全 文 ：北方园艺 2010(19):157 ～ 159 ·生物技术 ·
第一作者简介:刘宝光(1972-), 男, 吉林省吉林市人, 硕士, 工程
师,现从事林木遗传育种研究工作。 E-mail:liubaoguang2005@ya-
hoo.com.cn。
收稿日期:2010-06-17
加拿大铁杉不定芽诱导及植株再生技术研究
刘 宝光1 , 田 春雨2 , 徐广 云3
(1.北华大学林学院采育林创新中心 ,吉林吉林 132013;2.吉林市林业局林业总站,吉林 吉林 132013;3.永吉县金家林业工作站 ,吉林永吉 132217)
　　摘　要:以加拿大铁杉成熟的合子胚为外植体 ,进行了组织培养研究。成功地建立了加拿大
铁杉的无性繁殖体系。结果表明:适宜愈伤组织诱导的培养基为 ,改良 P6 +BA 2.5 mg/ L+KT
1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/ L+2 ,4-D 1.0 mg/L ,愈伤组织诱导率达 91.5%;适宜不定芽分化的培
养基为改良 P6 +BA 2.8 mg/L+2 ,4-D 0.125 mg/L ,不定芽分化率达4.93个/g;适宜不定芽伸长
的培养基为不加任何激素的改良 P6 培养基 ,不定芽伸率达34.5%;适宜生根诱导的培养基为:改
良1/2 P6+NAA 0.05 mg/L+IBA 0.05mg/ L ,生根率达 20.5%;适宜练苗的基质为珍珠岩 ,成活
率达 28.4%。
关键词:加拿大铁杉;组织培养;诱导
中图分类号:S 791.17　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2010)19-0157-03
　　加拿大铁杉属松科铁杉属 ,又名铁云杉 ,高大乔木 ,
树可达 30 m ,是一种常绿针叶树种 ,在北美分布广泛 ,在
加拿大南至美国佐治亚州 ,西至美国威斯康辛州地区均
有分布 ,是宾夕法尼亚州的州树 ,具有重要经济价值和
生态价值的树种[ 1] 。木材被广泛应用于家具生产和建
筑业 ,其树皮可以用来鞣制皮革。加拿大铁杉具有金字
塔形树冠 ,枝条平展 ,树形优美 ,常被景观绿化所采用。
国内应用的加拿大铁杉其种子 、种苗都需要进口 ,价格
比较贵。采用组织培养方法可以扩大苗木供应量 ,降低
苗木价格 ,快速满足生产实际的需要 ,还可缩短引种驯
化周期 ,提高苗木品质 ,加快优良品系的推广应用。因
此 ,开展加拿大铁杉的组织培养研究 ,可使这一良优良
树种尽快实现其潜在价值。
1　材料与方法
1.1　试验材料
外植体来源于宾夕法尼亚州种子。
1.2　试验方法
1.2.1　外植体处理　种子先在流水下冲洗30 min ,然后
在超净工作台上用 75%酒精消毒 30 s ,用无菌水冲洗 1
次 ,放入 1%次氯酸钠溶液消毒 10 min ,无菌水冲洗 5
次 ,然后摆放在垫有纱布的无菌培养皿中 ,加入适量的
无菌水 ,用封口膜封好置培养箱内培养。预萌发 5 d后
在超净台内打开封口膜 ,剥去种皮 ,用相同的消毒方法
再消毒 1次 ,待用。
1.2.2　试验设计　愈伤组织诱导试验:对 MS 、SH 和改
良 P6[ 2] 基本培养基和附加激素BA 、KT 、NAA 和 2 ,4-D
进行五因素混合水平的正交设计(表 1),试验中每个处
理接种 20瓶 ,每瓶接种 2 ～ 3个外植体 ,种胚水平放置 ,
15 d后调查统计诱导率。不定芽诱导试验:根据愈伤组
织诱导结果 ,不定芽诱导试验以改良 P6 培养基为基本
培养基 ,对附加激素 BA 、KT 、NAA和2 ,4-D作四因素十
三水平的均匀设计 ,设定极值(表 2)后利用均匀试验设
　　表 1　　　愈伤组织诱导正交设计
水平 因素/ mg·L-1培养基 BA KT NAA 2 ,4-D
1 MS 0.5 0.5 0.1 0.1
2 SH 1.0 1.0 0.5 0.5
3 改良 P6 2.0 2.0 1.0 1.0
4 2.5 2.5 1.5 1.5
　　表 2　　　　不定芽诱导均匀设计
取值 因素/mg·L-1
BA KT NAA 2 ,4-D
低值 0.2 0.2 0.1 0.1
高值 3.5 3.5 1.5 1.5
计软件进行试验设计 ,每处理接种 10瓶 ,愈伤组织块半
陷入培养基中 ,15 d 后调查统计诱导情况。不定芽伸长
试验:去掉褐化的坏死组织 ,将具有芽点 、生命力旺盛的
愈伤组织转接到不定芽伸长培养基上 ,对植物激素种类
和浓度进行筛选。采用 3次重复的随机区组设计 ,20 d
后对不定芽伸长率进行调查统计。生根试验:生根以改
良 1/2 P6为基本培养基 ,对 NAA 、IBA浓度进行筛选。
采用 3次重复的随机区组设计 ,10 d后对生根率 、生根
数和根长进行调查统计。移栽试验:以蛭石 、珍珠岩和
1/2珍珠岩+1/2蛭石为练苗基质 ,采用 3次重复的随
机区组设计 ,25 d后通过调查苗木成活率对基质进行筛
