出现器官的分化 , 在球形胚两侧细胞分裂快 , 形成子叶原基。观察到胚呈心形状 , 称为心形胚 , 胚乳细胞逐渐被胚吸收(见图 2、图 3)。果柄+果实长度在 1.63-1.72cm 之间为成熟胚阶段 ,可观察到一个完整胚的结构胚轴 、胚根 、子叶 、胚芽。子叶延伸到合点端开始弯曲向珠柄端伸长 , 胚呈弯曲形 ,胚乳细胞完全消失(见图 4)。在成熟胚中 ,子叶细胞含有大量营养物质 ,因而观察到子叶颜色效深。
2.2　从胚珠在胎座上的排列情况可看出 , 在同一果实中胚珠的分化顺序也不一样 ,首先是中部的胚珠先分化 ,其次是上部 , 最后是下部。因此在同一个果实中可以看见胚发育的各个时期。
2.3　用同样的方法观察不同时期的碎米荠果实 , 胚珠的结构和胚着生的位置以及胚的发育过程与荠菜相同。
3　讨论采用传统的石蜡切片法 , 制作时间长 , 步骤繁琐。胚珠在胎座上的排列方向不同 ,很难将胚珠纵切面切正。要观察 2-3个切面 ,才能看清楚一个珠胚的完整结构和胚的发育过程。 整体是压法 ,只能观察到胚的发育过程 , 看不到胚在胚珠内的着生位置和胚珠在胎座上的分化过程 , 并且要求材料新鲜 , 受季节限制。本方法与前两种方法比较具有如下优点:①观察到胚珠呈椭圆形透明状 , 立体感强 , 形态结构完整。 ②在同一观察面上能清晰看到胚在胚珠内的着生位置和胚胎的发育过程 , 以及胚珠在胎座上的分化过程 , 节省观察时间。 ③制作简单 , 容易掌握 ,不需要复杂的步骤。材料广泛易得不受季节限制。 对保存多年的材料采用这种方法处理 , 观察效果相同。 这种方法适用于植物实验教学 ,为组织培养 、作物育种 、胚胎学等提供简便易行的研究方法。参考文献:[ 1] 胡适宜.被子植物胚胎学[ M] .北京:人民教育出版社 , 1983.1179-
1181.[ 2] 曾小鲁.实用生物学制片技术[M] .北京:高等教育出版社 , 1992.245-246 , 59-60.[ 3]周仪.植物形态解剖实验[ M ] .北京:北京师范大学出版社 ,
1985.111 , 11-20.[ 4] 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴(第二册)[M] .北京:科学出版社 , 1985.42, 53.[ 5] 郑国钅昌.生物显微技术[M].北京:人民教育出版社 , 1979.28.[ 6] 王英典 ,刘宁.植物生物学实验指导[M] .北京:高等教育出版社 ,
2001.35-36.
收稿日期:2002-12-04;修回日期:2002-12-21作者简介:陈丽娟(1961-),女 ,学士 ,高工,研究方向:微生物制药。
枯草杆菌产弹性酶及提纯工艺研究
陈丽娟 ,刘宇峰 ,夏海华 ,曲晓军 ,于冲 ,王金英 ,孙建华
(黑龙江省科学院应用微生物研究所 ,黑龙江 哈尔滨 150010)
摘要:对枯草杆菌产酶弹性蛋白酶和酶提纯生产工艺进行了系统研究 ,得到了含弹性蛋白酶活力为 3 万 u/ g的纯酶粉。中图分类号:Q814.1　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2003)01-0020-02
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　菌种:枯草芽孢杆菌(B.Subtilis HW236-5、HW245-1)。
1.1.2　试剂:弹性蛋白(Elastin , E-1625), Sigma 公司产品;刚果红—弹性蛋白(Elastin-Congo Red):中国药品生物制品检定所产品;DEAE—纤维素(CD32):Whatman 公司产品;Sephadex G-
75:Phamacia产品;标准低分子蛋白:Sigma公司产品。
1.2　方法
1.2.1　弹性蛋白酶活力测定方法:参照中华人民共和国卫生部药品标准二部六册 122-124。表 1　不同氮源的产酶试验
氮源 起始 pH 终止 pH 生物量(OD600×20) 酶产量(u ml)干酪素 6.0 5.9 0.65 100
蛋白胨 6.0 6.0 0.64 55
牛肉膏 6.0 6.4 0.40 49
酵母粉 6.0 6.0 0.60 48黄豆饼粉 6.0 5.8 0.50 50
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