全 文 ：第 27卷 ,第 1期 光　谱　实　验　室 Vol . 2 7 , No . 1
2 0 1 0年 1月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory January , 2 0 1 0
响应曲面法提取水松总黄酮的工艺研究①
① 重庆三峡学院青年基金 ( 2007-sxxyqn-01)
② 联系人 ,电话: ( 023) 58102261; E-mail: cqsxx ymx l@ 163. com
作者简介:牟新利 ( 1979— ) ,男 (土家族 ) ,湖北省利川市人 ,硕士 ,讲师 ,主要研究方向为制药工艺及水环境科学。
收稿日期: 2009-06-10;接受日期: 2009-07-28
牟新利②　吴汉夔a　祁俊生　程 聪　张 丽　朱文彬
(重庆三峡学院化学与环境工程学院　重庆市万州区沙龙路 780号　 404000)
a(南京大学医药生物技术国家重点实验室　南京市　 210093)
摘　要　采用响应曲面法 ,优化了提取水松总黄酮的提取工艺条件为:微波时间 3. 8min,乙醇浓度
69% ,固液比 1∶ 31,在此条件下 ,水松总黄酮的产率为 1. 88%。
关键词　水松 ;提取 ;响应曲面法 ;总黄酮 ;微波
中图分类号: O657. 32　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1004-8138( 2010) 01-0165-04
1　前言
水松 [Glyptostrobus pensil is ( Staunt. ) Koch ] ,产于我国广东、广西、福建、江西、四川、云南等省
区 [1 ] ,其叶在民间入药用于治疗风湿性关节炎、皮炎和高血压等疾病 [2 ] ,已有研究证实水松中含有
较为丰富的黄酮 [3, 4 ]。斯缨等 [5 ]通过索氏提取法提取水松总黄酮 ,得到 1. 792%的产率 ,然而其提取
的最优条件并未探讨。 G. E. P. Box在 50年代完善的响应曲面方法已经成为降低开发成本 ,优化加
工条件 ,提高产品质量 ,解决生产过程中的实际问题的一种有效方法 [ 6] ,因此我们通过响应曲面法
提取水松叶中总黄酮 ,并以微波作为辅助 ,为水松的综合开发利用提供依据。
2　实验部分
2. 1　试剂与仪器
供试验用的水松叶采自重庆市万州区五桥的三峡珍稀植物园 ,经过重庆三峡学院生物学教授
祁俊生博士鉴定为水松 [Glyptostrobus pensilis ( Staunt. ) Koch ]。将采得的水松叶摊开于纸板上 ,干燥
后粉碎待备用。所用药品芦丁 [美国 Sigma公司 ,批号 113K0667,纯度≥ 94% ( HPLC) ] ,其他均为
分析纯。实验用水为上海摩勒科学仪器有限公司 MOLCELLL820A纯水器制备的纯净水。
722型 Spect rum分光光度计 (上海光谱仪器有限公司 ) ;格兰仕 WP700型微波炉 (格兰仕微波
炉电器有限公司 )。
2. 2　校准曲线的制作 [6 ]
准确称取经 120℃干燥至恒重的芦丁对照品 50mg,置于 25mL容量瓶中 ,加甲醇适量 ,在水浴
上微热使溶解 ,放冷 ,加甲醇至刻度 ,摇匀。准确量取 10mL,置于 100mL容量瓶中 ,加水至刻度 ,即
得 0. 2mg /mL芦丁对照品溶液。 准确量取 1, 2, 3, 4, 5, 6mL,分别置于 25mL容量瓶中 ,各加水至
6. 0mL,加 5%亚硝酸钠溶液 1mL,混匀 ,放置 6min,加 10%硝酸铝溶液 1mL,摇匀 ,放置 6min,加
氢氧化钠溶液 10mL,再加水至刻度 ,摇匀 ,放置 15min,以相应的试剂为空白 ,在 500nm波长下测
定其吸光度 ,得回归方程:
C ( g /L)= 0. 086A- 0. 0025　相关系数 r= 0. 9955。
2. 3　水松叶黄酮的提取
准确称取水松叶 1. 0g置于烧瓶中 ,按要求加入一定量的提取剂 ,在一定温度下微波提取一定
时间 ,微波功率为 600W。过滤液用提取剂定容至 100mL容量瓶中作为待测液。取待测液按“ 2. 2”
进行操作 ,测定其黄酮产率 ,并按下式计算水松叶黄酮产率。
水松叶黄酮产率= (提取液浓度×体积×稀释倍数 ) /样品质量× 100%。
3　结果与讨论
3. 1　响应曲面分析因素水平的选取
根据 Box-Behnken的试验设计原理 ,选取乙醇浓度 ( A)、微波时间 (B )和固液比 (C ) 3个影响因
素 ,并作如下变换: xi= ( Zi - Z0 ) /Z ,见表 1。式中: xi——自变量的编码值 ; Zi—— 自变量的真实值 ;
Z0——试验中心点处自变量的真实值 ; Z——自变量的变化步长。
表 1　水松微波提取试验的因素与水平
因素 水平