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选。上述培养基中均附加 2%蔗糖和 0.56%琼脂 ,用
NaOH和 HCl调节pH 5.8。培养温度(24±2)℃,光照培
养 ,光暗周期16 h/8h ,光强度为46～ 48μmol ·m-2·s-1。
2　结果与分析
2.1　不同培养基和生长调节物质对愈伤组织诱导影响
剥离出的种胚接种到愈伤组织诱导培养基上 ,3 d
后子叶开始膨大 ,并逐渐变绿 ,7 d后子叶表面开裂 ,裂
口处有颗状的愈伤组织生成 ,颜色也变为深绿色 ,质地
松软 ,此后愈伤组织生长迅速 ,20 d后愈伤组织变得致
密 ,表面变得光滑。不同的培养基(F=55 602.972;S=
0.003)、BA(F=4 556.093;S=0.011)、KT(F=937.426;
S=0.024)、NAA(F=520.537;S=0.032)和 2 ,4-D(F=7
699.315;S=0.008)对愈伤组织诱导的影响均达到了显
著水平 ,对愈伤组织诱导的影响:基本培养基>BA>
2 ,4-D>KT >NAA(表 3),通过对基本培养基 、BA 、KT 、
NAA和 2 ,4-D对愈伤组织诱导影响的综合分析可知 ,
以改良 P6为基本培养基 ,当BA浓度为 2.5 mg/L、KT 浓
度为 1.0 mg/ L、NAA浓度为0.5mg/L 和2 ,4-D浓度为
1.0 mg/L时适宜加拿大铁杉的愈伤组织诱导。试验证
明其组合的愈伤组织诱导率可达91.5%,高于其它的试
验组合诱导率 ,并且愈伤组织的生长增殖速度也高于其
它试验组合 ,因此可以确定该试验组合是适宜于加拿大
铁杉愈伤组织诱导的。
　　表 3　　愈伤组织诱导 L16(3×44)试验结果
处理 因素/ mg·L-1培养基 BA KT NAA 2 ,4-D
诱导率
/ %
1 2(SH) 2(1.0) 2(1.0) 2(0.5) 1(0.1) 38.5
2 2(SH) 4(2.5) 3(2.0) 1(0.1) 3(1.0) 46.7
3 1(MS) 2(1.0) 3(2.0) 4(1.5) 2(0.5) 28.4
4 3(P6) 3(2.0) 3(2.0) 3(1.0) 1(0.1) 45.5
5 1(MS) 1(0.5) 1(0.5) 1(0.1) 1(0.1) 17.9
6 1(MS) 4(2.5) 2(1.0) 3(1.0) 4(1.5) 37.6
7 3(P6) 1(0.5) 2(1.0) 4(1.5) 3(1.0) 83.4
8 1(MS) 3(2.0) 4(2.5) 2(0.5) 3(1.0) 30.5
9 1(MS) 3(2.0) 2(1.0) 1(0.1) 2(0.5) 22.7
10 2(SH) 3(2.0) 1(0.5) 4(1.5) 4(1.5) 30.4
11 3(P6) 4(2.5) 1(0.5) 2(0.5) 2(0.5) 71.9
12 2(SH) 1(0.5) 4(2.5) 3(1.0) 2(0.5) 47.5
13 1(MS) 1(0.5) 3(2.0) 2(0.5) 4(1.5) 39.4
14 3(P6) 2(1.0) 4(2.5) 1(0.1) 4(1.5) 86.9
15 1(MS) 4(2.5) 4(2.5) 4(1.5) 1(0.1) 15.4
16 1(MS) 2(1.0) 1(0.5) 3(1.0) 3(1.0) 37.5
y1 28.7 47.1 39.4 43.5 41.0
y2 40.8 47.8 45.6 45.1 42.7
y3 71.9 32.3 40.0 42.0 49.5
y4 52.3 45.1 39.4 48.6
极差(R) 43.2 20.0 6.2 5.7 8.5
2.2　不同生长调节物质对不定芽分化诱导的影响
将生长速度减缓的愈伤组织接种到芽分化诱导培
养基上 ,5 d后愈伤组织表面开始出现肉眼可辨的球面
状突起的芽点 ,10 d芽点伸长到0.3 ～ 1.5 cm ,内部隐约
可见 1～ 3轮的叶点 ,这时芽点停止了进一步的生长发
育 ,如果不转接 ,芽点将褐化死亡。生长时观测结果(表
4),对数据采用逐步回归的多元统计分析的方法 ,采用
二次回归模型 y=β0+βχ1 +β2χ2 +β3χ3 +β4χ4 +β11χ21 +
β22χ22 +β33χ23+β44χ24 +β12χ1χ2+β13χ1χ3 +β14χ1χ4 +β23χ2χ3 +
β24χ2χ4 +β34 χ3χ4 +ε来对数据进行匹配 ,引入项以
F(0.10 ,9 ,3)=3.006为临界值 ,经统计分析 ,实际的引
入项=预期项 ,回归方程(F=9.859)回归显著。回归方
程为:y=7.61-8.93x4 +2.831x1 x4 -3.91x24 。根据极
值理论可以确定当χ1 =3.5 , χ4 =0.125时可取得高诱导
率 5.31个/g ,诱导效果均好于其它 13个试验组合。但
试验中当BA的浓度高于3.0mg/ L时不定芽畸形比较多 ,
因此降低使用浓度为2.8 mg/L ,不定芽诱导率在4.93个/g ,
影响不是很大 ,且其试验效果仍好于其它组合。因此加
拿大铁杉不定芽诱导适宜的培养基组合为改良 P6 +BA
2.8 mg/L+2 ,4-D 0.125 mg/L。
表 4　不定芽诱导 U13(134)均匀试验组合及试验结果
处理 因素/mg·L-1
BA KT NAA 2 ,4-D
诱导量
/个· g-1
1 0.20 1.30 1.03 1.27 0.20
2 0.48 2.68 0.45 0.92 0.41
3 0.75 0.20 1.50 0.57 0.23
4 1.03 1.57 0.92 0.22 3.53
5 1.30 2.95 0.33 1.50 0.00
6 1.58 0.48 1.38 1.15 0.57
7 1.85 1.85 0.80 0.80 1.37
8 2.13 3.23 0.22 0.45 2.45
9 2.40 0.75 1.27 0.10 4.52
10 2.68 2.15 0.68 1.38 2.34
11 2.95 3.5 0.10 1.03 0.74
12 3.23 1.03 1.15 0.68 1.21
13 3.50 2.40 0.57 0.33 1.56
　　表 5　　不同激素组合对不定芽伸长的影响
编号 　　　培养基/mg·L-1 伸长率/ %
A1 改良P6 不加激素 34.5±3.7a
A2 改良P6+BA 1.0+2 ,4-D 0.05 12.3±2.1bcd
A3 改良P6+BA 0.05+2 , 4-D 0.05 5.7±1.5cd
A4 改良P6+2 ,4-D 0.05 1.2±0.4d
A5 改良P6+BA 1.0+NAA 0.1 13.5±2.5bc
A6 改良P6+BA 0.05+NAA 0.1 17.9±2.3b
A7 改良P6+NAA 0.1 9.3±1.7cd
2.3 　不同激素浓度对不定芽伸长的影响
不定芽在伸长培养基上生长缓慢 ,20 d苗高仅为
0.5～ 1.0 cm ,苗颜色为浅绿色 ,由表5可知 ,培养基对不
定芽伸长率(F=29.360;S=0.000)的影响达到了显著
水平 ,通过 LSD多重比较可知 A1培养基有益于不定芽
的伸长 ,伸长率可达 34.5%,NAA促进不定芽伸长的效
果要好于 2 ,4-D ,BA的适量应用也有利于不定芽的伸
长 ,但植物激素的应用常使不定芽的基部形成愈伤组织
或玻璃化 ,不利于苗的生根生长发育。
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2.4 　不同培养基生根效果比较
将生长健壮的 1.5 ～ 2.5 cm 小苗转接到生根培养
基上 ,10 d开始统计生根状况。由表 6可知 ,培养基对
生根率(F=42.778;S =0.000)和生根条数(F=3.353;
S=0.026)的影响均达到了显著水平 ,对根长(F =
0.564;S=0.773)的影响不显著 ,通过 LSD多重比较可
知 ,A2 、A3培养基益于提高苗木的生根率 ,其诱导的生
根率分别为 22.4%和 20.5%。A3有益于提高苗木的生
根条数 ,生根条数可达 5.3条。虽然 A3培养基在生根
率和根长生长方面不是最好的 ,根长生长为 1.03 cm 。
但综合比较看 A3培养基是适宜生根诱导的。由表 6还
可看出 ,NAA有益于生根条数 , IBA有益于提高生根率
和根长的生长。
　　表 6　　不同激素组合对生根效果的影响
编号 培养基/mg·L-1 生根率/ % 生根条数 根长/cm
A1 1/2P6+NAA 0.05 15.5±1.2bc 3.5±1.2ab 1.01±0.31
A2 1/2P6+IBA 0.05 22.4±2.3a 2.4±1.1ab 0.83±0.22
A3 1/2P6+NAA 0.05+IBA 0.05 20.5±2.1a 5.3±1.5a 1.03±0.13
A4 1/ 2P6+NAA 0.1 10.3±1.1d 5.1±0.9ab 0.87±0.14
A5 1/2P6+IBA 0.1 17.2±1.5b 4.2±1.5ab 0.85±0.21
A6 1/ 2P6+NAA 0.1+IBA 0.05 8.7±0.6d 4.7±0.8ab 1.05±0.15
A7 1/ 2P6+NAA 0.05+IBA 0.1 13.3±1.2c 3.5±0.5ab 0.95±0.10
A8 1/2P6+NAA 0.1+IBA 0.1 5.5±0.9e 1.8±1.1b 1.00±0.17
2.5　不同基质对移栽效果的影响
将温室消毒后 ,第 1天将生根苗封口膜揭开一半 ,
第2天全部揭开 ,并适时用喷雾器喷淋叶面 ,间隔时间
逐渐加长 ,练苗3 d后 ,取出并洗净根部的培养基。分别
移植到盛有蛭石 、珍珠岩和 1/2珍珠岩+1/2蛭石基质