- 1 0 1
乙醇浓度 ( A ) (% ) 0 50 100
微波时间 (B ) (min ) 1 2 3
固液比 (C ) 10 20 30
3. 2　响应曲面分析设计方案与试验结果
以水松总黄酮提取率为响应值 ( R1 ) ,根据 Design-Expert 7. 0软件 ,共 15个试验点 ,其中 12个
为析因点 , 3个为零点 ,零点试验进行了 3次 ,以估计误差。 试验设计与试验结果见表 2。
表 2　水松微波提取试验设计与试验结果
标准次序 运行次序 A:乙醇浓度
(% )
B:微波时间
( min)
C:固液比 R1水松黄酮产率
(% )
1 8 - 1. 00 - 1. 00 0. 00 1. 25
2 14 1. 00 - 1. 00 0. 00 1. 19
3 11 - 1. 00 1. 00 0. 00 1. 30
4 5 1. 00 1. 00 0. 00 1. 79
5 10 - 1. 00 0. 00 - 1. 00 1. 35
6 1 1. 00 0. 00 - 1. 00 1. 70
7 6 - 1. 00 0. 00 1. 00 1. 42
8 9 1. 00 0. 00 1. 00 1. 71
9 7 0. 00 - 1. 00 - 1. 00 1. 55
10 13 0. 00 1. 00 - 1. 00 1. 76
11 2 0. 00 - 1. 00 1. 00 1. 68
12 12 0. 00 1. 00 1. 00 1. 72
13 3 0. 00 0. 00 0. 00 1. 85
14 15 0. 00 0. 00 0. 00 1. 83
15 4 0. 00 0. 00 0. 00 1. 84
3. 3　模型的建立及其显著性检验
利用 Design-Expert软件对表 2采用回归分析中的向后法 ( Backward)来寻求回归模型的最简
方程 ,所有显著性概率小于 0. 05的项都将被剔除。得到由编码因素组成的最后方程为 R1= + 1. 84
166 光谱实验室 第 27卷
+ 0. 171215× A+ 0. 075×B+ 0. 02125×C+ 0. 0625× A×B - 0. 0425× B× C- 0. 2575× A2 -
0. 125×B2- 0. 0375×C2 ,对该模型进行显著性检验 ,结果见表 3。
表 3　回归模型方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值概率 > F
回归模型 0. 59 8 0. 074 131. 64 < 0. 0001
A-乙醇浓度 0. 23 1 0. 23 417. 09 < 0. 0001
B -微波时间 0. 045 1 0. 045 80. 00 0. 0001
C-固液比 3. 613× 10- 3 1 3. 613× 10- 3 6. 42 0. 0444
AB 0. 016 1 0. 016 27. 78 0. 0019
BC 7. 225× 10- 3 1 7. 225× 10- 3 12. 84 0. 0116
A2 0. 24 1 0. 24 435. 24 < 0. 0001
B2 0. 058 1 0. 058 102. 56 < 0. 0001
C2 5. 192× 10- 3 1 5. 192× 10- 3 9. 23 0. 0229
残差 3. 375× 10- 3 6 5. 625× 10- 4 4
失拟 3. 175× 10- 3 4 7. 937× 10- 4 7. 94 0. 115
纯误差 2. 000× 10- 4 2 1. 000× 10- 4 4
总误差 0. 60 14
　　由表 3知 ,由方差分析知道该模型是有意义的。 且该模型的决定系数为 0. 9943。
3. 4　水松微波提取工艺的响应曲面分析与优化
当乙醇编码固定在 0时 ,微波提取时间和固液比对黄酮产率的影响见图 1。 由图 1可知 ,在微
波提取时间的编码在 - 1到 0范围内 ,黄酮产率不断增加。 之后编码增大在 0到 1范围内 ,黄酮产
率有下降的趋势。 而固液比编码从 - 1到 1之间 ,黄酮产率一直呈现增加的趋势。
当固液比编码固定在 0时 ,微波提取时间和乙醇浓度对黄酮产率的影响见图 2。由图 2可知 ,
在微波提取时间和乙醇浓度的编码在 - 1到 0范围内 ,黄酮产率不断增加。之后微波提取时间和乙
醇浓度的编码增大在 0到 1范围内 ,黄酮产率有下降的趋势。
图 1　固液比、微波时间及其交互作用
对黄酮产率影响的响应曲面
图 2　乙醇浓度、微波时间及其交互作用
对黄酮产率影响的响应曲面图
为进一步确定最佳点 ,对模型进行验算 [7 ]。 先代入西尔维斯特不等式直接判别 ,响应曲面方程
有极大值。对其两边关于求一阶偏导数 ,并令之为 0,得三元一次方程组:
0. 171215- 0. 515A+ 0. 0625B= 0
167第 1期 牟新利等:响应曲面法提取水松总黄酮的工艺研究
0. 075+ 0. 0625A- 0. 25B- 0. 0425C= 0
0. 02125- 0. 0425B- 0. 075C= 0
解之得 A= 0. 3791 ,B= 0. 3835,C= 0. 0660。代入模型方程求 R1最大值 , R1max= 1. 8875% ,就
是总黄酮最大提取率为 1. 8875%。再根据数据转换得到此时实际因素的参数:乙醇浓度= 69% ,微
波时间= 3. 8min,固液比= 1∶ 31。
3. 5　验证试验
为检验响应曲面法所得结果的可靠性 ,采用上述优化提取条件微调 (微波时间 3. 8min,乙醇浓
度 69% ,固液比 1∶ 31)进行水松微波提取 ,在此条件下重复测定 3次 ,由表 4可知 ,黄酮产率平均
值为 1. 88% ,其 RSD为 0. 81% .因此 ,基于响应曲面法所得的优化提取工艺参数准确可靠 ,具有实
用价值。
表 4　验证试验结果
试验号 黄酮含量 (% ) 平均黄酮含量 (% ) RSD(% )
1 1. 86
2 1. 89 1. 88 0. 81
3 1. 88
4　结论
通过 Box-Behnken设计建立了水松叶中黄酮提取率与微波时间 ,乙醇浓度 ,液固比关系的回归
模型 ,经检验证明该模型是合理可靠的 ,能够较好地预测水松的提取产率。得到的优化工艺参数为:
微波时间 3. 8min,乙醇浓度 69% ,固液比 1∶ 31,水松的提取率为 1. 88% 。因此 ,利用响应面分析方
法对水松总黄酮提取工艺进行优化 ,能有效减少工艺操作的盲目性 ,从而为进一步的开发研究奠定
基础。
参考文献
[1 ]中国科学院植物研究所主编 .中国高等植物图鉴 [M ].北京:科学出版社 , 1983.
[2 ]江苏新医学院 .中药大辞典 [M ] .上海:上海科学技术出版社 , 1986.
[3 ]王明雷 .番荔枝科植物囊瓣木和中国特有植物水松化学成分及生物活性研究 [D] .北京:中国协和医科大学 , 2000.
[4 ]向瑛 ,郑庆安 .水松叶黄酮化合物的研究 [ J].中草药 , 2001, 32( 7): 588— 589.
[5 ]何桢 ,张生虎 ,刘子先 .双响应曲面方法在改进产品设计中的应用研究 [ J] .系统工程理论与实践 , 2001, 15( 9): 15— 16.
[6 ]药典委员会 .中华人民共和国药典 (一部 ) [M ].北京:化学工业出版社 , 2005.
[7 ]赵选民 .试验设计方法 [M ] .北京:科学出版社 , 2006.
Study on Extraction Technology of Flavones inGlyptost robus Pensilis
by Response Surface Methodology
MOU Xin-Li　WU Han-Kuia　 QI Jun-Sheng　 CHENG Cong　 ZHANG Li　 ZHU Wen-Bin
( Depar tment of Chemical and Environmental Eng ineering ,Chongqing Three Gorges College,Chongqing 404000,P . R. China )
a( State Key Laborator y of Pharmaceut ical B iotechnolog y ,N an jing University ,N an jing 210093, P. R.China)
Abstract　 The ext raction condi tions of total flavones in Glyptostrobus pensilis by response surface
methodology w ere studied. The results showed that the optimized ext racting conditions of total
f lavones w ere 69% ethanol solution for 3. 8 minutes by microw ave, wi th the solid-liquid ratio 1∶ 31.
And the yield of total flav ones in Glyptostrobus pensil is was 1. 88% .
Key words　 Glyptostrobus Pensilis; Ex t raction; Response Surface M ethodolog y; Total Flav ones;
Microw ave
168 光谱实验室 第 27卷