的育苗盘中 ,基质用 0.5‰的 K2MnO4 溶液淋透后再用
清水冲淋3遍 ,喷1/4MS营养液。将育苗盘移入在温室
内搭建的小拱棚内 ,小拱棚距育苗盘10～ 15 cm高 ,保持
湿度 80%,适当遮荫 ,5 d后逐步撤去拱棚膜 , 8 d后取
出 ,15 d移入培养土中 ,常规管理。基质对苗木成活率
(F=19.739;S=0.008)影响达到了显著水下 ,通过 LSD
多重比较可知 B2基质组合效果较好 ,其练苗成活率达
28.4%以上(表 7)。
　　表 7　　　不同基质对练苗成活的影响
编号 基质 成活率/ %
B1 蛭石 17.6±1.5b
B2 珍珠岩 28.4±2.4a
B3 1/2珍珠岩+1/ 2蛭石 21.3±1.7b
3 　小结
加拿大铁杉组织培养过程中 ,适宜愈伤组织诱导的
培养基为:改良 P6 +BA 2.5 mg/ L+KT 1.0 mg/ L+
NAA 0.5 mg/L+2 ,4-D 1.0 mg/L。适宜不定芽分化的
培养基为:改良 P6 +BA 2.8 mg/L+2 ,4-D 0.125 mg/L。
适宜不定芽伸长的培养基为不加任何激素的改良 P6 培
养基。适于生根诱导的培养基为:改良 1/2 P6 +NAA
0.05 mg/L +IBA 0.05 mg/ L。适宜练苗的基质为:
蛭石。
参考文献
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[ 2] 　Pullman G S ,Namjoshi K , Zhang Y.Somatic embryogenesis in loblolly
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Study on Induction of Adventitious Buds and Plantlet
Regeneration of Tsuga canadensis
LIU Bao-guang1 , TIAN Chun-yu2 , XU Guang-yun3
(1.Cutting and Culturing Fo rest Innovation Center of Jilin Province, Fo rest College of Beihua University , Jilin , Jilin 132013;2.Forestry Central
Station of Jilin City Forestry Bureau , Jilin , Jilin 132013;Jinjia Forestry Station of Yongji County Forestry Bureau , Yong ji , Jilin 132217)
Abstract:Using mature zygotic embryos of Tsuga canadensis as explants , the tissue culture was studied.The vegetative
propagation system w as successful established.The results showed that P6 medium supplemented with BA 2.5 mg/ L ,KT
1.0 mg/L ,NAA 0.5 mg/ L and 2 ,4-D 1.0 mg/L was suitable for callus induction and the rate was 91.5%.The improved
P6 medium supplemented with BA 2.8 mg/L , 2 , 4-D 0.125 mg/L was suitable for adventitious bud differentiation
induction and the rate was 4.93/g.The improved P6 medium supplemented without plant hormones was suitable for
adventitious bud elongation induction and the rate w as 34.5%.The improved 1/2 P6 medium supplemented with NAA
0.05 mg/L , IBA 0.05 mg/L was suitable for root induction and the rate was 20.5%.The substrate of perlite was
suitable for practice shoots and the rate was 28.4%.
Keywords:Tsuga canadensis;tissue culture;induction
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